梁偉海 陳志寧 林國偉 劉曉俊

癡復(fù)康方是中醫(yī)腦病學(xué)專家劉茂才教授總結(jié)的治療卒中后認(rèn)知障礙的代表方，被制成廣東省中醫(yī)院院內(nèi)制劑長期用于臨床，前期研究表明癡復(fù)康方能改善患者腦卒中后前瞻性記憶障礙[1]。癡復(fù)康方主要由天麻、法半夏、黃芪、人參、制何首烏等組成，其中天麻平肝熄風(fēng)，法半夏燥濕化痰，二者配伍共奏熄風(fēng)化痰之功。血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能影響血管再生和神經(jīng)元再生，從而對(duì)腦缺血后神經(jīng)保護(hù)發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)癡復(fù)康方拆方，選取方中藥對(duì)天麻、法半夏，研究其對(duì)氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）損傷的影響，探討癡復(fù)康方作用機(jī)制。

1 材 料

1.1 藥材天麻、法半夏（廣州市藥材公司中藥飲片廠，批號(hào)YPA8C0001、YPA8G0002）。

1.2 試劑 ox-LDL（廣州奕元生物技術(shù)公司，批號(hào)YB-002），DMEM 培養(yǎng)基（美國HyClone 公司，批號(hào)SH30809.01B），胎牛血清（美國Gibco 公司，批號(hào)1027-106），胰蛋白酶（武漢博士德生物公司，批號(hào)PYG14190），胰酶消化溶液（美國Biosharp 公司，批號(hào)WH0518），磷酸鹽緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)C0221A），Annexin V-APC/7AAD 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（杭州聯(lián)科生物公司，批號(hào)4224750），碘化丙啶（上海碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)ST512），核糖核酸酶A（美國Sigma 公司，批號(hào)R4875），血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體（美國Proteintech 公司，批號(hào)19003），血管內(nèi)皮生長因子受體-2（Vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）抗體（美國Abcam 公司，批號(hào)5473），高純總RNA 快速提取試劑盒（美國Bioteke 公司，批號(hào)RP1201），預(yù)混液形式的兩步法RT-qPCR 首選試劑（美國Vazyme 公司，批號(hào)R223-01），RT-qPCR 擴(kuò)增預(yù)混合溶液（上海翊圣生物公司，批號(hào)11202ES08），（100-2000bp）-DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)[美國Takara 公司，批號(hào)3427B（Ax2）]。

1.3 儀器 凈化工作臺(tái)（蘇州凈化有限公司，型號(hào)SW-CJ-2F），水套式CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司，型號(hào)CI191C），普通光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司，型號(hào)AE30/31），流式分析儀（洛陽愛森生物有限公司，型號(hào)NovoCyte），熒光定量PCR 儀（杭州博日科技公司，型號(hào)TC-XP），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技公司，型號(hào)Tanon-1600），電泳儀（北京君意電泳設(shè)備公司，型號(hào)JY200C），超微量核算分析儀（杭州奧盛儀器公司，型號(hào)Nano-200）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 無菌條件下取新生兒臍帶，用磷酸鹽緩沖液沖洗靜脈腔內(nèi)血凝塊，往靜脈腔內(nèi)注入0.25%胰酶，消化靜脈內(nèi)皮8min，收集消化液至含1mL 血清的離心管，1000r/min 離心7min，棄上清液，用培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，吹打混勻后置培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）培養(yǎng)，培養(yǎng)24h 換液，細(xì)胞融合90%以上時(shí)用0.05%胰酶消化傳代，取2～5 代用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 藥物制備 天麻50g，加水2000mL 加熱至沸騰，提取1h，用一次性濾紙初濾，濾液濃縮至每1mL相當(dāng)于1g 藥物，0.22μm 的濾膜再過濾，制成天麻水提物，4℃保存?zhèn)溆茫肈MEM 培養(yǎng)基稀釋至5mg/mL。法半夏制備及保存同天麻，稀釋濃度為10mg/mL。

2.3 分組與給藥 實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、模型組、天麻組、法半夏組。在96 孔板中接種HUVECs，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h（37℃，5%CO2），棄上清液，用磷酸鹽緩沖液洗兩次，對(duì)照組加入不含藥物的DMEM 培養(yǎng)基，模型組加入含80μg/mL ox-LDL 的DMEM 培養(yǎng)基，天麻組加入含80μg/mL ox-LDL、5mg/mL 天麻水提物的DMEM 培養(yǎng)基，法半夏組加入含80μg/mL ox-LDL、10mg/mL 法半夏水提物的DMEM 培養(yǎng)基，均培養(yǎng)48h。

2.4 HUVECs 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 取藥物處理完成后的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，1500rpm 離心5min 棄上清，用磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，1500rpm 離心5min 棄上清，根據(jù)Annexin V-APC/7AAD 試劑盒說明書，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為1×105～1×106個(gè)，加入5μL Annexin V-APC 和10μL 7AAD，輕柔渦旋混勻后室溫避光孵育15min，送流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.5 HUVECs 細(xì)胞增殖指數(shù)檢測(cè) 取藥物處理完成后的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，1500rpm離心5min 棄上清，用4℃預(yù)冷磷酸緩沖液洗細(xì)胞兩次，加入4℃預(yù)冷的70%乙醇重懸細(xì)胞，于4℃固定過夜，1500rpm 離心5min，棄上清，加入磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，1500rpm 離心5min 棄上清，加入500μL磷酸緩沖液（含5μg/mL 碘化丙啶，100μg/mL 核糖核酸酶A）4℃避光孵育30min，計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞以上，以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖指數(shù)。細(xì)胞增殖指數(shù)=（S 期細(xì)胞數(shù)＋G2 期細(xì)胞數(shù)）/（G1 期細(xì)胞數(shù)＋S 期細(xì)胞數(shù)＋G2 期細(xì)胞數(shù)）×100%。

2.6 Western blot 檢測(cè)VEGF、VEGFR-2 表達(dá) 提取HUVECs，計(jì)算蛋白量，加上樣緩沖液蛋白變性，95V 凝膠電泳2h，100V 轉(zhuǎn)膜2h，5%胎牛血清白蛋白封閉，4℃孵一抗（VEGF 抗體，VEGFR-2 抗體）12h，室溫孵二抗2h，加曝光液曝光，顯影，Image-Pro Plus 6 軟件分析結(jié)灰度值，分別以VEGF、VEGFR-2 條帶灰度值除以內(nèi)參條帶GAPDH 灰度值表示表達(dá)量。

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）RNA、半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）RNA 表達(dá)量 根據(jù)Trizol 總RNA 提取試劑說明書提取HUVECs 總RNA，測(cè)定濃度和純度，取500ng總RNA 用于cDNA 合成，用Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按說明書操作。引物由廣州博垚生物科技有限公司合成，引物序列如下：Caspase-3（forward）：5'-AGCACCTGGTTACTATTCCTG-3'，Caspase-3（reverse）：5' -ATTCCGTTGCCACCTTCC -3'，Caspase -9（forward）：5'-GGCTGTCTACGGCACAGATGGA-3'，Caspase-9（reverse）：5'-CTGGCTCGGGGTTACTGCCAG-3'，GAPDH（forward）：5'-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3'，GAPDH（reverse）：5'-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3'。合成的cDNA 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，用Takara 實(shí)時(shí)熒光PCR 試劑盒，按照說明書操作。步驟一預(yù)變性：94℃60s，步驟二擴(kuò)增：94℃15s，60℃ 20s，72℃ 20s，40 個(gè)循環(huán)。Caspase-3 和Caspase-9 RNA 的表達(dá)量用其CT 值與GAPDH CT值的比值來表示。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD 法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組細(xì)胞凋亡率比較 與對(duì)照組比較，模型組HUVECs 細(xì)胞凋亡率增高（P<0.05）。與模型組比較，天麻組、法半夏組HUVECs 細(xì)胞凋亡率降低（P 均<0.05）。與天麻組比較，法半夏組凋亡率降低更明顯（P<0.05），見表1。

表1 各組HUVECs 細(xì)胞凋亡率比較（%，）

表1 各組HUVECs 細(xì)胞凋亡率比較（%，）

注：對(duì)照組為HUVECs 加入不含藥物的DMEM 培養(yǎng)基；模型組為HUVECs 加入含80μg/mL 氧化型低密度脂蛋白的DMEM 培養(yǎng)基；天麻組為HUVECs 加入含80μg/mL 氧化型低密度脂蛋白、5mg/mL 天麻水提物的DMEM 培養(yǎng)基；法半夏組為HUVECs 加入含80μg/mL 氧化型低密度脂蛋白、10mg/mL 法半夏水提物的DMEM 培養(yǎng)基；HUVECs為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與天麻組比較，cP<0.05

3.2 各組細(xì)胞增殖指數(shù)比較 與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞增殖指數(shù)降低（P<0.05）。與模型組比較，天麻組、法半夏組的細(xì)胞增殖指數(shù)增高（P 均<0.05）。與天麻組比較，法半夏組細(xì)胞增殖指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組HUVECs 細(xì)胞增殖指數(shù)的比較（%，）

表2 各組HUVECs 細(xì)胞增殖指數(shù)的比較（%，）

注：對(duì)照組為HUVECs 加入不含藥物的DMEM 培養(yǎng)基；模型組為HUVECs 加入含80μg/mL 氧化型低密度脂蛋白的DMEM 培養(yǎng)基；天麻組為HUVECs 加入含80μg/mL 氧化型低密度脂蛋白、5mg/mL 天麻水提物的DMEM 培養(yǎng)基；法半夏組為HUVECs 加入含80μg/mL 氧化型低密度脂蛋白、10mg/mL 法半夏水提物的DMEM 培養(yǎng)基；HUVECs為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3.3 各組VEGF、VEGFR-2 表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組VEGF 表達(dá)下調(diào)（P<0.05）；與模型組比較，天麻組、法半夏組VEGF 表達(dá)上調(diào)（P 均<0.05）；與天麻組比較，法半夏組VEGF 表達(dá)量下降（P<0.05）。與對(duì)照組比較，模型組VEGFR-2 表達(dá)下調(diào)（P<0.05）；與模型組比較，天麻組、法半夏組VEGFR-2 表達(dá)上調(diào)（P 均<0.05）；與天麻組比較，法半夏組VEGFR-2 表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖1-2、表3。

圖1 各組HUVECs VEGF 表達(dá)比較

圖2 各組HUVECs VEGFR-2 表達(dá)比較

表3 各組HUVECs VEGF、VEGFR-2 表達(dá)量比較（）

表3 各組HUVECs VEGF、VEGFR-2 表達(dá)量比較（）

注：對(duì)照組為HUVECs 加入不含藥物的DMEM 培養(yǎng)基；模型組為HUVECs 加入含80μg/mL 氧化型低密度脂蛋白的DMEM 培養(yǎng)基；天麻組為HUVECs 加入含80μg/mL 氧化型低密度脂蛋白、5mg/mL 天麻水提物的DMEM 培養(yǎng)基；法半夏組為HUVECs 加入含80μg/mL 氧化型低密度脂蛋白、10mg/mL 法半夏水提物的DMEM 培養(yǎng)基；HUVECs 為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；VEGF 為血管內(nèi)皮生長因子；VEGFR-2 為血管內(nèi)皮生長因子受體-2；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與天麻組比較，cP<0.05

3.4 各組Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA 表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較，模型組的Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA 表達(dá)量升高（P<0.05）；與模型組比較，天麻組、法半夏組Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA 表達(dá)量下降（P 均<0.05）；與天麻組比較，法半夏組Caspase-3 RNA 表達(dá)量下降（P<0.05），Caspase-9 RNA 表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表4。

表4 各組HUVECs Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA表達(dá)量比較（）

表4 各組HUVECs Caspase-3 RNA、Caspase-9 RNA表達(dá)量比較（）

注：對(duì)照組為HUVECs 加入不含藥物的DMEM 培養(yǎng)基；模型組為HUVECs 加入含80μg/mL 氧化型低密度脂蛋白的DMEM 培養(yǎng)基；天麻組為HUVECs 加入含80μg/mL 氧化型低密度脂蛋白、5mg/mL 天麻水提物的DMEM 培養(yǎng)基；法半夏組為HUVECs 加入含80μg/mL 氧化型低密度脂蛋白、10mg/mL 法半夏水提物的DMEM 培養(yǎng)基；HUVECs為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；Caspase-3 為半胱氨酸蛋白酶-3；Caspase-9為半胱氨酸蛋白酶-9；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與天麻組比較，cP<0.05

3 討論

ox-LDL 損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起血管活性物質(zhì)分泌紊亂，細(xì)胞黏附因子、炎癥因子異常表達(dá)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)膜并吞噬ox-LDL 形成泡沫細(xì)胞堆積在病灶中，形成粥樣斑塊，斑塊脫落引起心腦缺血疾病[2]。動(dòng)脈粥樣硬化、斑塊脫落引起的腦梗塞，導(dǎo)致神經(jīng)元缺血缺氧、壞死，功能喪失，從而引起卒中后認(rèn)知障礙，我國卒中后認(rèn)知障礙的發(fā)病率約55.97%，死亡率50%，嚴(yán)重影響患者的康復(fù)治療[3]。本研究結(jié)果顯示，ox-LDL 損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞增殖指數(shù)下降，天麻水提物和法半夏水提物干預(yù)能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，使細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞增殖指數(shù)升高。各種因素導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，最終造成細(xì)胞凋亡，Caspase 蛋白家族參與動(dòng)脈粥樣硬化引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其中Caspase-9 參與細(xì)胞凋亡的激活和打靶過程，Caspase-3 是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者[4]。本研究結(jié)果顯示，天麻、法半夏水提物下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9 RNA 表達(dá)，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

血管再生和神經(jīng)元再生對(duì)腦缺血后神經(jīng)保護(hù)起重要作用，血管再生可恢復(fù)缺血區(qū)的血供，防止神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)一步缺血壞死，神經(jīng)元再生可代償缺血壞死部分神經(jīng)元的功能；VEGF 是腦缺血后重要的血管調(diào)節(jié)因子，由血管內(nèi)皮等組織表達(dá)，VEGF 可促進(jìn)血管生成、保護(hù)神經(jīng)和促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生[5]。VEGF 有三類受體（VEGFRs），其中VEGFR-2 與血管生成關(guān)系密切，主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)元[6]。VEGF 與VEGFR-2 結(jié)合，激活磷酸肌醇3-激酶（PI3K），其中PI3K是促進(jìn)血管生成的關(guān)鍵激酶，PI3K 激活激酶B（Akt）可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖、遷移、血管化[7]。另外，血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF，可正性調(diào)節(jié)神經(jīng)再生，研究表明，VEGF 與VEGFR-2 結(jié)合能促進(jìn)大腦紋狀體及皮質(zhì)的新生神經(jīng)元分化成γ-氨基丁酸和膽堿能神經(jīng)元，能增加新生神經(jīng)元突起的長度和分支數(shù)量，提示神經(jīng)元上的VEGFR-2 接受來自血管內(nèi)皮細(xì)胞旁或者神經(jīng)元分泌的VEGF，正性調(diào)節(jié)神經(jīng)再生[8]。VEGF 還能趨化誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移[9]，刺激神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)神經(jīng)再生[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，癡復(fù)康方中天麻、法半夏配伍，二者水提物都能上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF 和VEGFR-2 的表達(dá)，可能具有促進(jìn)血管再生，促進(jìn)神經(jīng)元再生的作用，可能是癡復(fù)康方治療卒中后認(rèn)知障礙的機(jī)制之一，詳細(xì)的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。