陳沙，劉煥章，曹文宣，俞丹*

(1.大連海洋大學(xué)，遼寧大連116023；2.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430072)

透明帶(zona pellucida，ZP)是包圍在卵母細(xì)胞或早期胚胎外的一層糖蛋白，通常被稱為透明帶蛋白(ZP蛋白)，通常由3、4種糖蛋白組成，受ZP基因家族編碼表達(dá)(Goudetetal.，2008)。ZP基因中除ZP結(jié)構(gòu)域外，通常還包含N端信號(hào)肽序列、弗林蛋白酶切割位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)域、三葉草結(jié)構(gòu)域或EGF結(jié)構(gòu)域(Wassarman &Litscher，2004)。硬骨魚類基因組經(jīng)歷過特有的基因組復(fù)制，因此基因組上存在著大量的ZP蛋白編碼基因，被復(fù)制的基因在魚類中可能演化出新的功能，比如南極魚Patagonotothen ramsayi的ZP蛋白被證實(shí)是抗凍蛋白(馬戰(zhàn)領(lǐng)，2015；Caoetal.，2016)。除了抗凍功能，ZP蛋白在魚類中是否還有其他功能尚不清楚。

ZP2基因是ZP基因家族的重要成員，除了含有保守的三葉草結(jié)構(gòu)域和ZP結(jié)構(gòu)域外，還有1個(gè)富含脯氨酸(P)和谷氨酰胺(Q)殘基的N端重復(fù)結(jié)構(gòu)域(Wang &Gong，1999)。Lyons等(1993)克隆獲得了美洲擬鰈Pseudopleuronectes americanus的ZP2基因序列，發(fā)現(xiàn)其重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重復(fù)單元為(PQQPQQPQQPQQPKY)7。隨后，發(fā)現(xiàn)鯉Cyprinus carpio的重復(fù)單元為(QQTSQQFQPQKPA/V)13(Changetal.，1997)；稀有鯽Gobiocypris rarus的重復(fù)單元為(VQQQASQQFPQR/Q)(12～19)(Wuetal.，2012)；鯽Carassius auratus的重復(fù)單元為(QQPKQFPF/LQKPVP)7(史建伍，2014)。Wang和Gong(1999)首次在斑馬魚Daniorerio上克隆到了ZP2基因序列，但此基因沒有含P和Q的重復(fù)結(jié)構(gòu)域。同樣，在青鳉Oryzias latipes、日本鰻鱺Anguilla japonica中也沒有發(fā)現(xiàn)重復(fù)結(jié)構(gòu)域(Kanamorietal.，2003；Sanoetal.，2010)。已有研究表明，ZP2基因重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重復(fù)序列在受精后的谷氨酰胺的γ-羰基和賴氨酸的ε-氨基之間會(huì)形成分子間交聯(lián)，從而參與魚卵卵膜的硬化(Oppen-Berntsenetal.，1990；Giaccoetal.，2000)。但這些串聯(lián)重復(fù)單元是否具有其他功能尚不清楚，例如是否與魚類的產(chǎn)卵習(xí)性相關(guān)。

鯉形目Cypriniformes魚類約4 200種，是世界上最大的淡水魚類類群(Nelsonetal.，2016)，廣泛分布在除南極洲、南美洲和澳大利亞以外的世界各大洲。鯉形目魚類起源于193 Ma的侏羅紀(jì)(Taoetal.，2019)，并演化出了豐富多樣的產(chǎn)卵習(xí)性。例如，為適應(yīng)東亞季風(fēng)氣候的特點(diǎn)，鯉形目魚類演化出了產(chǎn)漂流性卵習(xí)性的類群，并成為了河流、湖泊的主體和特色類群，該類群在水位連續(xù)上漲、水流刺激時(shí)產(chǎn)卵，卵隨水漂流，孵化發(fā)育；相反，產(chǎn)粘性卵習(xí)性的類群繁殖喜歡穩(wěn)定的環(huán)境，受精卵粘附于植物等基質(zhì)上固著發(fā)育，水位上漲是產(chǎn)卵的刺激因素，多在近岸淺水處產(chǎn)卵；而產(chǎn)沉性卵習(xí)性類群的受精卵通常沉于水底發(fā)育，多在江河上游水質(zhì)清澈、砂礫地質(zhì)處產(chǎn)卵(解涵等，2010)。這種繁殖產(chǎn)卵方式的分化，對(duì)于魚類的物種多樣性的形成具有重要作用，但其相關(guān)的分子機(jī)制尚缺乏研究。Mansour等(2009)研究發(fā)現(xiàn)，糖蛋白是鯉卵表面具有粘性的主要原因，而編碼這類糖蛋白的正是ZP基因家族。因此，本研究將以鯉形目不同產(chǎn)卵習(xí)性的代表性魚類為研究對(duì)象，利用RT-PCR技術(shù)克隆ZP2基因，探討ZP2基因重復(fù)結(jié)構(gòu)域的變異與鯉形目魚類產(chǎn)卵習(xí)性的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究的克隆對(duì)象包含10種鯉形目魚類，其中，產(chǎn)漂流性卵7種、產(chǎn)粘性或沉性卵3種(表1)。此外，在GenBank上下載其他4種鯉形目魚類、美洲擬鰈和青鳉的ZP2基因作為外類群。

表1 鯉形目魚類的產(chǎn)卵習(xí)性及ZP2基因序列來(lái)源Table 1 Spawning types of Cypriniformes and GenBank accession numbers of ZP2 gene

1.2 總RNA提取和第一鏈cDNA合成

按照動(dòng)物組織RNA提取試劑盒操作流程提取卵巢和肝臟的總RNA。提取的總RNA直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體積為20 μL：總RNA為2 μL，Oligo(dt)18 Primer試劑1 μL和Nuclease-free水 9 μL，65 ℃ 5 min，然后向反應(yīng)產(chǎn)物加5×Reaction Buffer 4 μL、Ribolok RNase Inhibitor 1 μL、10 mmol·L-1dNTP Mix 2 μL和RevertAid Reverse Transcriptase 1 μL。最后在PCR儀中進(jìn)行42 ℃ 60 min，25 ℃ 5 min，70 ℃ 5 min。

1.3 ZP2基因克隆

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的其他魚類的ZP2基因序列設(shè)計(jì)了6對(duì)同源PCR引物(表2)，克隆10種鯉形目魚類的ZP2基因的cDNA序列。反應(yīng)體積為50 μL：16 μL Nuclease-free水，25 μL Buffer，1 μL dNTP，正、反引物各2 μL，1 μL Super Fidelity DNA Polymerase和3 μL cDNA。擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，目的片段送生工生物工程(上海)股份有限公司克隆測(cè)序。

表2 本研究相關(guān)的引物Table 2 Primers used in this study

1.4 ZP2基因生物信息學(xué)分析

將克隆獲得的cDNA序列在NCBI作BLAST比對(duì)分析，通過在線軟件ExPASy推測(cè)不同ZP2基因的開放閱讀框，使用在線軟件EMBOSS explorer預(yù)測(cè)氨基酸序列。利用ExPASy分析ZP2基因的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等特征，使用在線軟件SMART分析氨基酸序列結(jié)構(gòu)，并用DNAMAN對(duì)得到的序列進(jìn)行同源性分析。采用在線工具SOPMA分析ZP2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及各成分的占比。通過Phyre2同源建模預(yù)測(cè)ZP2的三維結(jié)構(gòu)模型。利用MEGA 7.0采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建魚類ZP2基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。最后，通過EasyCodeML檢測(cè)ZP2基因的受選擇壓力情況，用非同義替代率(nonsynonymous substitution rate，dN)與同義替代率(synonymous substitution rate，dS)的比值ω(ω=dN/dS)估算選擇壓力(Gaoetal.，2019)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZP2基因序列分析

根據(jù)RT-PCR方法，克隆擴(kuò)增獲得了10種鯉形目魚類的ZP2基因的cDNA全長(zhǎng)序列。同時(shí)獲得了完整的開放閱讀框，序列全長(zhǎng)1 254～1 734 bp，編碼了417～577個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為45.556～63.729 kDa，理論等電點(diǎn)為4.78～5.86(表3)。

表3 ZP2基因的序列信息Table 3 Sequence information of ZP2 gene

2.2 ZP2基因結(jié)構(gòu)分析

10種鯉形目魚類的ZP2基因均含有N端信號(hào)肽序列、三葉草結(jié)構(gòu)域、ZP結(jié)構(gòu)域和弗林蛋白酶切割位點(diǎn)，但都不含跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1)。產(chǎn)粘性卵魚類的重復(fù)結(jié)構(gòu)域中含有重復(fù)次數(shù)較多的重復(fù)單元(7～19次)，如團(tuán)頭魴(15次)、稀有鯽(12～19次)，每個(gè)物種的重復(fù)單元序列存在差異(圖1；表4)。產(chǎn)漂流性卵和產(chǎn)沉性卵魚類不含重復(fù)結(jié)構(gòu)域或重復(fù)單元重復(fù)次數(shù)較少(2～5次)，如：翹嘴鲌、銀、光唇蛇、鳊、銀鲴和寬鰭重復(fù)單元重復(fù)次數(shù)較少；犁頭鰍、似鳊和蒙古鲌不含重復(fù)結(jié)構(gòu)域。

表4 ZP2基因重復(fù)結(jié)構(gòu)域的重復(fù)單元及重復(fù)次數(shù)Table 4 Repeat unit and its number in the repeat domain of ZP2 gene

2.3 ZP2氨基酸序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

根據(jù)克隆獲得的ZP2基因氨基酸序列，分析鯉形目魚類的ZP2基因的同源性(圖2)。所有物種的ZP2氨基酸序列包含了18個(gè)保守的半胱氨酸殘基(6個(gè)位于三葉草結(jié)構(gòu)域中、12個(gè)位于ZP結(jié)構(gòu)域中)。ZP2氨基酸保守區(qū)域集中在N端信號(hào)肽序列、三葉草結(jié)構(gòu)域和ZP結(jié)構(gòu)域(圖2)。團(tuán)頭魴與鳊的相似性最高(99.7%)，斑馬魚和鯽的相似性最低(71.2%)。以美洲擬鰈和青鳉作為外類群，在系統(tǒng)發(fā)育樹上，所有鯉形目魚類的ZP2氨基酸序列構(gòu)成一個(gè)單系(圖3)，其中斑馬魚單獨(dú)為一支，位于系統(tǒng)樹的基部位置，與其他鯉形目魚類形成姐妹群。

2.4 ZP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過SPOMA對(duì)不同鯉形目魚類的ZP2蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明：二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(10.58%～27.38%)、β-轉(zhuǎn)角(2.05%～3.60%)、延伸鏈(18.37%～26.79%)和無(wú)規(guī)則卷曲(49.61%～63.49%)組成，不同物種間的各成分所占比例各不相同(表5)，不同物種的ZP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)具有一定的差異(圖4)。

表5 10種鯉形目魚類的ZP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù)Table 5 Secondary structure parameters of ZP2 protein of 10 Cypriniformes species

2.5 ZP2蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

通過Phyre2同源建模得到了鯉形目魚類ZP2蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，不同物種的置信度均為100%，均顯示最大程度與數(shù)據(jù)庫(kù)中的小鼠MusmusculusZP2晶體結(jié)構(gòu)模板匹配，預(yù)測(cè)模型與模板匹配相似度為38%～41%。構(gòu)建三維模型時(shí)，不同物種的入模氨基酸范圍和數(shù)目存在差異，且入模的氨基酸也存在變異位點(diǎn)(表6)，進(jìn)而導(dǎo)致不同物種的三維結(jié)構(gòu)存在細(xì)微的差異(圖5)。

表6 10種鯉形目魚類的ZP2蛋白三維結(jié)構(gòu)建模相關(guān)參數(shù)Table 6 Three-dimensional structural parameters of ZP2 protein in 10 Cypriniformes species

2.6 ZP2基因選擇壓力分析

利用位點(diǎn)模型的M1a和M2a、M7和M8，分支模型的two-ration和one-ration，分支-位點(diǎn)模型的model A和model A-null對(duì)魚類的ZP2基因進(jìn)行正向壓力選擇分析(表7)。結(jié)果表明，M0模型中，所有位點(diǎn)的平均ω為0.21，魚類的ZP2基因整體受到純化選擇的影響；分支模型(two-ration)和M0模型中，似然比檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)，說明ZP2基因的氨基酸位點(diǎn)經(jīng)歷了不同的選擇壓力；M1a和M2a似然比檢驗(yàn)差異不顯著(P>0.05)，認(rèn)為有79%的位點(diǎn)受到純化選擇(ω=0.11)，而其他位點(diǎn)處于中性進(jìn)化狀態(tài)；M7和M8似然比檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)，表明大部分位點(diǎn)受到正向選擇(ω=1.91)，位點(diǎn)的概率經(jīng)過BEB檢驗(yàn)，總共檢驗(yàn)出 9個(gè)后驗(yàn)概率大于0.5的正選擇氨基酸位點(diǎn)(8 V 0.864、19 L 0.648、43 P 0.835、97 R 0.813、132 G 0.553、258 R 0.612、320 A 0.600、344 T 0.787、350 V 0.950)，其中第350位的氨基酸位點(diǎn)(350 V)在5%的置信水平顯著，后驗(yàn)概率為95%；在分支-位點(diǎn)模型的檢測(cè)中，將鯉形目魚類指定為前景分支，似然比檢驗(yàn)在備擇假設(shè)和零假設(shè)中沒有顯著差異(P>0.05)，沒有檢驗(yàn)到正向選擇位點(diǎn)。

表7 EasyCodeML計(jì)算的各個(gè)模型的似然值及參數(shù)Table 7 Likelihood values and parameters of each model calculated by EasyCodeML

3 討論

3.1 鯉形目代表性魚類的ZP2基因結(jié)構(gòu)特性

本研究發(fā)現(xiàn)10種鯉形目魚類的ZP2基因結(jié)構(gòu)均符合ZP基因家族的特征，含有保守的N端信號(hào)肽序列、三葉草結(jié)構(gòu)域、ZP結(jié)構(gòu)域和弗林蛋白酶切割位點(diǎn)。ZP2基因是ZP基因家族的重要成員之一，它含有許多參與ZP蛋白分泌和組裝的保守功能域。其中,N端信號(hào)肽序列可以使正在翻譯的核糖體附著到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上合成并分泌蛋白(Blobel，1975);三葉草結(jié)構(gòu)域的功能在于抗蛋白的水解消化(Bork，1993);ZP結(jié)構(gòu)域是ZP蛋白的主要功能結(jié)構(gòu)域，由大約260個(gè)氨基酸殘基組成，其中ZP2基因的ZP結(jié)構(gòu)域有10個(gè)保守的半胱氨酸殘基，半胱氨酸殘基之間的二硫鍵對(duì)ZP結(jié)構(gòu)域的立體折疊和蛋白之間的相互作用有著決定性的作用，起著聚合作用，可以參與ZP蛋白聚合成高階結(jié)構(gòu)，如纖維和基質(zhì)，此外，ZP結(jié)構(gòu)域通常包含著ZP-N和ZP-C結(jié)構(gòu)合成纖維，ZP-C總是與ZP-N相關(guān)聯(lián)，并且可能具有其他重要的功能，如調(diào)節(jié)不同亞基之間特異性的相互作用；弗林蛋白酶切割位點(diǎn)主要參與ZP蛋白的分泌，在哺乳動(dòng)物中，它可以啟動(dòng)蛋白質(zhì)的聚合和組裝(Bork &Sander，1992；Jovineetal.，2002，2004，2005，2006；Sasanamietal.，2006；Kanaietal.，2010)。本研究克隆獲得的10種鯉形目魚類的ZP2基因均含有上述4種結(jié)構(gòu)域。此外，在本研究中發(fā)現(xiàn)10種鯉形目魚類均不含跨膜結(jié)構(gòu)域，有研究認(rèn)為魚類的ZP蛋白最初是具有跨膜結(jié)構(gòu)域的，但在進(jìn)化過程中丟失了，但所有哺乳動(dòng)物的ZP蛋白均包含1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域的作用是錨定ZP蛋白到細(xì)胞膜上進(jìn)行組裝(Wassarman &Litscher，2004；Sanoetal.，2010)。ZP2基因結(jié)構(gòu)在哺乳動(dòng)物和魚類中的差異暗示著ZP蛋白在哺乳動(dòng)物和魚類中的功能存在不同。

3.2 鯉形目代表性魚類ZP2基因的重復(fù)結(jié)構(gòu)域

分析目前所有已獲得的鯉形目魚類ZP2基因序列，發(fā)現(xiàn)不同物種間存在較大的序列長(zhǎng)度差異(1 254～1 734 bp)，該差異主要來(lái)源于重復(fù)結(jié)構(gòu)域的有無(wú)及重復(fù)單元和重復(fù)次數(shù)的不同，即是否存在串聯(lián)重復(fù)序列或串聯(lián)重復(fù)序列的長(zhǎng)度是否存在差異，由此導(dǎo)致鯉形目魚類的ZP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組分及其空間結(jié)構(gòu)存在一定的差異?；虻闹貜?fù)結(jié)構(gòu)域研究受到越來(lái)越多的關(guān)注。Charlesworth等(1994)已經(jīng)證明重復(fù)序列可直接參與重組。當(dāng)重組發(fā)生在重復(fù)結(jié)構(gòu)域的不同位置時(shí)，姐妹染色單體之間或同源染色體之間會(huì)發(fā)生不均勻的交換，從而導(dǎo)致重復(fù)結(jié)構(gòu)域的延長(zhǎng)和縮短(Changetal.，1997)。但不是所有物種都有重復(fù)結(jié)構(gòu)域，缺少重復(fù)結(jié)構(gòu)域可能是該結(jié)構(gòu)域的二次缺失，相反，重復(fù)結(jié)構(gòu)域也可能發(fā)生平行或趨同進(jìn)化，明顯不一致的重復(fù)結(jié)構(gòu)域的存在表明它們的快速進(jìn)化，重復(fù)單元可以通過DNA的復(fù)制或連續(xù)不均勻交叉而形成或消除，但是重復(fù)結(jié)構(gòu)域的作用與功能需要進(jìn)一步研究(Lewin，2000；Kanamorietal.，2003)。重復(fù)序列能參與遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變、基因調(diào)控以及細(xì)胞分化等過程，有的還可以直接編碼蛋白質(zhì)(王劍波，蔣左庶，1992)。一般來(lái)說，具有重復(fù)序列的基因容易發(fā)生缺失，缺失是基因組進(jìn)化差異的主要驅(qū)動(dòng)力之一，因?yàn)橹貜?fù)序列的缺失可能會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，Guo等(2012)通過對(duì)HOMOLENS數(shù)據(jù)庫(kù)中斑馬魚、三刺魚Gasterosteus aculeatus、青鳉、紅鰭東方鲀Takifugu rubripes、綠河鲀Tetraodon nigroviridis的分析，發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列的缺失對(duì)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)有著很大的影響；也可能通過改變翻譯閱讀框來(lái)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的功能發(fā)生變化(Raes &Peer，2005)。魚卵粘性的產(chǎn)生是一個(gè)緩慢、持續(xù)時(shí)間最少為5 min的生理過程，皮層小泡釋放的糖蛋白(主要由ZP基因家族編碼)參與了卵粘性的生成(Chang &Huang，2002；Gallianoetal.，2003；Mansouretal.，2009)。此外，卵子在受精后，卵膜隨后會(huì)發(fā)生硬化，有研究認(rèn)為卵膜的硬化可分為2步：首先金屬蛋白酶水解ZP2的N端脯氨酸和谷氨酰胺(Pro-Gln)區(qū)域，其次谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶會(huì)催化水解ZP2和ZP3發(fā)生分子交聯(lián)(Sugiyama &Iuchi，2000；Shibataetal.，2012)。Wu等(2012)也認(rèn)為重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)可以影響硬骨魚卵膜的硬度，重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)越多，卵膜就越堅(jiān)硬。本研究通過比較鯉形目代表性魚類重復(fù)結(jié)構(gòu)域中重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)，發(fā)現(xiàn)其重復(fù)結(jié)構(gòu)域與其產(chǎn)卵習(xí)性存在一定程度的相關(guān)性，例如產(chǎn)漂流性卵(7種)和產(chǎn)沉性卵魚類(3種)不存在重復(fù)結(jié)構(gòu)域或重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)較少(2～5次)，而產(chǎn)粘性卵魚類(4種)的重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)較多(7～19次)，推測(cè)產(chǎn)漂流性卵和產(chǎn)沉性卵魚類中ZP2基因重復(fù)結(jié)構(gòu)域的缺失影響了魚卵粘性的形成及卵膜硬化。鯉形目中，產(chǎn)漂流性卵魚類有50余種，本研究獲得了7種典型的代表性魚類，包括翹嘴鲌(鲌亞科Culterinae)、鳊(鲌亞科)、銀鲴(鲴亞科Xenocyprininae)、似鳊(鲴亞科)、銀(亞科Gobioninae)、光唇蛇(亞科)和犁頭鰍(平鰭鰍科Balitoridae)，約占產(chǎn)漂流性卵類群的14%，但產(chǎn)沉性卵和粘性卵的物種數(shù)較少，因此不同物種重復(fù)結(jié)構(gòu)域的差異是否引起了ZP2蛋白空間結(jié)構(gòu)的差異并導(dǎo)致了產(chǎn)卵習(xí)性的不同還需要進(jìn)一步功能實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。

3.3 鯉形目魚類ZP2基因的選擇壓力

突變、遺傳變異、選擇和基因流是自然生物進(jìn)化的主要?jiǎng)恿?沈銀柱，黃占景，2012)。在選擇壓力檢驗(yàn)中，非同義突變與同義突變的比值(ω=dN/dS)被用于衡量基因或者其中個(gè)別位點(diǎn)是否受到選擇壓力(Yang &Nielsen，1998)。不導(dǎo)致氨基酸改變的核苷酸變異被稱為同義突變，反之為非同義突變。一般認(rèn)為，同義突變不受自然選擇，而非同義突變則受到自然選擇作用。在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，選擇壓力不可能均勻地作用于1個(gè)基因，根據(jù)其功能作用，它更有可能在某些特定位點(diǎn)發(fā)生(Kamath &Getz，2011)。在硬骨魚中，有關(guān)卵膜和精子相互作用的證據(jù)很少，ZP蛋白在精卵結(jié)合中可能沒有起到作用，因?yàn)榫又荒芡ㄟ^珠孔進(jìn)入卵子，卵膜中任何與精子結(jié)合的分子都會(huì)聚集在珠孔周圍，但是沒有跡象表明ZP蛋白在魚卵的珠孔周圍，魚類的ZP蛋白可能只起到了結(jié)構(gòu)性作用，如保護(hù)功能(Conner &Huang，2003)。ZP蛋白家族通常包含大量的ZP基因(Xuetal.，2012)。ZP基因家族在硬骨魚類中產(chǎn)生了不同程度的擴(kuò)張，如斑馬魚中可分離出21個(gè)ZP基因，有研究認(rèn)為，斑馬魚ZP基因的大量擴(kuò)張可能與其需要大量產(chǎn)卵有關(guān)(Conner &Hughes，2003)；雅羅魚Leuciscus waleckii基因組可鑒定出 30個(gè)ZP基因，ZP基因的擴(kuò)張?jiān)鰪?qiáng)了雅羅魚在堿性環(huán)境中胚胎發(fā)育的保護(hù)能力，這些擴(kuò)張均被正向選擇驅(qū)動(dòng)(Xuetal.，2017；吳天利，2018)。此外，南極魚的ZP基因在寒冷條件下大量擴(kuò)張，有助于豐富ZP蛋白的轉(zhuǎn)錄本和增加卵膜的厚度，從而被認(rèn)為是防止冰滲透的關(guān)鍵物理屏障，使南極魚可以適應(yīng)極端的低溫環(huán)境(Chenetal.，2008；馬戰(zhàn)領(lǐng)，2015)。但是，胎生月光魚Xiphophorus maculatus的ZP基因家族在正選擇下相對(duì)減少，因?yàn)檫@些ZP蛋白對(duì)胚胎的保護(hù)不再是必要因素，而是進(jìn)化出了氣體和物質(zhì)交換的機(jī)制(Schartletal.，2013)。

本研究基于位點(diǎn)模型分析，發(fā)現(xiàn)鯉形目魚類的ZP2基因中存在正選擇的氨基酸位點(diǎn)(ω>1)，表明ZP2基因在鯉形目魚類演化中同樣經(jīng)歷了正向選擇，但ZP基因在鯉形目魚類中是否經(jīng)歷擴(kuò)張還需要對(duì)該類群進(jìn)行更深層次的研究。

致謝：感謝中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所張富鐵老師、陳林、秦強(qiáng)在野外采集的樣本，感謝張智和張曉宇在實(shí)驗(yàn)上提供的幫助。