范永芳，徐 碩，張 昭，于 晶，魏雪蘋，賀利宏

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193）

0 引言

蕓香科黃檗屬植物黃檗為傳統(tǒng)意義上的雌雄異株植物。但筆者在2018年首次發(fā)現(xiàn)了多株雌雄同株黃檗，稱之為兩性植株，此前未曾有過關(guān)于黃檗性別可塑性報(bào)道。這些兩性植株主干在幼年時(shí)上端死亡，于15.8～30.7 cm處分杈，形成不同性別的分枝，雌枝平均周長31.1 cm，雄枝平均周長23.2 cm。經(jīng)過連續(xù)3年觀察，發(fā)現(xiàn)不同性別分枝性別表達(dá)穩(wěn)定，未發(fā)生性別轉(zhuǎn)換。之前也有少量的研究報(bào)道過在雌雄異株居群中發(fā)現(xiàn)罕見的兩性植株個(gè)體，兩性植株個(gè)體的性別表達(dá)方式多為在雄株上發(fā)現(xiàn)少量雌花，如胡楊[1]、銀杏[2]、連香樹[3]和紅豆杉[4]；或是雄花和雌花無規(guī)律的分布在植株上，如黃連木[5]。筆者所發(fā)現(xiàn)的兩性黃檗的性別表達(dá)方式與上述有所不同，不同性別分枝的性別表達(dá)方式在以往研究中也未見報(bào)道，兩性黃檗植株的發(fā)現(xiàn)豐富了植物性別表達(dá)方式的多樣性。

兩性黃檗植株主干均較短，分枝分化為不同性別?？赡苁怯捎诒本┒咎鞖飧衫鋵?dǎo)致幼苗上部干枯，側(cè)芽分化為不同性別而形成的。筆者推測，黃檗的性別由表觀遺傳方式?jīng)Q定，在年幼時(shí)植株可能不存在性別，在一定的樹齡才分化出性別，不同的分枝分化為不同的性別，這在植物中還未曾報(bào)道過。但在動物研究中早就發(fā)現(xiàn)，低等動物中的兩棲類和魚類，在生長發(fā)育的某一階段形成性別并維持穩(wěn)定，如蜥蜴、鱷魚和龜鱉，在孵化前的某一時(shí)期受溫度影響并以表觀遺傳的方式分化出不同的性別[6-7]。也有可能黃檗在年幼時(shí)已有性別分化，但性別表達(dá)并不穩(wěn)定，在一定樹齡時(shí)穩(wěn)定表達(dá)，不同分枝穩(wěn)定表達(dá)為不同性別。如槭樹等植物在樹齡較小時(shí)植株偏向于雄性表達(dá)，較大時(shí)偏向于雌性表達(dá)[8-10]。兩性植株黃檗的發(fā)現(xiàn)，為研究植物性別決定與分化提供了新的思路和材料。

黃檗的兩性植株在同一植株上同時(shí)擁有大量的雄花和雌花，可以克服較遠(yuǎn)距離花粉傳播的困難，這對于黃檗野生資源保護(hù)和種群恢復(fù)具有重要意義。黃檗曾遍布于歐亞及美洲大陸，幾經(jīng)變遷后龜縮于亞洲東部部分地區(qū)[11-12]，根據(jù)《中國植物志》記載，現(xiàn)黃檗主要分布于中國東北地區(qū)、華北部分省區(qū)及朝鮮、日本和俄羅斯[12]。在20世紀(jì)時(shí)野生黃檗資源遭到了濫砍亂伐，棲息地受到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致野生資源零星分布，集中分布面積極小[11,13-14]。根據(jù)張志鵬的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)野生黃檗主要分布在長白山、張廣才嶺和小興安嶺南部等地，較之原來的數(shù)據(jù)，分布范圍進(jìn)一步縮小[14-15]。調(diào)查還發(fā)現(xiàn)野生黃檗分布呈現(xiàn)嚴(yán)重的碎片式和零星化，在燕山、千山、長白山、張廣才嶺和小興安嶺5條山脈的38個(gè)樣點(diǎn)中僅發(fā)現(xiàn)966株野生黃檗，平均種群密度只有25.4株/(km·m)[15]。這種分布模式對于雌雄異株的黃檗而言，花粉遠(yuǎn)距離傳播障礙難以克服，不利于繁衍和種群的自我更新。黃檗作為第三紀(jì)古熱帶植物區(qū)系孑遺植物，對于研究物種進(jìn)化、古植物區(qū)系以及古氣候變化有重要意義[14,16-17]，且黃檗是大宗藥材“關(guān)黃柏”的基源植物和優(yōu)良的木材原料，對于經(jīng)濟(jì)的發(fā)展也有重要意義，因此保護(hù)黃檗資源刻不容緩。黃檗已經(jīng)先后被列入《中國珍稀瀕危保護(hù)植物名錄》和《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》，成為國家級保護(hù)物種[18]，有關(guān)部門已經(jīng)對野生黃檗采取了強(qiáng)有力的保護(hù)措施。但由于野生資源的嚴(yán)重破壞，其繁衍和自我更新面臨極大困難[11,19-20]。兩性植株的出現(xiàn)可以彌補(bǔ)這一缺失，克服黃檗碎片式分布導(dǎo)致的授粉困難[11,14,21]，在一定程度上有利于野生黃檗植株進(jìn)行成功的有性繁殖，使筆者對野生黃檗種群恢復(fù)增加了更多的希望。

繁殖是生物生存的關(guān)鍵[22]，兩性黃檗植株能否和雄株和雌株一樣正常執(zhí)行雄性功能和雌性功能具有重要意義，也為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)，因此筆者分別對兩性植株的雄性功能和雌性功能進(jìn)行了研究?；ǚ酆椭^在有性繁殖中具有重要作用，是傳粉系統(tǒng)的重要組成[23]，其表觀形態(tài)對授粉具有較大的影響，筆者首先對黃檗兩性植株花粉和柱頭的形態(tài)和花粉活力進(jìn)行觀察。并于2019年和2020年連續(xù)2年通過人工授粉和自然受粉方式，對兩性植株雄性繁殖能力、雌性繁殖能力和自交繁殖能力3個(gè)方面進(jìn)行評估，以描述兩性植株的繁殖能力。

1 材料與方法

1.1 材料

兩性黃檗植株為北京藥用植物園(40.03°N；116.27°E)保育黃檗個(gè)體。研究涉及4株個(gè)體，2株為2005年北京種源播種，2株為1999年從吉林省移植；對照植株均為同源保育材料中的單性植株個(gè)體。物種由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所張昭研究員鑒定為蕓香科黃檗屬植物黃檗(PhellodendronamurenseRupr.)。實(shí)驗(yàn)在北京藥用植物研究所中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，于2018年5月—2020年10月進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 兩性植株雄性功能研究

（2）花粉形態(tài)觀察。將干燥后的花粉置于金屬靶上，JFC-1600離子濺射儀鍍金膜，用JSM-6510LV掃描電子顯微鏡以合適的倍數(shù)觀察花粉形態(tài)和表面紋飾，測量花粉極軸和赤道軸長度。兩性植株和雄株花粉各測量49個(gè)。每種花粉選取10個(gè)×200倍數(shù)的視野，觀察并記錄正?；ǚ酆突位ǚ鄣臄?shù)量，計(jì)算花粉的畸形率。

（3）花粉活力檢測。固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法觀察花粉萌發(fā)率，采用肖美林等人的培養(yǎng)基：10%蔗糖+0.008%硼酸+0.02%硝酸鈣+5g/L瓊脂[24]；用毛筆蘸取花粉，均勻涂抹在培養(yǎng)基表面，放入25℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察。共設(shè)置光照、黑暗和光照/黑暗(2h/2h)3種培養(yǎng)條件處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。在體視顯微鏡下觀察，每個(gè)培養(yǎng)皿選取5個(gè)視野，觀察并記錄花粉萌發(fā)情況，計(jì)算花粉萌發(fā)率。

（4）雄性繁殖能力研究。分別在2019年和2020年通過人工授粉方式，花粉為雌株授粉，以雄株花粉為對照，統(tǒng)計(jì)果實(shí)和種子數(shù)量判斷兩性植株雄性繁殖能力。在開花前2日給雌花序套袋，從雌花序第一朵花開放開始，每日進(jìn)行授粉，直至最后一朵花授粉后結(jié)束，在群體花期結(jié)束后去袋。兩性植株花粉共授粉51個(gè)花序，1785朵雌花；雄株花粉共授粉51個(gè)花序，1954朵雌花。果實(shí)成熟時(shí)采摘果序，記錄果實(shí)數(shù)以及單果中種子數(shù)。

1.2.2 兩性植株雌性功能研究

（1）柱頭形態(tài)觀察：采集花蕾期、開花1天和開花2天的雌花，F(xiàn)AA固定液[25]固定。梯度乙醇脫水，乙醇-叔丁醇逐級替換直至100%叔丁醇，ALPHA2-4LD PLUS冷凍干燥器干燥[25-27]，干燥后的柱頭于金屬靶上，JFC-1600離子濺射儀鍍金膜，用JSM-6510LV掃描電子顯微鏡以合適的倍數(shù)觀察柱頭形態(tài)，并拍照記錄，以雌株的柱頭為對照進(jìn)行比較。

（2）雌花繁殖能力研究：分別在2019年和2020年，通過人工授粉的方式，以雄株花粉為兩性植株的雌花和雌株的花授粉，授粉方式同上。兩性植株授粉19個(gè)花序，762朵雌花；雌株授粉19個(gè)花序，680朵雌花。待果實(shí)成熟后采摘果序，記錄果實(shí)數(shù)以及單果中種子數(shù)。

目前洋地黃毒苷臨床已很少應(yīng)用，所以市面上很難買到。為保留該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，我們對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)。用維拉帕米（鈣通道阻滯劑，臨床主要用于治療心律失常）[4]作為取代藥，以異丙腎上腺素為工具藥來區(qū)分普萘洛爾和維拉帕米對心臟的抑制作用及其作用機(jī)制。

2020年采集兩性植株和雌株于自然受粉條件下生長的果序進(jìn)行比較，記錄開花數(shù)、果實(shí)數(shù)以及單個(gè)果實(shí)中種子數(shù)，兩性植株采摘19個(gè)果序，共767個(gè)果實(shí)，雌株采摘19個(gè)果序，共672個(gè)果實(shí)。

1.2.3 兩性植株自交繁殖能力研究 分別在2019年和2020年，通過人工授粉的方式，以兩性植株的花粉對該植株雌花進(jìn)行授粉，共授粉19個(gè)花序，523朵花；以雄株花粉對兩性植株雌花授粉為對照，共授粉19個(gè)花序，762朵花，授粉方式如上，待果實(shí)成熟后采摘果序，記錄果實(shí)數(shù)以及單果中種子數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 使用Excel和SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩性植株雄性功能研究

2.1.1 花粉形態(tài) 共觀察654個(gè)兩性植株花粉，760個(gè)雄株花粉，發(fā)現(xiàn)花粉均為單粒三溝花粉，萌發(fā)溝延伸到兩極，赤道面觀呈長圓形，極面觀呈三葉圓形（圖1）。根據(jù)王開發(fā)等[28]對花粉形狀類型的分類標(biāo)準(zhǔn)，這2種花粉均屬于長球形(1.14＜P/E＜2)?；ǚ弁獗诒痪W(wǎng)狀紋飾覆蓋，并有點(diǎn)狀凸起裝飾網(wǎng)格內(nèi)部。

圖1 兩性植株和雄株花粉的亞顯微結(jié)構(gòu)

隨機(jī)選擇兩性植株和雄株花粉各49個(gè)，測量花粉極軸和赤道軸長，詳見表1。兩性植株花粉極軸長平均為40.93±1.75 μm，赤道軸長平均為22.67±1.21 μm，P/E值平均為1.81±0.10。雄株花粉的極軸長平均為40.89±1.76 μm，赤道軸長平均為22.81±1.27 μm，P/E值平均為1.80±0.12。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，2種花粉在極軸長、赤道軸長和P/E上均沒有差異，因此兩性植株花粉在大小上與雄株花粉發(fā)育情況相同。

觀察并記錄10個(gè)視野中總花粉數(shù)量和畸形花粉數(shù)量，詳見表1。兩性植株花粉的畸形率平均為13.89±5.31%，雄株花粉的畸形率平均為10.02±3.80%。通過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，兩性植株花粉的畸形率與雄株花粉相比沒有差異，兩種花粉發(fā)育的水平相當(dāng)。

表1 花粉形態(tài)觀察結(jié)果

2.1.2 花粉活力 在光照、黑暗和光照/黑暗3種環(huán)境下觀察花粉的萌發(fā)率（詳見表2）。兩性植株花粉在3種條件下的萌發(fā)率分別為23.23±8.17%、34.30±11.47%、26.13±9.95%，黑暗中花粉的萌發(fā)率較高；雄株花粉在3種條件下萌發(fā)率沒有差異，分別為25.50±14.45%、26.73±14.64%、25.60±16.10%。在光照和光照/黑暗條件下兩性植株花粉的萌發(fā)率與同一條件下的雄株花粉沒有差異，但在黑暗條件下，兩性植株花粉的萌發(fā)率明顯高于雄株花粉。因此，兩性植株花粉的活力在光照和光照/黑暗條件下與雄株花粉在同一水平，在黑暗條件下則高于雄株花粉。

表2 兩性植株與雄株花粉萌發(fā)率比較 %

2.1.3 雄性繁殖能力 用兩性植株花粉給雌株授粉，共授粉51個(gè)花序，1785朵花，采收到1563個(gè)果實(shí)；用雄株花粉給雌株授粉，共授粉51個(gè)花序，1954朵花，采收到1767個(gè)果實(shí)（詳見表3）。兩性植株花粉授粉的得果率平均為86.69±13.90%，雄株花粉授粉的得果率平均為87.72±15.78%，兩種花粉授粉后的得果率沒有差異。

表3 兩性植株雄性繁殖能力評估

在種子數(shù)量上，對376個(gè)兩性植株雄花授粉和雄株花粉授粉所得果實(shí)的種子進(jìn)行計(jì)數(shù)，兩性植株授粉共得到1301個(gè)種子，單果種子數(shù)平均為3.46±1.18；雄株花粉授粉共得到1410個(gè)種子，單果種子數(shù)平均為3.75±1.13。兩性植株花粉所育果實(shí)中平均種子數(shù)比雄性植株花粉所育果實(shí)中平均種子數(shù)少0.28，明顯少于雄株。

上述結(jié)果說明，兩性植株花粉在花粉的形態(tài)和得果率方面與雄株花粉沒有差異，但在所育果實(shí)中種子數(shù)明顯少于雄株花粉，兩性植株花粉在產(chǎn)生后代的數(shù)量上略差?？傮w而言，兩性植株能夠成功執(zhí)行雄性功能，具有繁殖能力，但在產(chǎn)生后代數(shù)量的能力上略差。

2.2 兩性植株的雌性功能研究

2.2.1 柱頭形態(tài) 通過掃描電鏡對不同開花天數(shù)的21個(gè)柱頭進(jìn)行了觀察，其中兩性植株柱頭11個(gè)，雌株柱頭10個(gè)。觀察發(fā)現(xiàn)，兩種柱頭表面形態(tài)相似（如圖2），柱頭呈近五邊形，表面由乳突細(xì)胞組成，花蕾期和開花初期可觀察到兩類乳突細(xì)胞，一類細(xì)胞飽滿，頂端不平整，另一類細(xì)胞不飽滿，頂端向下凹陷，表面具有浸出物。隨著開花天數(shù)的增加，兩性植株和雌株的柱頭整體形態(tài)不發(fā)生改變，乳突細(xì)胞隨時(shí)間形態(tài)有所改變，飽滿的乳突細(xì)胞頂端逐漸凹陷，點(diǎn)狀凸起和表面浸出物逐漸增多。

圖2 兩性植株和雌株柱頭的顯微結(jié)構(gòu)

兩性植株柱頭和雌株柱頭形態(tài)基本一致，但雌株柱頭乳突細(xì)胞從飽滿到凹陷的時(shí)間較快，在開花2天的柱頭上基本無飽滿乳突細(xì)胞存在，浸出物也多于兩性植株柱頭。乳突細(xì)胞形態(tài)的變化與功能是否存在關(guān)聯(lián)以及花粉在兩類乳突細(xì)胞上的萌發(fā)和生長是否存在差異需要進(jìn)一步的觀察。

2.2.2 雌性繁殖能力 用雄株花粉分別對兩性植株和雌株的雌花進(jìn)行人工授粉，分別授粉19個(gè)花序。兩性植株共授粉762朵花，采收到697個(gè)果實(shí)；雌株共授粉680朵花，采收到636個(gè)果實(shí)（詳見表4）。兩性植株得果率平均為91.30±8.51%，雌株得果率平均為91.56±7.98%，二者不存在差異。筆者還對兩性植株和雌株自然受粉花序的結(jié)果狀況進(jìn)行了觀察，分別觀察了19個(gè)花序，兩性植株的得果率平均為95.69±3.80%，雌株的得果率平均為87.30±17.61%，二者之間同樣不存在差異。

表4 兩性植株雌性繁殖能力評估

在種子數(shù)量上，對人工授粉的182個(gè)果實(shí)的種子進(jìn)行計(jì)數(shù)，兩性植株共得到729個(gè)種子，單果種子數(shù)平均為4.01±0.91；雌株共得到685個(gè)種子，單果種子數(shù)平均為3.68±1.16，兩性植株顯著高于雌株。分別對自然受粉兩性植株和雌株的233個(gè)果實(shí)的種子進(jìn)行計(jì)數(shù)，兩性植株共得到924個(gè)種子，單果種子數(shù)平均為3.97±1.07；雌株共得到862個(gè)種子，單果種子數(shù)平均為3.70±1.21，兩性植株同樣顯著高于雌株。

在人工授粉條件下，花粉充盈，通常而言后代應(yīng)多于或等于自然受粉。在本實(shí)驗(yàn)中，雌株在人工授粉和自然受粉條件下，得果率和單果種子數(shù)均無顯著差異。兩性植株在人工授粉條件下的得果率顯著小于自然受粉，單果種子數(shù)沒有顯著差異。差異的產(chǎn)生可能與光照有光，相對自然受粉，人工授粉的花序位于植株的下端，不如自然受粉的花序接受陽光充足，或許導(dǎo)致果實(shí)的發(fā)育不如上端的花序。

由上可知，兩性植株柱頭的形態(tài)和發(fā)育過程與雌株基本一致，在人工授粉和自然受粉2種條件下，兩性植株能夠產(chǎn)生與雌株相差無幾的果實(shí)，且單果種子數(shù)高于雌株，表明兩性植株柱頭的可授性可能要強(qiáng)于雌株。因此，兩性植株雌性不僅能夠成功繁殖后代，而且在產(chǎn)生后代數(shù)量的能力上要高于雌株。

2.3 兩性植株自交繁殖能力研究

為了考察兩性植株的自交繁殖能力，筆者對兩性植株進(jìn)行自株授粉和異株授粉（詳見表5），分別為19個(gè)花序，自株授粉523朵花，采集到475個(gè)果實(shí)；異株授粉762朵花，采集到697個(gè)果實(shí)。兩性植株自交得果率平均為88.01±11.86%，異交得果率平均為91.30±8.51%，二者沒有顯著差異。

表5 兩性植株自交繁殖能力評估

在種子數(shù)量上，分別對182個(gè)果實(shí)的種子進(jìn)行計(jì)數(shù)，兩性植株自交共得到718個(gè)種子，單果種子數(shù)平均為3.94±1.05；異交共得到729個(gè)種子，單果種子數(shù)平均為4.01±0.91，二者之間沒有顯著差異。

由上可知，兩性植株自交能夠成功繁殖后代，與異交相比，兩者在得果率和單果種子數(shù)上并沒有差異，兩性植株自交繁殖能力與異交處于同一水平，不存在自交不親和現(xiàn)象。

3 討論

根據(jù)筆者的研究結(jié)果，兩性黃檗植株具有不低于正常植株的繁殖能力，在自然條件下可以成功繁殖后代。這也意味著兩性植株單株可以產(chǎn)生很多果實(shí)，與胡楊等的兩性植株不同[1-3]。結(jié)合3年觀察結(jié)果，兩性植株性別表達(dá)不發(fā)生變化，可以推斷出兩性黃檗植株能夠穩(wěn)定的存在，并具有重要的生存意義。兩性黃檗植株雄性和雌性均具有繁殖能力，即雄性和雌性均具有繁殖意義，為黃檗繁殖系統(tǒng)的相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)，也為其性別形成與分化研究提供了方向，但黃檗性別機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。兩性植株可以自交繁殖，單株即可完成生殖，保障物種的繁衍，可以在一定程度上克服野生黃檗種群個(gè)體分散、零星分布格局導(dǎo)致的傳粉困難，有利于黃檗資源的恢復(fù)和群落生物多樣性水平的維護(hù)。但野生黃檗中是否存在兩性黃檗、個(gè)體數(shù)量如何還有待于系統(tǒng)的野外調(diào)查。

在雌雄異株種群中出現(xiàn)少量的雌雄同株植株時(shí)，該居群稱為“亞雌雄異株”[29]。有學(xué)者指出亞雌雄異株居群的出現(xiàn)只是植物進(jìn)化發(fā)育過程中的“意外”，因?yàn)橹参锊灰欢軌蚓_的控制性別表達(dá)，在遭遇某些復(fù)雜的環(huán)境后可能產(chǎn)生一些罕見或是不規(guī)律的個(gè)體，并無意義[30]。也有學(xué)者不同意上述觀點(diǎn)，認(rèn)為亞雌雄異株種群的出現(xiàn)是植物為了適應(yīng)非生物環(huán)境而發(fā)生的改變[31-33]。植物所處的環(huán)境并非一成不變，大量研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)所處環(huán)境不利于植物生長時(shí)植株更偏向雄性，當(dāng)環(huán)境利于植物生長時(shí)植株更偏向于雌性[34]，同時(shí)擁有雄性和雌性的兩性植株能夠更好地適應(yīng)不同的環(huán)境[35]。黃檗的兩性植株同時(shí)擁有兩種性功能，能夠在低密度的環(huán)境下維持生存和繁衍，其適應(yīng)環(huán)境能力可能高于雌雄異株植株。有學(xué)者指出成功的繁殖依賴于植株良好的適應(yīng)性[36]，但黃檗兩性植株的出現(xiàn)是由于“意外”，或是對不利環(huán)境的主動應(yīng)對還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

兩性植株的雄性和雌性繁殖器官較之雄株和雌株，在形態(tài)和發(fā)育上基本沒有差異。在繁殖能力方面，兩性植株的雄性能夠正常繁殖，但能力略低于雄株；兩性植株的雌性也能夠正常繁殖，且能力略高于雌株?？傮w而言，兩性植株的雄性和雌性都可以成功的繁殖后代，繁殖能力較之雄株和雌株雖有一定的差異，但基本處于同一水平。兩性植株也能夠通過自交成功繁殖后代，其繁殖能力與異交相比處于同一水平上，不存在自交不親和現(xiàn)象，單株即可完成繁殖任務(wù)。為以后黃檗乃至植物性別相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)，也為黃檗野生資源保護(hù)帶來了希望，但黃檗性別形成與分化機(jī)制以及兩性黃檗植株在野外情況還需要進(jìn)一步的研究和調(diào)查。