劉 洪，董元華，隋躍宇，李建剛

（1中國科學院南京土壤研究所，土壤環(huán)境與污染修復重點實驗室，南京 210008；2中國科學院大學，北京 100049；3中國科學院東北地理與農業(yè)生態(tài)研究所，黑土區(qū)農業(yè)生態(tài)重點實驗室，哈爾濱 150081）

0 引言

甜菜作為制糖原料，是中國主要的糖料作物之一，其生產在國民經濟中占有重要地位。中國甜菜的種植區(qū)域大部分集中在北方，主要是東北、西北和華北地區(qū)[1]。但由于品種、栽培管理、種植方式以及施肥方式中存在諸多誤區(qū)，導致土壤質量下降，甜菜的土傳病害嚴重，從而引起較大的經濟損失。甜菜的病害主要有立枯病、褐斑病、根腐病、叢根病、白粉病等[2]，其中根腐病是一種世界性病害，發(fā)病嚴重，是由土壤中的尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)侵染所致，使植物根腐爛變褐受到損傷，對甜菜生長造成不利影響，從而降低甜菜的產量和品質，嚴重時甚至直接導致甜菜死亡，造成絕收[3]。近年來，抗病品種選育是防治甜菜根腐病的有效技術，本文從微生物角度出發(fā)來探究抗病品種的抗病機理，為從多角度闡述抗病品種的抗病機制，推動抗病育種工作的開展提供理論支持。

從20世紀90年代以來，育種學家們就利用植物遺傳特性（抗病品種的抗性基因）來促進植物的生長發(fā)育以及其對生物與非生物脅迫的耐受性[3-5]。盡管人們越來越了解根際微生物群對植物的有益作用，但很少考慮到根際相關性狀與植物品種之間的關系[6-7]。土壤微生物是影響土壤健康的重要因素，是植物抵抗病原菌的主要驅動力[8]。研究發(fā)現，植物可能依賴其根際微生物群作為抵御病原物入侵的第一道防線[9-11]。根際微生物組是植物的第二基因組，在植物健康生長中具有重要的作用[12-14]，植物根際的微生物可能為寄主植物提供一些有益的功能，如養(yǎng)分獲取、非生物脅迫和生物脅迫（抵御病害）[4,9]。有研究發(fā)現抗尖孢鐮刀菌的黃瓜品種根際細菌群落組成和結構在品種上有較大差異[15]。因此，品種除了影響根際微生物群落組成與結構，也會影響其根際微生物群的功能。

本研究以抗病型甜菜(PT)和感病型甜菜(ST)2個甜菜品種為試驗對象，從土壤微生物的角度，研究抗性品種甜菜對病原真菌尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)的抗性以及其對根際細菌和真菌的微生物群落組成、結構以及功能的影響。綜上所述，本研究通過分析不同甜菜品種以及不同發(fā)病程度甜菜中土壤微生物群落組成、結構以及功能的變化，以期獲得抗性品種、發(fā)病程度和有益微生物相互間的耦合關系，以揭示甜菜抗病品種產生抗性的土壤微生物學機制。

1 材料與方法

1.1 試驗地情況

試驗地位于黑龍江省哈爾濱市中國農業(yè)科學院甜菜研究所甜菜種植基地(46°00.176′N，126°38.438′E)，試驗于2015年4月開始，并于10月采集樣品。該基地常年連作甜菜，土傳病害嚴重，經鑒定為由鐮刀菌(Fusariumoxysporum)引起的根腐病。該地每年每公頃肥料用量為普通尿素(N：46%)120 kg、重過磷酸鈣(P2O5：46%)90 kg、硫酸鉀(K2O：50%)90 kg。

1.2 試驗設計與樣品采集

為了檢測品種對根際微生物的影響作用，本研究選取了抗病型品種‘甜研309’和感病型品種‘ST21916’，由于田間抗病品種不易發(fā)病，而感病型品種的病害嚴重度高，為進一步確定根際土壤中微生物的變化是由甜菜品種還是發(fā)病程度引起的，本研究從抗病品種中篩選到了根腐病發(fā)生較重的甜菜樣本（田塊間病情指數為60%）和根際土壤，同時也從感病型品種中采集了根腐病發(fā)生較輕的樣本（田塊間病情指數達為10%），以進一步確認引起根際微生物變化的主導因素是品種還是病害嚴重度。因此本研究選取4種樣品，記作：（1）抗病品種且發(fā)病較輕(PTL)；（2）抗病品種但發(fā)病嚴重(PTH)；（3）感病型品種但發(fā)病較輕(STL)；（4）感病型品種且發(fā)病嚴重(STH)。為了采集甜菜根際土壤，我們隨機挑取4種樣品各3株，抖下根上附著的松散的土壤，然后用毛刷刷下緊密附著于根上的土壤，將其視為根際土壤，做好標記并置于干冰中保存，運輸至實驗室。同時，對應地采集塊狀土風干后過篩，以測定土壤理化性質。

1.3 土壤理化性質測定

土壤化學性質的測定參照魯如坤[16]的方法進行。土壤pH值采用電位法測定（水:土=2.5:1），土壤有機碳(SOC)采用重鉻酸鉀氧化——容量法測定，全氮(TN)采用凱氏定氮法測定，全磷(TP)采用碳酸鈉熔融法測定，全鉀(TK)采用氫氧化鈉熔融法測定，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮（NO3--N和NH4--N）采用2 M KCl浸提—靛酚藍比色法測定，有效磷(AP)采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測定，速效鉀(AK)采用乙酸銨浸提—火焰光度法測定。

1.4 根際土壤DNA的提取和高通量測序

稱取0.5 g新鮮土壤樣品用FastDNA?SPIN Kit for Soil試劑盒（MP Biomedicals，美國）進行DNA提取，具體方法和步驟參照試劑盒說明書進行。采用特異性引 物 515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)對細菌16S rRNA基因的V4～V5區(qū)進行擴增，以及用真菌ITS特異性引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGA AGTAA-3′) 和 ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGA TGC-3′)對真菌ITS1區(qū)進行擴增。PCR反應體系包括：Premix Tap DNA聚合酶(5 U/μL)25 μL，正、反向引物(20 mg/L)各0.5 μL，DNA模板(20 mg/L)1 μL，雙蒸水補至50 μL。PCR擴增條件為：95℃預變性5 min；(94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 45 s)×35 個循環(huán)；72℃10 min。PCR產物用JET quick PCR產物純化試劑盒（GenomedGmbh，美國）純化，而后使用Illumina MiSeq PE 250高通量測序平臺進行測序。

1.5 高通量測序數據分析

利用Illumina MiSeq PE 250高通量測序平臺得到的雙端序列數據用QIIME軟件進行分析[17]。首先將具有相同Barcode引物的序列歸為一類樣品。將高通量測序得到的原始序列進行拼接，拼接時堿基重疊數不得少于20個，堿基配對錯誤率為0。拼接后去除q值（質量分數）低于25的低質量序列，用UCLUST對保留的高質量序列按97%的相似度進行聚類，得到細菌序列的可操作分類單元(OUT，Operational taxonomic units)，選擇每個OTU中數量最多的序列作為該OTU的代表序列。用RDP Classifier將OTU代表序列與Silva的16S rRNA基因數據庫進行比對，比對可信度為0.8，生成具有物種豐度信息的OTU表用于后續(xù)分析。高通量測序的原始數據保存在NCBI Sequence Read Archive(SRA)數據庫，登記號為PRJNA642360和PRJNA642355。

1.6 數據處理

土壤化學性質、優(yōu)勢菌（平均相對豐度＞1%）相對豐度、細菌多樣性指標采用單因素方差分析、Duncan多重比較來判斷差異顯著性。采用非度量多維度分析(NMDS，Non-metric multidimensional scaling)[18]揭示不同品種和不同致病狀態(tài)下微生物群落結構的差異，并用3種不同的統(tǒng)計方法(PERMANOVA、ANOSIM、MRPP)對不同品種和不同發(fā)病程度對微生物群落的影響的顯著性分析，以判斷差異是否達到顯著水平(P＜0.05)。采用STAMP (Statisticalanalysis of metagenomic profiles)分析[19]揭示不同處理之間的顯著差異物種。利用FUNGuild(1.0)軟件對真菌的功能進行比對。組間差異的顯著性分析使用SPSS 20.0中的獨立t檢驗完成。NMDS、PERMANOVA、MRPP和ANOSIM分析使用R軟件(Version 3.6.3)的vegan包完成，STAMP分析使用STAMP軟件完成。柱狀圖利用Origin 2016制作。顯著性檢驗水平均為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 土壤的基本化學性質

不同品種及不同發(fā)病狀態(tài)甜菜的土壤理化性質存在差異（表1），PTL和STL的酸堿度分別為pH 6.55和pH 6.69，而PTH和STH分別為pH 6.91和pH 7.03。與PTL樣品相比，PTH、STL、STH樣品中的有機碳、全磷、銨態(tài)氮和有效磷含量均顯著下降(P＜0.05)，其中STH樣品的下降幅度尤為明顯。而土壤中的全鉀和硝態(tài)氮的含量在STH樣品中顯著高于PTL、PTH和STH樣品（表1）。綜上，發(fā)病嚴重甜菜中有更高的pH、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、有效鉀，而全氮對品種效應更為敏感。

表1 土壤基本理化性質

2.2 根際土壤微生物的群落組成

本研究對所有土壤樣品進行16S rRNA和ITS高通量測序，在經過質控和陰性對照去除后，16S rRNA基因和ITS基因分別保留了412899和130404條原始序列?；?7%的相似性，所有樣本中細菌和真菌的總OTU數目分別為7232和3052。圖1顯示了不同品種和不同發(fā)病狀態(tài)甜菜根際土壤中細菌和真菌群落在門分類水平的組成。在土壤細菌中，放線菌(Actinobacteria)、變形菌(Proteobacteria)、綠灣菌(Chloroflexi)、酸桿菌(Acidobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)是前5位的優(yōu)勢門。而在真菌中，其優(yōu)勢門為子囊菌(Ascomycota)、擔子菌(Basidiomycota)、被孢霉菌(Mortierellomycota)。

圖1 4種樣品根際土壤的細菌(A)和真菌(B)的優(yōu)勢門的相對豐度

基于門分類水平下的土壤優(yōu)勢微生物的相對豐度在不同品種和不同發(fā)病狀態(tài)下具有明顯差異（圖1）。對細菌而言，同一品種下，與發(fā)病嚴重樣品相比，發(fā)病較輕的樣品中放線菌門(Actinobacteria)、綠灣菌(Chloroflexi)和酸桿菌(Acidobacteria)的相對豐度明顯較高，而變形菌(Proteobacteria)和擬桿菌(Bacteroidetes)的變化則恰好相反；而在同一發(fā)病狀態(tài)下，品種對細菌組成的影響較小，與感病型品種相比，抗病品種中厚壁菌的相對豐度更高。對于真菌，同一品種下，與發(fā)病嚴重樣品(H)相比，發(fā)病較輕的品種(L)中具有較高豐度的子囊菌(Ascomycota)、擔子菌(Basidiomycota)和被孢霉菌(Mortierellomycota)，而在同一致病狀態(tài)下，與細菌不同，品種對真菌的影響相對較高，其中，抗病型品種中有較高豐度的擔子菌門，而子囊菌門的豐度相對較少。由此可見，發(fā)病程度和品種因素確實能夠影響土壤中的優(yōu)勢細菌和真菌群落組成。

2.3 根際土壤微生物的多樣性與群落結構

本研究比較了不同品種和不同發(fā)病程度甜菜根際土壤細菌和真菌群落的多樣性（表2）。對于細菌，抗病品種中發(fā)病較輕的甜菜根際樣品(PTL)的多樣性略高，但并未達到顯著(P＞0.05)。相似地，對于真菌，抗病品種和感病型品種中發(fā)病較輕的甜菜的根際樣品（PTL與STL）中的多樣性均略高于發(fā)病嚴重甜菜的樣品，但并未達到顯著(P＞0.05)，而物種豐富度明顯較高(P＜0.05)，同樣地，與細菌相似，不同品種甜菜的根際真菌間的多樣性差異不大，說明發(fā)病較輕的甜菜根際細菌和真菌的多樣性高于發(fā)病嚴重的甜菜。

表2 4種根際土壤樣品中的細菌與真菌的alpha多樣性

基于OTU水平的微生物群落的非度量多維度分析(NMDS)結果顯示，不同發(fā)病程度和不同品種之間的細菌和真菌群落結構顯著分異（圖2）。對于細菌，不同發(fā)病程度的細菌群落能夠沿著NMDS1顯著區(qū)分(Stress=0.043，ANOSIM:R=0.5957，P=0.001)，而不同品種的細菌群落能夠沿著NMDS2大致區(qū)分。同時，真菌群落也呈現出相似的規(guī)律，不同發(fā)病程度和不同品種的甜菜的土壤根際真菌群落能夠分別沿著NMDS1和NMDS2很好的區(qū)分(Stress=0.097，ANOSIM:R=0.6296，P=0.001)。進一步基于bray-curtis距離的3種統(tǒng)計方法分析結果表明不同發(fā)病程度的甜菜其根際土壤具有明確區(qū)分的細菌群落和真菌群落(P＜0.05)，而不同品種的土壤細菌群落和真菌群落結構均沒有顯著差異(P＞0.05)。

表3 利用3種統(tǒng)計方法對不同品種和不同發(fā)病狀態(tài)之間對微生物群落的影響的顯著性分析

圖2 4種樣品（不同品種和不同發(fā)病程度）根際土壤的細菌(A)與真菌(B)的非度量多維度分析(NMDS)

2.4 顯著差異物種

不同品種和不同發(fā)病程度下甜菜根際細菌和真菌群落結構有所差異。進一步，我們對在屬水平上細菌和真菌群落組成進行STAMP分析（圖3）。對于細菌，在不同發(fā)病程度上，與發(fā)病較重(H)樣品相比，發(fā)病較輕樣品(L)顯著增加了未分類的酸桿菌綱屬、芽孢桿菌(Bacillus)、Gaiella、RB41、紅色桿菌屬(Rubrobacter)、未分類的放線菌綱屬、鏈霉菌屬(Streptomyces)、類諾卡氏屬(Nocardioides)的相對豐度，而顯著降低了Devosia、根瘤菌屬(Rhizobium)、亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)、慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)以及未分類的幾丁質綱(g__norank_f__Chitinophagaceae)等的相對豐度；而從品種上來看，抗病型品種的根際土壤中富集了黃單胞菌(Flavobacterium)、假單胞菌(Pseudomonas)、節(jié)桿菌(Arthrobacter)、未分類的酸桿菌綱屬、芽孢桿菌(Bacillus)、紅色桿菌屬(Rubrobacter)，但并未達到顯著(P＞0.05)。對于真菌，與發(fā)病較重(H)樣品相比，發(fā)病較輕樣品(L)中Pyxidiophora的相對豐度明顯較低，而顯著增加了鏈格孢屬(Alternaria)、Tausonia、假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus)和未分類的子囊菌綱屬(g__unclassified_c__Sordariomycetes)的相對豐度；此外，與抗病型品種相比，感病型樣品中尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)得到了明顯富集，這與上文中感病型品種甜菜發(fā)病嚴重的結果相吻合。

圖3 基于STAMP分析的4種樣品（不同品種和不同發(fā)病程度）中的根際差異細菌屬(A、B)與真菌屬(C、D)

2.5 功能差異

發(fā)病較輕的甜菜根際樣品中富集了較多的有益細菌，如芽孢桿菌、鏈霉菌和放線菌等，而感病型甜菜根際樣品中則富集了較多的病原真菌(F.oxysporum)。為探究不同品種和不同發(fā)病程度甜菜根際微生物群落組成變化引起的功能差異，我們對其真菌功能群進行了分析。FUNGuild是一種由ecological guild分析真菌群落功能的一種數據庫，本研究比較了不同品種甜菜和不同發(fā)病程度的甜菜根際土壤真菌群落的功能差異。首先在品種上，感病型甜菜根際樣品中有較多的植物病原菌以及一些腐生型和寄生型植物病原菌；進一步，在發(fā)病狀態(tài)上，與發(fā)病較輕的樣品相比，發(fā)病嚴重樣品中有較多的植物病原菌（圖4）。

圖4 真菌根際微生物群生態(tài)功能預測

3 結論

本文對不同品種、不同發(fā)病程度的甜菜根際微生物進行了深入分析，證實了品種改變了根際微生物群落的組成、結構與功能，這有助于抗性品種抵御病原菌侵染。土傳病害的發(fā)生也能夠影響土壤微生物群落的組成、結構與功能。植物根際會通過主動招募特定微生物群來作為第一道防線以抵御病原菌的入侵，而抗病品種能夠更好地促進這一過程的進行。本研究結果強調了根際微生物群落在抗病育種中的重要性。未來的研究將需要進一步驗證抗病品種募集特定微生物的通路以及在抑制病原菌中的作用，以更好地為抗性育種對土傳病害的防治提供理論支撐。

4 討論

甜菜作為中國的重要糖類作物，在中國農業(yè)生產中占據重要地位。然而，隨著集約化生產的進行，在一味追求經濟效益的同時，各種作物表現出了嚴重的土傳病害現象，從而反過來造成了巨大的經濟損失以及土壤的持續(xù)性退化，而甜菜正是其中的典型土傳病害作物之一。針對這一現象，植物育種學家們從植物遺傳發(fā)育的角度上研制出了抗病品種進行生產的改進。長期以來，作物抗病品種的投入大大地改善了植物的生長發(fā)育和健康，作物抗病品種的投入使用大大改善了植物的生長發(fā)育和健康，并在實際生產中減輕了作物病害的發(fā)生，但是抗病品種對土壤微生物群落的潛在影響尚未考慮到。研究表明，植物病害與土壤微生物群落組成、多樣性、功能的變化及其相互作用有關[8,20-22]。在這里，我們通過高通量測序研究了甜菜抗病品種對病原菌(F.oxysporum)的抗性以及不同發(fā)病程度對根際微生物群落的組成、結構和功能的影響?；贏NOSIM的結果，在不同品種和不同發(fā)病程度甜菜樣品中，其土壤細菌和真菌群落明顯不同（圖2）。類似的結果在其他人的研究中也有報道[23]。因此，探討不同品種和不同發(fā)病程度根際土壤微生物群落組成、結構、功能和多樣性的差異具有重要意義。

在本研究中，發(fā)病較輕的甜菜根際土壤微生物（細菌、真菌）和抗病型甜菜根際土壤真菌的多樣性略高，這與有健康植物的根際土壤具有較高的多樣性高的報道是一致的[24-25]。根腐病發(fā)病嚴重的植株根際微生物群落多樣性的降低，很可能是尖孢鐮刀病菌在土壤根際群落的種間競爭中占據優(yōu)勢地位，并逐漸成為優(yōu)勢種，而相應的部分有益菌則可能因為競爭力較弱而被淘汰，從而物種數目減少，多樣性降低。多樣性較高的土壤微生物群落反過來降低土傳病害爆發(fā)的幾率，因為更多樣化的微生物群落比一個簡單的微生物群落更不易受到病原體的入侵[26-27]。土壤微生物群落中較低的多樣性與對微生物群落變化的較高敏感性有關，而微生物群落變化實質上是改變了微生物群落結構。植物的健康程度確實能顯著影響甜菜的細菌和真菌的微生物群落結構(P＜0.05)，但品種的差異對根際土壤微生物群落結構影響小于發(fā)病對微生物群落的影響（圖2）。因此可以推測，植物病原菌能夠迅速定殖在感病型品種的甜菜根際，而通過遺傳育種法選育出的抗病品種植物則能通過被動或主動來募集一些有益微生物來抵御病害[25]，從而起到防治病害的效果。

除群落多樣性和結構外，不同品種和不同發(fā)病程度的甜菜根際微生物群落組成也存在差異。雖然抗病品種和發(fā)病較輕的根際土壤樣品中微生物多樣性僅僅只是略高于感病型品種和發(fā)病嚴重樣品中的微生物多樣性，但其能抑制作物根際病原菌的定殖并促進特定微生物的富集，從而構建特異的微生物群落結構。研究表明，植物根際在抵御病害時常作為第一道防線，能夠招募一些有益微生物來抵御[9]，而抗性品種能夠招募更多的有益微生物。與本文相似，我們發(fā)現在發(fā)病較輕的甜菜根際樣品中富集了較多的芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、放線菌以及酸桿菌屬等。而在抗性品種中的黃單胞菌、假單胞菌、節(jié)桿菌、酸桿菌綱屬、芽孢桿菌、紅色桿菌屬的相對豐度較高。這類似于先前的報告[28]。研究表明，節(jié)桿菌能夠較好地防治病原真菌尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)引起的植物病害[29]，而假單胞菌、芽孢桿菌、紅色桿菌常與生物施肥、促進根系生長與修復、以及抑制非生物脅迫和植物病害緊密聯系[30-33]。而對于真菌，抗病品種中的尖孢鐮刀菌的相對豐度明顯低于感病品種。這個結果與FUNGuild分析一致，即感病型品種甜菜根際中具有更多的植物病原型真菌。通常，病原真菌通過攻擊宿主來獲取營養(yǎng)，以維持其自身生長，導致植物根系組織遭到破壞，進而使病原菌能更加順利地從根系對甜菜進行侵染，最終導致甜菜發(fā)病，產生負面影響[34]。我們推測，除了作物本身的遺傳特性外，抗性品種還能夠更好地通過招募有益的微生物群來抵御病原菌的侵染。