于曉麗，陳超妍，吳雪寧，時(shí)云龍，劉 超，劉振寧

（臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東臨沂 256000）

植物ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白又稱(chēng)ATP 結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC transporters），其廣泛存在于真核生物和原核生物中，是目前已知功能多樣、種類(lèi)繁多的蛋白家族［1］。其中ABCB 蛋白為ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個(gè)亞家族，又稱(chēng)為多藥物抗性蛋白（Multidrug Resistance，MDR）或p-糖蛋白（p-glycoprotein，PGP）。在植物中研究發(fā)現(xiàn)，ABCB/PGP 蛋白家族主要參與生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸［2］。另有研究表明，ABCB/PGP蛋白參與了植物細(xì)胞的木質(zhì)化進(jìn)程以及鐵的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡［3-4］。目前，研究人員已經(jīng)對(duì)擬南芥、水稻、玉米、高粱、楊樹(shù)、桃、卷柏和小立碗蘚等植物中的ABCB/PGP 基因家族進(jìn)行了全基因組水平上的鑒定與分析。大白菜是我國(guó)的特色蔬菜之一，栽培面積和消費(fèi)量在我國(guó)各類(lèi)蔬菜中排行前列。大白菜全基因組測(cè)序的完成使得對(duì)大白菜相關(guān)基因家族的鑒定與分析成為可能。

本研究利用擬南芥ABCB/PGP 氨基酸序列作為種子序列在大白菜基因組中進(jìn)行搜索比對(duì)，鑒定出大白菜中ABCB/PGP 基因家族成員，并結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析ABCB/PGP 基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分類(lèi)，以期為進(jìn)一步研究大白菜ABCB/PGP 基因的生物學(xué)功能奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 大白菜ABCB/PGP 基因家族的鑒定

以擬南芥ABCB/PGP 蛋白的氨基酸序列作為種子序列在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://brassicadb.org/brad/）中通過(guò)BLAST P 進(jìn)行第一次比對(duì)搜索，找出候選基因。為了防止候選基因存在遺漏，再在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了二次BLAST P 比對(duì)搜索，保證最后數(shù)據(jù)的完整性。最后，利用Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)、SMART 數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI 的保守域數(shù)據(jù)庫(kù)分析候選蛋白的結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的有無(wú)鑒定是否屬于該基因家族。

1.2 大白菜ABCB/PGP 基因的基因組信息和染色體定位

通過(guò)大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得大白菜ABCB/PGP 基因的序列和基因組信息，并根據(jù)每一個(gè)ABCB/PGP 基因在染色體上的精確位置和染色體的長(zhǎng)度使用Photoshop 軟件將ABCB/PGP 基因人工定位到對(duì)應(yīng)的染色體上。大白菜ABCB/PGP 蛋白的分子量和等電點(diǎn)通過(guò)進(jìn)行在線(xiàn)分析。

1.3 大白菜ABCB/PGP 基因的結(jié)構(gòu)分析、保守域分析和進(jìn)化樹(shù)分析

ABCB/PGP 基因的外顯子-內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)圖使用GSDS 在線(xiàn)軟件繪制。關(guān)于進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，使用MEGA 5.0軟件自帶的Clustal W 應(yīng)用對(duì)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，空格罰分設(shè)置為10，空格擴(kuò)展罰分設(shè)置為0.2。然后將比對(duì)好的序列利用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化樹(shù)使用鄰接法構(gòu)建，采用泊松校正，成對(duì)刪除和1 000次重復(fù)等建樹(shù)參數(shù)然后將比對(duì)好的序列構(gòu)成進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜ABCB/PGP 基因家族的鑒定和注釋

根據(jù)擬南芥ABCB/PGP 蛋白的氨基酸序列，在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索比對(duì)，在大白菜中鑒定到31 個(gè)ABCB/PGP 蛋白，同時(shí)參考擬南芥ABCB/PGP 基因命名的方法對(duì)大白菜ABCB/PGP 基因進(jìn)行了命名，見(jiàn)表1。31個(gè)ABCB/PGP 基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度在442～4 249 bp，編碼147～1 416 個(gè)氨基酸，相應(yīng)的蛋白分子量在24.6～332.1 kDa，等 電 點(diǎn) 在4.76～9.48。大 部 分ABCB/PGP 基因都定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。對(duì)大白菜ABCB/PGP 基因染色體定位的分析表明，ABCB/PGP 基因在大白菜的10 條染色體上分布不是很均勻，其中第3、4、6、7 和9 號(hào)染色體上較多，而第1、2、5、8 和10 號(hào)染色體上的ABCB/PGP 基因則比較少，僅有一兩個(gè)分布其上，如圖1 所示。

表1 大白菜ABCB/PGP 基因家族成員基因組信息和蛋白特征分析

2.2 大白菜ABCB/PGP 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析和分類(lèi)

為分析大白菜ABCB/PGP 基因的系統(tǒng)發(fā)育和分類(lèi)，選取了大白菜、擬南芥這兩個(gè)代表性物種中ABCB/PGP蛋白的氨基酸序列，使用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建了NJ 進(jìn)化樹(shù)并對(duì)ABCB/PGP 基因進(jìn)行了聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖2 所示。結(jié)果表明，這2 個(gè)物種中的52 個(gè)ABCB/PGP 基因被聚類(lèi)成6 個(gè)分支，分支為Clade Ⅰ、Clade Ⅱ、Clade Ⅲ、Clade Ⅳ、Clade Ⅴ和Clade Ⅵ。從進(jìn)化樹(shù)中可以看出每個(gè)分支都含有擬南芥ABCB/PGP 基因與大白菜ABCB/PGP基因，分布比較均勻。其中CladeⅠ分支是基因分布最多的，在Clade Ⅰ分支中含有9 個(gè)大白菜ABCB/PGP 基因，分別為BrABCB1～BrABCB9，而擬南芥ABCB/PGP 基因含有8 個(gè)，分別為AtPGP3、AtPGP4、AtPGP5、AtPGP7、AtPGP9、AtPGP11、AtPGP12、AtPGP21；分 支Clade Ⅴ是分布最少的，其中大白菜ABCB/PGP 基因含有2 個(gè)，為BrABCB25 和BrABCB26，擬南芥ABCB/PGP 基因也含有2 個(gè)，分別為AtPGP13 和AtPGP14。其他的Clade Ⅱ分支含有大白菜ABCB/PGP 基因9 個(gè)，含有擬南芥ABCB/PGP基因4 個(gè)；Clade Ⅲ分支含有大白菜ABCB/PGP 基因3 個(gè)，而含有擬南芥ABCB/PGP 基因2 個(gè)；Clade Ⅳ分支中含有大白菜ABCB/PGP 基因4 個(gè)，擬南芥ABCB/PGP 基因2個(gè)；Clade Ⅵ分支含有大白菜ABCB/PGP 基因5 個(gè)，擬南芥ABCB/PGP 基因也是2 個(gè)。

為進(jìn)一步研究大白菜ABCB/PGP 基因在植物中的進(jìn)化模式，選用了大白菜、擬南芥、水稻、玉米、楊樹(shù)、小立碗蘚、卷柏和桃這8 個(gè)代表性物種中的ABCB/PGP蛋白的氨基酸序列使用MEGA5.0 軟件構(gòu)建了進(jìn)化樹(shù)并對(duì)各物種中ABCB/PGP 基因進(jìn)行了聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，這8 個(gè)物種的ABCB/PGP 基因被聚類(lèi)成7 個(gè)分支，多了一個(gè)分支Clade Ⅶ。其中Clade Ⅰ～Ⅵ每個(gè)分支都有分布各個(gè)物種的基因，而Clade Ⅶ分支上沒(méi)有大白菜和擬南芥的基因分布。

圖1 大白菜ABCB/PGP 基因染色體定位

圖2 大白菜和擬南芥ABCB/PGP 基因的進(jìn)化樹(shù)

2.3 大白菜ABCB/PGP 基因的基因結(jié)構(gòu)分析

為研究大白菜ABCB/PGP 基因的基因結(jié)構(gòu)，根據(jù)大白菜基因組信息獲取了每一個(gè)ABCB/PGP 基因的DNA和CDS 序列信息并構(gòu)建了其基因結(jié)構(gòu)圖（圖4），結(jié)果表明大部分ABCB/PGP 基因都有4～13 個(gè)不等的外顯子且各分支分布相對(duì)比較均勻，只有其中部分小分支如BrABCB24、BrABCB31 分布較少只有1～2 個(gè)。同時(shí)，大部分ABCB/PGP 基因都含有3～12 個(gè)不等的內(nèi)含子，其中BrABCB24 有1 個(gè)內(nèi)含子，而B(niǎo)rABCB31 則沒(méi)有內(nèi)含子。

圖3 陸生植物8 個(gè)物種中ABCB/PGP 基因的進(jìn)化樹(shù)

圖4 大白菜ABCB/PGP 的基因結(jié)構(gòu)圖

3 討論與結(jié)論

本研究在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到了31 個(gè)ABCB/PGP 基因家族成員，該家族是一個(gè)成員數(shù)目相對(duì)較多的家族。Gao 等通過(guò)大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)生長(zhǎng)素運(yùn)輸相關(guān)的3 個(gè)蛋白家族成員（AUX/LAX、PIN 和ABCB/MDR/PGP）進(jìn)行了鑒定，其中篩選到27 個(gè)ABCB/PGP 基因家族成員，比本研究中鑒定到的基因家族成員少4個(gè)，分別為Bra025328、Bra039056、Bra027825和Bra033064［5］。但是需要注意的是，Bra027825 和Bra033064 這兩個(gè)基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度跟其他ABCB/PGP 基因家族成員相比較小，筆者推測(cè)這兩個(gè)基因可能是假基因或者沒(méi)有拼接出全長(zhǎng)序列。

本研究首先選取了大白菜和擬南芥2 個(gè)物種的ABCB/PGP 蛋白的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，52個(gè)ABCB/PGP基因被聚類(lèi)成6個(gè)分支，即CladeⅠ～CladeⅥ，然后進(jìn)一步選取了大白菜、擬南芥、水稻、玉米、楊樹(shù)、小立碗蘚、卷柏和桃8 個(gè)代表性物種中的ABCB/PGP 蛋白的氨基酸序列進(jìn)行聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)這8 個(gè)物種的ABCB/PGP 基因被聚類(lèi)成7 個(gè)分支，多了一個(gè)分支Clade Ⅶ，而Clade Ⅶ分支上均沒(méi)有大白菜和擬南芥的基因分布。大白菜ABCB/PGP 基因在Clade Ⅶ的缺失原因仍有待進(jìn)一步研究。