李 娟,張 彤，龍 麗

(1.綿陽(yáng)師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621000；2.綿陽(yáng)市安州生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)站，四川綿陽(yáng) 622651)

0 引言

人工合成色素的檢測(cè)方法有高效液相色譜法[1-5]、薄層色譜法[6]、紫外-可見(jiàn)分光光度法[7]、液一質(zhì)聯(lián)用法[8]等.很多方法包括前處理只適用于檢測(cè)基質(zhì)比較簡(jiǎn)單的食品[9-10]，對(duì)于一些蛋白質(zhì)含量高且基質(zhì)復(fù)雜的食品(如：海產(chǎn)品，腌制蔬菜等)卻不能準(zhǔn)確測(cè)定其中的含量，而國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中合成著色劑的測(cè)定》 (GB/T 5009. 35-2003)[4]中規(guī)定的高效液相色譜法、薄層色譜法和示波極譜法來(lái)測(cè)定色素，這些方法前處理步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)，成本高.

為了方便檢測(cè)不同飲料中檸檬黃、胭脂紅和日落黃的含量，本文建立了同時(shí)檢測(cè)以上3種合成色素的方法，該方法適用于各類(lèi)不同飲料中日落黃、檸檬黃和胭脂紅的測(cè)定，適用范圍廣、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、成本低且重復(fù)性好.

1 日落黃、檸檬黃、胭脂紅的介紹和含量測(cè)定的研究現(xiàn)狀

1.1 日落黃、檸檬黃、胭脂紅的簡(jiǎn)介

日落黃(sunset yellow，簡(jiǎn)稱(chēng) SY)[11](圖1-1)，又名食用黃色5號(hào)(日本)、食用黃色3號(hào)、橘黃、夕陽(yáng)黃、晚霞黃，是一種水溶性偶氮類(lèi)著色劑.化學(xué)名稱(chēng)為1-(4′-磺基-1′-苯偶氮)-2-萘酚-6-磺酸二鈉鹽，分子式為C16H10N2Na2O7S2，相對(duì)分子質(zhì)量452.37，是一種常用的人工食用色素，性質(zhì)穩(wěn)定，價(jià)格較低，廣泛用于食品和藥物的著色..

檸檬黃又稱(chēng)酒石黃、肼黃[12](圖1-2).分子式為C16H9N4O9S2Na3，化學(xué)名稱(chēng)為1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三鈉鹽，食用檸檬黃外觀為橙黃色粉末，微溶于酒精，不溶于其他有機(jī)溶劑.主要生產(chǎn)原料為對(duì)氨基苯磺酸及酒石酸，由對(duì)氨基苯磺酸經(jīng)重氮化，與1-(4-磺基苯基)-3-羧基-5-吡唑啉酮在堿性溶液中偶合、精制而成.大多用于食品、飲料、藥品、化妝品、飼料、煙草、玩具、食品包裝材料等的著色，也可以用于羊毛、蠶絲的染色.

胭脂紅，又名食用赤色102號(hào)(日本)、食用紅色7號(hào)、麗春紅4R、大紅、亮猩紅[13](圖1-3)，為水溶性偶氮類(lèi)著色劑.分子式為C22H20O13，化學(xué)名稱(chēng)為1-(4′-磺酸基-1′-萘偶氮)-2-萘酚-6,8-二磺酸三鈉鹽，是莧菜紅的異構(gòu)體.胭脂紅(Ponceau 4R)是目前我國(guó)使用最廣泛、用量最大的一種單偶氮類(lèi)人工合成色素.胭脂紅作為食品色素可用于果汁飲料、配制酒、碳酸飲料、糖果、糕點(diǎn)、冰淇淋、酸奶等食品的著色，而不能用于肉干、肉脯制品、水產(chǎn)品等食品中，主要是為了防止一些不法分子通過(guò)使用色素將不良的原料肉如變質(zhì)肉的外觀掩蓋起來(lái)，欺騙消費(fèi)者.

圖1 日落黃Fig.1 The sample of sunset yellow圖2 檸檬黃Fig.2 The sample of tartrazine圖3 胭脂紅Fig.3 The sample of carmine

1.2 日落黃、檸檬黃、胭脂紅含量測(cè)定的研究現(xiàn)狀

檸檬黃、日落黃、胭脂紅色素是世界上最常用的合成食用色素，在飲料調(diào)色方面起著至關(guān)重要的作用.而作為廣泛應(yīng)用于飲料中的合成食用色素，消費(fèi)者對(duì)這些色素的超標(biāo)使用和食品安全也越來(lái)越關(guān)注，推動(dòng)研究學(xué)者們不斷地對(duì)這幾種色素的測(cè)定進(jìn)行研究.

劉奮等介紹了用高效液相色譜法配合DAD檢測(cè)器對(duì)檸檬黃、胭脂紅、日落黃含量進(jìn)行測(cè)定的方法[14]，流動(dòng)相為甲醇和0.02 mol/L乙酸銨，梯度洗脫.針對(duì)各種合成色素的不同出峰時(shí)間，分別選用其最佳檢測(cè)波長(zhǎng)檢測(cè)，大大提高檢測(cè)靈敏度，并有效克服了在254 nm處的梯度洗脫時(shí)造成的基線漂移，提高了定量準(zhǔn)確性.

林壯森等介紹了采用分光光度法檢測(cè)飲料中檸檬黃和日落黃的方法[15-16]，通過(guò)測(cè)定飲料在426 mm和482 nm波長(zhǎng)處的吸光度，與檸檬黃和日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液比較，計(jì)算樣品中檸檬黃和日落黃的含量.

Medeiros等采用摻硼金剛石電極結(jié)合流動(dòng)注射分析，實(shí)現(xiàn)了對(duì)飲料和明膠樣品中4種合成色素(檸檬黃、日落黃、亮藍(lán)和SY)的同時(shí)檢測(cè)[17].

2 液相色譜法測(cè)定三種色素含量的實(shí)驗(yàn)原理

日落黃、檸檬黃、胭脂紅均具有苯磺酸鈉結(jié)構(gòu)，本文選用Cleanert PWAX-SPE混合型弱陰離子交換柱和Cleanert PA聚酰胺小柱，用以吸附不同飲料中的合成著色劑，選用氨化甲醇洗脫，采用Venusil? XBP C185 μm 4.6×150 mm，以0.02 mol/L乙酸銨溶液和色譜純甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫，最后再經(jīng)反相色譜分離.根據(jù)保留時(shí)間進(jìn)行定性和比較峰面積進(jìn)行定量.這種方法濃縮時(shí)間短，適用于大批量樣品的同時(shí)檢測(cè).

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 實(shí)驗(yàn)藥品

甲醇(分析純佛山予華儀器科技有限公司、色譜純西安天茂化工有限公司)；乙醇、甲酸、檸檬酸、氨水(優(yōu)級(jí)純佛山予華儀器科技有限公司)；乙酸銨(色譜純西安天茂化工有限公司)；檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、日落黃標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)500 μg/mL)深圳市時(shí)得佳科技有限公司)；超純水(該實(shí)驗(yàn)所用水均為超純水).

3.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

賽默飛高效液相色譜儀(UltiMate3000美國(guó)賽默飛世爾熱電儀器有限公司)；PH計(jì)(PHS-25型北京合悅達(dá)科技有限公司)；圓形水浴氮吹儀(CM-36型北京成萌偉業(yè)科技有限公司)；多管真空固相萃取儀(5982-9110安捷倫科技(中國(guó))有限公司)；固相萃取柱(Cleanert PWAX杭州賽析科技有限公司)；溶劑過(guò)濾器(AL-01北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司)

3.3 實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)所需條件如下所示：

家長(zhǎng)不了解學(xué)生在校的心理情況，學(xué)校通常在學(xué)生發(fā)生了一些重大的意外情況，如學(xué)生突發(fā)心理危機(jī)事件、嚴(yán)重人際沖突、學(xué)籍異動(dòng)、嚴(yán)重違反校規(guī)校紀(jì)乃至觸犯法律等，為了解決危機(jī)，事后才通知家長(zhǎng)[2]。家長(zhǎng)的參與具有被動(dòng)性和臨時(shí)性。

色譜柱：Venusil? XBP C185 μm 4.6×150 mm；流速：1.0 mL /min；進(jìn)樣量：20 μL；波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：35 ℃.

3.4 實(shí)驗(yàn)步驟

3.4.1 樣品提取 用分析天平分別稱(chēng)取市售10 g(精確至0.000 1g)茶類(lèi)飲料(康師傅冰紅茶、和其正)、果蔬汁類(lèi)飲料(統(tǒng)一鮮橙多、農(nóng)夫果園30%混合果蔬)、碳酸飲料(芬達(dá)、美年達(dá))、功能飲料(東鵬特飲、樂(lè)虎)放入100 mL燒杯中，含二氧化碳的樣品(芬達(dá)、美年達(dá))先加熱以除去二氧化碳.

3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制 配制不同濃度的日落黃、檸檬黃、胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)系列溶液.

3.4.3 固相萃取柱凈化 Cleanert PWAX-SPE在全自動(dòng)固相萃取儀中，依次向Cleanert PWAX-SPE小柱中加入6 mL甲醇，6 mL pH=6的水，完成SPE小柱的凈化過(guò)程.將全部提取液轉(zhuǎn)移到柱子中，然后再用6 mL水 (pH=4)、6 mL甲醇-甲酸溶液(6∶4) 和6 mL水 (pH=6) 淋洗；然后通入空氣約5 min吹干小柱，最后用6 mL 2% 氨化甲醇洗脫并接收洗脫液，將洗脫液置于圓形水浴氮吹儀中，在50 ℃水浴中用氮?dú)獯蹈?，? mL超純水溶解并定容，經(jīng)0.45 μm水系濾器過(guò)濾到樣品瓶中，供HPLC待測(cè).

3.4.4 測(cè)定 取相同體積的樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別置于高效液相色譜儀中按照3.3所示的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)保留時(shí)間定性，外標(biāo)峰面積定量.

4 結(jié)果與討論

4.1 溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照3.3所示的實(shí)驗(yàn)條件，將日落黃、檸檬黃、胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液注人液相色譜儀中，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，得到日落黃標(biāo)準(zhǔn)系列濃度與峰面積的關(guān)系，黃標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4、5、6所示.

圖4 日落黃標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.4 Standard curve of sunset yellow圖5 檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.5 Standard curve of lemon yellow圖6 胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.6 Standard curve of carmine red

4.2 各合成色素測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)

根據(jù)3.3設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件測(cè)得日落黃、檸檬黃、胭脂紅在設(shè)定濃度范圍內(nèi)，具有線性關(guān)系良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，日落黃、檸檬黃、胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2.

4.3 三種合成色素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖7 日落黃、檸檬黃、胭脂紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.7 Chromatogram of mixed standard solution of sunset yellow, tartrazine, and carmine

4.4 樣品中三種合成色素的測(cè)定與結(jié)果

4.4.1 樣品中日落黃的測(cè)定與結(jié)果 取3.5.3處理好的樣品液，在波長(zhǎng)為254 nm處測(cè)定其的峰面積，平行測(cè)定三次，取平均值.結(jié)果如表5所示：

表5 飲料中日落黃的含量表Tab.5 Content table of sunset yellow in beverage

由表5可知，不同類(lèi)飲料中，果蔬汁類(lèi)飲料(統(tǒng)一鮮橙多、農(nóng)夫果園30%混合果蔬)中日落黃含量較茶類(lèi)飲料(康師傅冰紅茶、和其正)、碳酸飲料(芬達(dá)、美年達(dá))和功能飲料(東鵬特飲、樂(lè)虎)的高，但均遠(yuǎn)小于《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB2760-1996)中規(guī)定的最大使用量.

4.4.2 樣品中檸檬黃的測(cè)定與結(jié)果 取3.5.3處理好的樣品液，在波長(zhǎng)為254 nm處測(cè)定其的峰面積，平行測(cè)定三次，取平均值.結(jié)果如表6所示：

表6 飲料中檸檬黃的含量表Tab.6 Content table of tartrazine in beverage

由表6可知，不同類(lèi)飲料中，果蔬汁類(lèi)飲料(統(tǒng)一鮮橙多、農(nóng)夫果園30%混合果蔬)中檸檬黃含量比茶類(lèi)飲料(康師傅冰紅茶、和其正)、碳酸飲料(芬達(dá)、美年達(dá))和功能飲料(東鵬特飲、樂(lè)虎)的高，但均遠(yuǎn)小于《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB2760-1996)中規(guī)定的最大使用量.

4.4.3 樣品中胭脂紅的測(cè)定與結(jié)果 取3.5.3處理好的樣品液，在波長(zhǎng)為254 nm處測(cè)定其的峰面積，平行測(cè)定三次，取平均值.結(jié)果如表7所示：

表7 飲料中胭脂紅的含量表Tab.7 Content table of carmine in beverage

由表7可知，不同類(lèi)飲料中，果蔬汁類(lèi)飲料(統(tǒng)一鮮橙多、農(nóng)夫果園30%混合果蔬)中檸檬黃含量比茶類(lèi)飲料(康師傅冰紅茶、和其正)、碳酸飲料(芬達(dá)、美年達(dá))和功能飲料(東鵬特飲、樂(lè)虎)的高，但均遠(yuǎn)小于《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB2760-1996)中規(guī)定的最大使用量.

4.4.4 日落黃、檸檬黃、胭脂紅的加標(biāo)回收率和精密度測(cè)定 為了驗(yàn)證該方法的可靠性，進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn).準(zhǔn)確稱(chēng)取不含日落黃、檸檬黃、胭脂紅的不同類(lèi)飲料10 g (精確至0.0001 g)，分別加入濃度為0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定7次，以此來(lái)驗(yàn)證該方法的回收率和精密度，其結(jié)果如表8所示：

表8 加標(biāo)回收率和精密度測(cè)定結(jié)果表(n=7)Tab.8 Results of standard recovery rate and precision measuring (n=7)

由表8可知日落黃、檸檬黃、胭脂紅的平均加標(biāo)回收率為82.8%～102.36%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.65%～1.32%.

5 結(jié)論

本文選用Cleanert PWAX-SPE 混合型弱陰離子交換柱和Cleanert PA聚酰胺小柱，用以吸附不同飲料中的合成著色劑，選用氨化甲醇洗脫，采用Venusil? XBP C18 5 μm 4.6×150 mm，以0.02 mol/L乙酸銨溶液和色譜純甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫，最后再經(jīng)反相色譜分離.根據(jù)保留時(shí)間定性和比較峰面積進(jìn)行定量得出：在市售常見(jiàn)的幾類(lèi)飲料中，果蔬汁類(lèi)中日落黃、檸檬黃、胭脂紅的含量較另外種類(lèi)飲料的含量要高.其中茶類(lèi)飲料中，康師傅冰紅茶的日落黃含量為0.002 7 g/kg、檸檬黃含量為0.002 9 g/kg、胭脂紅含量為0.002 9 g/kg；和其正的日落黃、檸檬黃、胭脂紅含量均為未檢出.果蔬汁類(lèi)飲料中，鮮橙多的日落黃含量為0.003 2 g/kg、檸檬黃含量為0.002 5 g/kg、胭脂紅含量為0.001 1 g/kg；農(nóng)夫果園30%混合果蔬的日落黃含量為0.003 5 g/kg、檸檬黃含量為0.003 2 g/kg、胭脂紅含量為0.003 0 g/kg.碳酸飲料中，芬達(dá)的日落黃含量為0.001 1 g/kg、檸檬黃含量為0.000 5 g/kg、胭脂紅含量未檢出；美年達(dá)的日落黃含量為0.000 2 g/kg、檸檬黃含量為0.000 2 g/kg、胭脂紅含量未檢出.功能飲料中，東鵬特飲和樂(lè)虎三種合成色素含量均為未檢出.

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，果蔬汁類(lèi)飲料中合成色素較其他三類(lèi)飲料相比含量最多，其中農(nóng)夫果園30% 混合果蔬的三種合成色素都是最高的.而在日落黃、檸檬黃、胭脂紅這三種合成色素種，日落黃、檸檬黃含量相對(duì)較高，胭脂紅含量最少.同時(shí)在這幾類(lèi)飲料中，日落黃、檸檬黃、胭脂紅的含量都遠(yuǎn)小于其檢出限和中國(guó)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的最大使用量，說(shuō)明這些飲料的色素添加要求都是符合中國(guó)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的.