浦恩念，高子厚*，李玉瓊，邵宗體，杜春紅，段興德，劉正祥

(1.大理大學公共衛(wèi)生學院，云南大理671000；2.云南省地方病防治所，云南大理671000)

大絨鼠Eothenomys miletus隸屬于倉鼠科Cricetidae絨鼠屬，在云南省分布廣泛(羅澤珣，2000)，是云南野鼠鼠疫自然疫源地的主要儲存和流行宿主動物之一。云南省特殊的地理環(huán)境和氣候條件，可能導致了大絨鼠形態(tài)特征不穩(wěn)定、同種異型和近緣種形態(tài)特征相似等問題：王應祥(2003)將大絨鼠分為2個地理亞種：指名亞種E.m.miletus和怒江亞種E.m.confinii；整個絨鼠屬的系統(tǒng)關系及分類地位尚存爭議(劉少英，劉洋，2005)。因此，云南不同地理位置和氣候環(huán)境中分布的大絨鼠的遺傳多樣性與遺傳分化值得研究和探討。

動物線粒體DNA(mtDNA)分子小而穩(wěn)定、母系遺傳、進化速度快等特征(Birkyetal.，1989)，已成為遺傳多樣性研究的一個強有力的工具，它包含的細胞色素b(cyt b)基因是研究物種地理變異問題最可信的線粒體DNA標記之一(李楠楠等，2012)。一些學者對大絨鼠的遺傳結構進行了初步研究(沐遠等，2015；Muetal.，2019)，但尚未對其他區(qū)域分布的大絨鼠的遺傳信息進行比較分析，本文對云南7個地區(qū)的大絨鼠cyt b基因進行檢測分析，為大絨鼠乃至絨鼠屬的系統(tǒng)研究提供分子數(shù)據。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集、鑒定和保存

本研究從玉龍縣、劍川縣、祥云縣、大理市、巧家縣、祿勸縣、騰沖市的7個采樣點共采集到大絨鼠140只(表1)。利用鼠夾從采樣點的農田及灌木叢中捕獲大絨鼠，捕獲個體按形態(tài)學特征，并剝制頭骨標本進行鑒定，取肌肉保存于95%乙醇中，-20 ℃保存。

表1 云南7個采樣點的大絨鼠樣品采樣信息 Table 1 Sampling information of Eothenomys miletus in 7 localities of Yunnan Province

1.2 基因組DNA提取、PCR擴增和測序

用肌肉標本按照QIAGEN試劑盒產品說明書步驟提取基因組DNA。cyt b的PCR擴增使用哺乳動物通用引物L14724：5’-CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG-3’，H15915R：5’-GGAATTCATCTCTCCGGTTTACAAGAC-3’；擴增體系為25 μL：模板2 μL，10 μmol·L-1引物各0.5 μL，Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。擴增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。實驗過程以水作為空白對照。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.3 序列分析

利用Clustal X(Thompsonetal.，1997)對測序獲得的有效樣本序列進行比對。利用MEGA 5(Tamuraetal.，2011)基于Kimura雙參數(shù)距離模型計算堿基組成、轉換與顛換值；以齊氏姬鼠Apodemus chevrieri(GenBank登錄號：AB096821)為外群，基于類平均法(UPGMA)構建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支的自舉檢驗值由1 000次重復檢驗所得。利用Dnasp 5.0(Rozasetal.，2003)計算單倍型數(shù)目、變異位點數(shù)、簡約信息位點數(shù)、單倍型多樣性、核苷酸多樣性和基因流(Nm)。其中，Nm<1表明群體間可能由于遺傳漂變而發(fā)生分化；Nm>1表明群體間的基因流水平較高，群體間遺傳分化較小。利用PopART(Leigh &Bryant，2015)基于中連法(Median joining method)構建大絨鼠單倍型間的網絡關系圖。運用Arlequin 3.1(Excoffieretal.，1992)計算遺傳分化系數(shù)(Fst)，進行分子變異分析(AMOVA)。通過IBD 1.53(Bohonak，2002)檢測地理距離與遺傳距離的相關性，用Fst值表示遺傳距離，地理距離采用采樣點間的地球表面直線距離。

2 結果與分析

2.1 DNA的PCR擴增

擴增結果經瓊脂糖凝膠電泳檢測未發(fā)現(xiàn)非特異性條帶，共獲得140只大絨鼠的擴增條帶，部分樣本擴增結果見圖1。

2.2 cyt b基因序列分析

共獲得140只大絨鼠樣本cyt b基因部分序列(GenBank登錄號：MW567503～MW567642)，在1 027 bp的序列中，共有核苷酸變異位點128個，包含單變異位點109個和簡約信息位點19個，轉換和顛換(TS/TV)比為2.0，A、T、G、C平均堿基組成分別為：29%、27%、30.4%、13.6%，A+T含量顯著高于G+C含量。109個變異位點共定義51種單倍型，分別命名為Hap1～Hap51。

2.3 遺傳多樣性和遺傳結構

7個采樣點大絨鼠的單倍型多樣性為0.711～0.907，核苷酸多樣性為0.002 25～0.002 98，整體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.977±0.004和0.018 45±0.001 78。所有種群均為高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的模式。Hap20為大理、祥云、劍川種群共享，Hap21、Hap22、Hap24為大理、祥云種群共享，其余47個單倍型為各個種群特有(表2)。玉龍和劍川種群的單倍型多樣性相對較高，巧家種群的核苷酸多樣性最高(表3)。

表2 云南7個采樣點的大絨鼠單倍型分布Table 2 Haplotype distribution of Eothenomys miletus from 7 localities of Yunnan Province based on cyt b gene

表3 云南7個采樣點的大絨鼠cyt b基因的變異位點及遺傳多樣性Table 3 Variable sites and genetic diversity of Eothenomys miletus populations from 7 localities of Yunnan Province based on cyt b gene

2.4 種群間遺傳分化

種群間遺傳差異分析結果顯示，7個地理種群的Fst值為0.179 68～0.949 45，遺傳差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(表4)。分子變異分析(AMOVA)結果表明，群體間的遺傳變異為84.29%，群體內的為15.71%。種群間的基因流為0.026 62～2.282 72，除玉龍、祥云、劍川、大理4個地理距離較近種群之間的Nm值大于1之外，其他均小于1，且值均較低(表5)。

表4 云南7個采樣點的大絨鼠地理種群間的遺傳分化指數(shù)(下三角)與地理距離(km)(上三角)Table 4 Genetic differentiation (below diagonal) and geographical distances (km)(above diagonal) between Eothenomys miletus populations from 7 localities of Yunnan Province

表5 云南7個采樣點的大絨鼠cyt b基因的分子變異分析Table 5 AMOVA analysis for the cyt b sequences of Eothenomys miletus from 7 localities of Yunnan Province

表6 云南7個大絨鼠種群間的基因流Table 6 Matrix of population pairwise migration rate values between Eothenomys miletus populations from 7 localities of Yunnan Province

2.5 單倍型系統(tǒng)發(fā)生關系

采用UPGMA法構建的系統(tǒng)進化樹顯示，7個采樣點的大絨鼠種群分化為4個地域分支(圖2)，第一分支包括玉龍、祥云、劍川、大理的單倍型，第二分支為祿勸的單倍型，第三分支為巧家單倍型，第四分支為騰沖單倍型。單倍型進化網絡關系圖顯示出與進化樹相同的結果(圖3)，大絨鼠已經出現(xiàn)了地理種群分化。

2.6 IBD檢驗

通過IBD1.53對大絨鼠7個地理種群間的地理距離與遺傳距離進行檢驗，結果顯示，地理距離與遺傳距離之間呈顯著的正相關(r=0.699 7，P<0.05，R2=0.49)。

3 討論

遺傳多樣性的高低與物種的適應能力、生存能力密切相關(季維智等，1999；Frankhametal.，2010)，本研究中大絨鼠單倍型多樣性為0.977±0.004，核苷酸多樣性為0.018 45±0.001 78，多樣性水平與其常同域分布的齊氏姬鼠相當(朱萬龍等，2013)，玉龍和劍川大絨鼠種群單倍型多樣性高于其他種群，大絨鼠在這些地區(qū)小獸中的構成比也較高，說明大絨鼠在這些地區(qū)的適應能力和生存能力較強。大絨鼠種群總體表現(xiàn)出高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性的特點，Yuan等(2012)認為高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性主要與單個堿基的變異、地理種群處于擴張有關，大絨鼠種群總體表現(xiàn)出高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性的特點可能也與這2種原因有關。

基因分化系數(shù)和基因流是衡量遺傳分化的重要指標(Nei，1987)，F(xiàn)st值為0.15～0.25時說明遺傳分化較大(Wright，1965)，基于線粒體cyt b序列的AMOVA分析結果顯示，大絨鼠各地理種群間遺傳分化指數(shù)為0.179 68～0.949 45，表明云南地區(qū)大絨鼠各地理種群間存在明顯的遺傳分化。大絨鼠7個地理種群間基因流為0.026 62～2.282 72，玉龍、祥云、劍川、大理4個地理距離較近種群組合之間的Nm值大于1之外，其他種群組合間均小于1，且值均較低，說明多數(shù)種群間基因流水平貧乏。在單倍型系統(tǒng)進化樹中，大絨鼠種群分化為4個地域分支，玉龍、祥云、劍川、大理為一分支，其他種群分別獨立為一支，在實際的地理位置中，玉龍、劍川、大理、祥云的地理距離較近，而騰沖、巧家、祿勸與其他幾個地區(qū)距離較遠。單倍型進化網絡關系圖顯示出與進化樹相同的結果，綜合研究結果表明大絨鼠已經出現(xiàn)了明顯的種群分化。

遺傳分化的程度會隨著地理距離的增加而增加(Floydetal.，2005)，IBD檢測結果顯示，F(xiàn)st與地理距離呈顯著正相關，大絨鼠種群間遺傳分化中49.0%的變異可以用地理隔離解釋，這表明種群間地理隔離對遺傳分化起重要作用，這可能與大絨鼠的遷移擴散能力較弱有關。云南氣候多樣，山川河流縱橫，地形地勢復雜，獨特的生境可能造成大絨鼠種群間的地理隔離，是否因地理隔離形成獨立的亞種還有待于進一步研究。

綜上所述，云南地區(qū)大絨鼠高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性，以及種群間高遺傳分化的遺傳結構特點，可能與其生物學特征和擴散能力等因素有關，同時地理距離隔離對其遺傳分化起了重要作用。然而，由于本研究僅用了線粒體cyt b基因作為分子標記，可能存在局限性，欲全面了解大絨鼠的遺傳多樣性、遺傳分化程度，還需要擴大大絨鼠采樣范圍，加入微衛(wèi)星、核基因等標記的分析，進一步研究。