張然，李佳縉，王銘，吉凌鶴，侯瑄，馬祥，馬暉玲

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院青藏高原優(yōu)良牧草種植資源利用重點實驗室，青海 西寧 810016)

草地早熟禾(Poapratensis)作為禾本科早熟禾屬多年生草本植物，是世界上種植最廣泛的冷型草坪草之一[1]。因其耐踐踏、耐修剪和再生能力強而廣泛用于公園、高爾夫球場、城市景觀和其他運動場草坪[2]。近年來，由于全球氣候暖化、極端氣溫頻發(fā)、工業(yè)和農(nóng)業(yè)迅猛發(fā)展，加劇了水資源的不確定性和極端干旱的發(fā)生[3]。干旱是限制世界各地草坪草生長的主要非生物因素之一[5]。研究表明，當(dāng)草坪草所處環(huán)境的干旱程度低于其最高耐受閾值時，草坪草通過調(diào)節(jié)自身的生理生化特性來適應(yīng)環(huán)境條件的改變。然而，當(dāng)草坪草生長環(huán)境的干旱程度高于其最高耐受閾值時，會引起草坪草細胞、組織和器官永久損傷，進而影響草坪草的生長和發(fā)育，甚至導(dǎo)致植株死亡[6]。干旱脅迫對草坪草的傷害程度取決于脅迫時間、草坪草的發(fā)育階段和基因型[7]。草地早熟禾喜光、耐陰、耐旱，但苗期耐旱性相對較弱[8]，因此選育具有優(yōu)良遺傳性狀的草地早熟禾種質(zhì)對草坪的建植至關(guān)重要。

我國是世界上早熟禾資源最豐富的國家之一，國家牧草種質(zhì)資源中心庫保存著71個早熟禾屬、148種草地早熟禾種質(zhì)材料[9]。野生早熟禾具有較強的抗逆性。王婧等[10]應(yīng)用NaCl處理14種草地早熟禾，發(fā)現(xiàn)‘藍天鵝’‘優(yōu)異白’‘藍狐’‘肯塔基’和‘優(yōu)美’品種耐鹽性較好。白小明等[11]利用NaCl和Na2SO4處理8個甘肅野生早熟禾種質(zhì)材料種子，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)期小藥早熟禾耐鹽性較好。鮮靖蘋等[12]比較了10種草地早熟禾的耐鎘性，結(jié)果表明‘午夜’品種具有良好的耐鎘性。呂優(yōu)偉等[13]對甘肅境內(nèi)9個野生早熟禾材料進行低溫處理，發(fā)現(xiàn)一年生早熟禾耐寒性較強。田莉華等[14]選取青海省海北地區(qū)的8種早熟禾屬種質(zhì)材料進行耐旱評價，發(fā)現(xiàn)草地早熟禾、高原早熟禾和山地早熟禾的耐旱性較好。

甘肅省和青海省地形復(fù)雜，氣候多變，橫跨濕潤、半濕潤、半干旱和干旱區(qū)，早熟禾屬資源豐富[15]。因此，本試驗選取3個甘肅野生草地早熟禾材料，4個青海野生草地早熟禾材料和4種草地早熟禾商用品種開展苗期干旱脅迫試驗，通過測定其生理指標(biāo)的變化并用隸屬函數(shù)對苗期的耐旱性進行評價，闡明11種草坪草耐旱性強弱，以期為甘肅省和青海省草地早熟禾耐旱品種的選擇和培育提供理論參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料(表1)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院和青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院提供，分析純PEG-6000購自上海源葉生物科技有限公司。

表1 供試草地早熟禾種質(zhì)材料及其來源

1.2 試驗設(shè)計

挑選籽粒飽滿、大小均一的草地早熟禾種子，用無菌水過夜浸泡，70%的酒精處理1 min，無菌水沖洗3～5次，20%(V/V)的次氯酸鈉消毒30 min，無菌水沖洗5～6次，最后用濾紙將水吸干備用。試驗所用種植土為消毒后的蛭石和營養(yǎng)土(重量比3:1)，每個育苗缽裝入0.5 kg，將處理后的種子于2019年9月15日種植于育苗缽內(nèi)，放置在19樓培養(yǎng)室，設(shè)置晝/夜溫度為25℃/20℃，每天光周期循環(huán)14 h，相對濕度為65%。每天18∶00～20∶00 及時補充水分，采用稱重法控制土壤含水量，正常灌溉保持土壤含水量在20%～23%(由預(yù)實驗所得的草地早熟禾盆栽土壤飽和含水量)。待95%種子長出第1片真葉時將育苗缽轉(zhuǎn)移到含1/2 Hoagland營養(yǎng)液的培養(yǎng)盒中，每4 d更換1次培養(yǎng)盒的營養(yǎng)液。待幼苗長至4～5片真葉時進行干旱脅迫處理，處理組將培養(yǎng)盒的溶液換成含15% PEG-6000的1/2 Hoagland營養(yǎng)液，對照組(CK)為1/2 Hoagland營養(yǎng)液，每隔3 d更換1次營養(yǎng)液，每組處理3次重復(fù)。處理第12 d采樣測定其抗性指標(biāo)。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 相對含水量的測定[18]取處理12 d后的地上部幼苗葉片，迅速稱量鮮重(FW)；將葉片用去離子水浸泡24 h(此過程需遮光)；取出后用吸水紙吸干葉片表面的水分，迅速稱量葉片飽和重量(TW)；將葉片放入105℃烘箱殺青30 min，然后在80℃烘干至恒重，稱量干重(DW)，計算相對含水量(RWC)：

RWC (%)=[(FW-DW)/(TW-DW)]×100%

1.3.2 膜質(zhì)過氧化物測定 丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法測定[19]；

1.3.3 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測定 游離脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮顯色法測定[20]；可溶性糖含量(soluble sugar,SS)采用蒽酮比色法測定[19]；

1.3.4 葉綠素含量的測定 葉綠素(Chl)含量采用乙醇提取法測定[20]，按照公式計算葉綠素含量：

Ca=13.95D665 nm-6.88D649 nm；Cb=24.96D649 nm-7.32D665；C葉綠素=Ca+ Cb；葉綠素含量=C葉綠素×V/W；

式中，Ca：葉綠素a濃度；Cb：葉綠素b濃度；C葉綠素：葉綠素濃度；V：提取液體積(L) ；W：稱取樣品質(zhì)量(g)。

1.3.5 抗氧化酶活性的測定 超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑顯色法測定[19]；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外比色法測定[19]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 24.0進行數(shù)據(jù)分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果，對同種材料間對照組和處理組各指標(biāo)采用t檢驗，對各指標(biāo)相對含量進行單因素方差分析(P<0.05)，用Duncan法對各數(shù)據(jù)進行多重比較；采用GraphPad Prism 8作圖。

相對增加量(%)=[(處理組-對照組)/對照組]×100%(包括SOD、POD、CAT活性，Pro、MDA、可溶性糖含量)；

相對減少量(%)=[(對照組-處理組)/對照組]×100%(包括相對含水量、葉綠素含量)；

應(yīng)用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)值法，就各指標(biāo)的相對含量進行綜合分析。隸屬函數(shù)公式為：

當(dāng)指標(biāo)性狀與緩解干旱脅迫呈正相關(guān)時，公式為：U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)；

當(dāng)指標(biāo)性狀與緩解干旱脅迫呈負相關(guān)時，公式為：U(Xi)=1-[(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)]。

其中，U(Xi)表示隸屬函數(shù)值；Xi表示處理水平某指標(biāo)的測定值；Xmin和Xmax表示參試水平系中某一指標(biāo)內(nèi)的最小值和最大值。最后將各個指標(biāo)的隸屬函數(shù)值進行累加，求平均值，進行排序。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對草地早熟禾幼苗葉片相對含水量的影響

干旱脅迫下11個草地早熟禾種質(zhì)材料幼苗葉片RWC均有不同程度的降低。M3、M8、M10、M11與對照差異極顯著(P<0.01)，M1、M2、M5、M6、M7、M9相比于對照差異顯著(P<0.05)，M4較對照無差異(圖1-A)。M2、M3、M11的葉片相對含水量分別較對照降低了30.71%、32.89%、30.49%，顯著高于其他材料(P<0.05)；M4、M5、M8、M10的相對含水量降低值較小，分別為13.41%、13.98%、14.99%、13.31%，但與M6，M7和M9差異不顯著(P>0.05)，與其他材料相比差異顯著(P<0.05)(圖1-B)。M4、M5、M8、M10經(jīng)過干旱脅迫后，幼苗葉片RWC降低幅度較小，而M2、M3、M11的RWC降低幅度較大。

圖1 草地早熟禾幼苗葉片相對含水量和相對減少量Fig.1 Relative water content and relative water content reduction of leaves of Kentucky bluegrassseedlings注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，ns表示差異不顯著，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同

2.2 干旱脅迫對草地早熟禾幼苗葉片丙二醛含量的影響

11種材料經(jīng)15%PEG-6000處理后，MDA含量均有增加，其中M1、M3、M6、M11較對照差異極顯著(P<0.01)，M4、M7、M8、M10較對照差異顯著(P<0.05)，M2、M5、M9與對照相比無顯著差異(圖2-A)。M6和M11 MDA含量相對增加量顯著高于其他材料(P<0.05)，分別為153.21%、148.29%；而M2和M8較對照分別降低了13.59%和9.73%，顯著低于其他材料(P<0.05)。這說明11個草地早熟禾材料葉片的MDA含量均受干旱脅迫的影響，M6和M11的MDA含量變化較大，葉片膜脂過氧化程度較高，M2和M8的MDA含量變化較小，葉片細胞膜系統(tǒng)受損程度較輕(圖2-B)。

圖2 草地早熟禾幼苗葉片丙二醛含量和相對增加量Fig.2 MDA content and relative added value of MDA content of leaves of Kentucky bluegrass seedlings

2.3 干旱脅迫對草地早熟禾幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.3.1 干旱脅迫對草地早熟禾幼苗葉片脯氨酸含量的影響 經(jīng)干旱脅迫后，M5的Pro含量與對照相比差異不顯著，其余10種草地早熟禾材料葉片Pro含量較對照均顯著增加(P<0.01)(圖3-A)。Pro含量相對增加量，M1顯著高于其他材料(P<0.05)，相比于對照增加了207.10%；M8和M10的Pro含量相對增加量分別較對照增加176.12%、157.41%，低于M1，但顯著高于其他材料(P<0.05)；而M5和M11的Pro含量相對增加量分別為16.06%、19.83%，顯著低于其他材料(P<0.05)(圖3-B)。這說明干旱脅迫下M1、M8和M10產(chǎn)生Pro，可降低細胞內(nèi)水勢，提高細胞滲透調(diào)節(jié)能力，而M5和M11產(chǎn)生Pro較少，對細胞滲透調(diào)節(jié)能力相對較弱。

圖3 草地早熟禾幼苗葉片脯氨酸含量和相對增加量Fig.3 Pro content and relative added value of Pro content of leaves of Kentucky bluegrassseedlings

2.3.2 干旱脅迫對草地早熟禾幼苗葉片可溶性糖含量的影響 干旱脅迫下，11種材料的可溶性糖含量均呈極顯著增加(P<0.01)(圖4-A)。其中M6和M10的SS含量相對增加量分別為329.14%和328.77%，顯著高于其他材料(P<0.05)，而M2和M7的SS含量相對增加量顯著低于其他材料(P<0.05)，分別為38.09%和25.12%(圖4-B)。這表明11種草地早熟禾材料幼苗都會通過積累可溶性糖來響應(yīng)干旱脅迫，M6和M10積累較高的可溶性糖來提高草地早熟禾的滲透調(diào)節(jié)能力，而M2和M7積累可溶性糖含量相對較低更容易受到干旱脅迫的影響。

圖4 草地早熟禾幼苗葉片可溶性糖含量和相對增加量Fig.4 Soluble sugar content and relative added value of soluble sugar content of leaves of Kentucky bluegrass seedlings

2.4 干旱脅迫對草地早熟禾幼苗葉片葉綠素含量的影響

11種草地早熟禾材料幼苗葉片Chl含量均有不同程度的下降(圖5-A)。其中M1和M11下降幅度最大，顯著高于其他材料(P<0.05)，分別為86.02%和85.33%；而M5、M8、M9和M10的相對Chl含量降低量最小，顯著低于其他材料(P<0.05)，分別為19.61%、24.65%、21.85%和21.71%(圖5-B)。這表明M5、M8、M9和M10的Chl含量受干旱脅迫影響較小，而M1和M11受干旱脅迫影響較大。

圖5 草地早熟禾幼苗葉片葉綠素含量和相對降低量Fig.5 Chlorophyll content reduction of leaves of Kentucky bluegrass seedlings

2.5 干旱脅迫對草地早熟禾幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

2.5.1 干旱脅迫對草地早熟禾幼苗葉片SOD活性的影響 干旱脅迫下，11種草地早熟禾材料幼苗SOD活性較對照均有提高，其中M2、M3、M4和M10與對照相比差異極顯著(P<0.01)；M7、M8、M9和M11與對照相比差異顯著(P<0.05)；而M1、M5和M6與對照相比無顯著差異(圖6-A)。SOD活性相對增加量，M10最大，較對照增加了61.41%，顯著高于其他材料(P<0.05)，M1和M11的SOD活性相對增加量顯著低于其他材料，分別為3.11%和4.62%(圖6-B)。

圖6 草地早熟禾幼苗葉片SOD 活性和相對增加量Fig.6 SODactivity and relative added value of SOD activity of leaves of Kentucky bluegrass seedlings

2.5.2 干旱脅迫對草地早熟禾幼苗葉片POD活性的影響 干旱脅迫下，11種草地早熟禾材料幼苗POD 活性均有不同程度的提高。其中M1、M2、M6、M7、M8、M10和M11較對照差異極顯著(P<0.01)；M3和M4與對照相比差異顯著(P<0.05)；而M5和M9和對照相比無顯著差異(圖7-A)。POD 活性相對增加量M2和M10分別為83.36%和90.87%，增加幅度大于其他區(qū)材料；而M1和M11的增加幅度較小，僅為8.93%和7.90%，顯著低于其他材料(P<0.05)(圖7-B)，這表明干旱脅迫M1和M11的POD活性受脅迫影響較大。

圖7 草地早熟禾幼苗葉片POD 活性和相對增加量Fig.7 POD activity and relative added value of POD activity of leaves of Kentucky bluegrass seedlings

2.5.3 干旱脅迫對草地早熟禾幼苗葉片CAT活性的影響 干旱脅迫下，11種草地早熟禾材料幼苗葉片中CAT活性明顯提高，M5、M8、M9和M10較對照差異極顯著(P<0.01)；M1、M2、M3和M6較對照差異顯著(P<0.05)；材料M4、M7和M11較對照無顯著差異(圖8-A)。11種材料，M10的CAT活性相對增加量為78.71%，顯著高于其他材料(P<0.05)；M7和M11的增加幅度較小，低于其他材料，僅為7.66%和8.16%(圖8-B)，這表明M10幼苗CAT活性受干旱脅迫影響較低，而M7和M11受脅迫影響較大。

圖8 草地早熟禾幼苗葉片CAT活性和相對增加量Fig.8 CAT activity and relative added value of CAT activity of leaves of Kentucky bluegrass seedlings

2.6 干旱脅迫對草地早熟禾幼苗葉片各指標(biāo)的綜合評價

以RWC、Chl、Pro、SS、MDA含量、SOD、CAT、POD活性8個抗旱性相關(guān)指標(biāo)的相對增加量為依據(jù)，計算各個指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值，對11種草地早熟禾苗期耐旱性進行綜合評價，M11隸屬平均值最小(0.09)，耐旱性最弱；而M10的平均值最大(0.90)，耐旱性最強；11種草地早熟禾種質(zhì)材料耐旱性強弱依次為M10>M8>M9>M2>M5>M4>M3>M6>M7>M1>M11(表2)。

表2 干旱脅迫對草地早熟禾幼苗葉片各指標(biāo)隸屬函數(shù)值及耐旱性排序

3 討論

草坪草體內(nèi)正常的水分含量對維持其細胞功能至關(guān)重要，水分吸收取決于根系的特性和功能，水分的消耗和保持主要受地上部生長和生理活動的控制[21]。葉片相對含水量是衡量植物組織水分狀況及吸水和失水動態(tài)平衡的重要指標(biāo)，在一定程度上能體現(xiàn)出植物對干旱脅迫的耐受能力。相對含水量下降速度慢，幅度小，則抗旱性強，反之則弱[22]。本研究通過模擬干旱脅迫，對11種不同生境幼苗期草地早熟禾的耐旱性進行評價，結(jié)果表明，干旱脅迫導(dǎo)致11種草地早熟禾幼苗相對含水量均有不同程度的下降，這與細葉芒(Miscanthussinensis)[23]、紫花苜蓿(Medicagosativa)[24]、垂穗披堿草(Elymusnutans)[25]、黑麥草(Loliumperenne)[26]等牧草和觀賞植物的研究結(jié)果一致。其原因可能是干旱脅迫使草地早熟禾根系吸收水分減少，地上部分水分散失率大于地下部的吸收率，進而降低了葉片相對含水量。此外，11種草地早熟禾葉片相對含水量下降幅度存在差異，這與Cao等[27]對12種薄殼山核桃(Caryaillinoensis)的耐旱性評價結(jié)果一致。

丙二醛作為植物細胞膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，是反映氧化損傷程度的重要生理指標(biāo)[28]。大量研究表明，干旱脅迫會導(dǎo)致膜系統(tǒng)氧化損傷，MDA含量增加[29]。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫下11種不同生境草地早熟禾MDA含量增加，且MDA含量增加幅度不同。干旱脅迫會引起活性氧自由基增加，使植物細胞遭受氧化脅迫，從而導(dǎo)致細胞膜受損并影響植物生長，趙麗麗等[30]報道干旱脅迫引起19種高羊茅(Festucaarundinacea)種質(zhì)MDA含量上升，這與本研究結(jié)果一致。

脯氨酸和可溶性糖是植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與干旱脅迫下植物細胞的滲透調(diào)節(jié)，可以保護蛋白分子結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)[31]。宋婭麗等[33]研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下黑麥草、高羊茅和早熟禾幼苗通過增加Pro和SS含量來提高水分吸收。本研究結(jié)果顯示，干旱脅迫導(dǎo)致草地早熟禾幼苗葉片中Pro和SS含量增加，這種增加可能分別是蛋白質(zhì)和淀粉降解的結(jié)果[32]。同樣，曹麗等[34]對草地早熟禾抗旱性指標(biāo)測定分析的研究得到了相同的結(jié)果。

光合作用是植物體生長發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)。葉綠素作為植物進行光合作用的主要色素，能夠主導(dǎo)植物的光合作用，而干旱脅迫會引起葉綠體光合色素含量降低、內(nèi)囊體膜穩(wěn)定性和參與光合作用酶活性的改變，導(dǎo)致光合能力下降和光合作用受阻[35]，葉綠素含量的高低能夠反映植物的光合特性和抗旱能力[36]。羅彬瑩等[37]研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫導(dǎo)致樟樹(Cinnamomumcamphora)幼苗中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a/b下降，進而引起凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、胞間CO2濃度持續(xù)下降。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫導(dǎo)致11種草地早熟禾幼苗葉片的葉綠素含量均有不同程度的降低，推測原因可能是缺水引起植物光合色素降解，以及合成途徑受阻，導(dǎo)致光合色素含量下降。Dalal等[38]證實干旱脅迫引起水稻(Oryzasativa)幼苗5-氨基乙酰丙酸脫氫酶、膽色素原脫氨酶、原卟啉氧化酶3抗體、Mg-原卟啉IX氧化酶和葉綠素氧化還原酶等基因的表達量下調(diào)，導(dǎo)致相關(guān)酶活性降低，進而抑制了葉綠素生物合成中間體(即谷氨酸-1-半醛(GSA)，5-氨基乙酰丙酸，Mg-原卟啉IX和葉綠素酸酯)的積累。

正常條件下，植物產(chǎn)生的活性氧(ROS)是重要的信號分子，參與植物生長、發(fā)育激素反應(yīng)、逆境脅迫應(yīng)答和部分生理過程[39]。干旱脅迫下植物氣孔關(guān)閉，葉片內(nèi)CO2濃度降低，碳同化被抑制，為維持光合電子傳遞鏈的正常運行，O2被直接還原為O2·-，進而積累了過多的ROS[35]。研究表明，SOD、POD和CAT是清除ROS的重要酶，同時也是評價植物抗逆境的重要指標(biāo)之一[40]。本試驗結(jié)果表明，干旱脅迫下11種草地早熟禾材料SOD、POD和CAT活性顯著升高，不同材料增加幅度不同，其中M10增加幅度最大，這與董沁等[41]的研究結(jié)果相一致。

植物抗旱性是由多因素和多基因相互作用構(gòu)成的一個復(fù)雜的性狀，利用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法對相關(guān)抗旱指標(biāo)進行綜合評價，有利于評定出的結(jié)果與實際結(jié)果較為接近。本試驗利用隸屬函數(shù)法，對11種草地早熟禾種質(zhì)材料苗期所測定的8個指標(biāo)進行綜合評價，使得評定結(jié)果更加全面可靠地反映各種質(zhì)資源的耐旱性。

4 結(jié)論

干旱脅迫下11種草地早熟禾種質(zhì)材料相對含水量和葉綠素含量顯著降低，SOD、POD和CAT活性升高，Pro、MDA和可溶性糖含量增加。通過隸屬函數(shù)法用11種草地早熟禾種質(zhì)材料的RWC和Chl含量的相對降低量和MDA、Pro、SS、SOD、POD和CAT的相對增加量進行苗期耐旱性綜合評價，耐旱性由強到弱排序依次為M10>M8>M9>M2>M5>M4>M3>M6>M7>M1>M11。因此，M10和M8可作為甘肅省和青海省草地早熟禾選育耐旱品種的候選材料。