鄒海燕，劉麗芬，楊春洪，昝雄云，王幼平，張順倉(cāng)

揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009

丹參Salvia miltiorrhizaBge.是唇形科鼠尾草屬植物，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材之一，其有效成分包括水溶性的酚酸類成分和脂溶性的丹參酮類成分，主要用于治療心血管系統(tǒng)疾病[1-2]，具有抑菌、抗炎、保護(hù)肝臟[3-4]、抗腫瘤[5-6]等作用。丹參是以根莖入藥的中藥材，根系形態(tài)和有效成分含量是影響藥材產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。目前丹參次生代謝調(diào)控方面的研究已取得許多突破性的進(jìn)展[7]，但其根系發(fā)育和次生代謝有無(wú)關(guān)聯(lián)性，2個(gè)生理過(guò)程對(duì)同一外源誘導(dǎo)因子的不同響應(yīng)目前鮮有報(bào)道。

生長(zhǎng)素是最早被發(fā)現(xiàn)的植物內(nèi)源激素，主要的活性形式是吲哚-3乙酸（indole-3-acetic acid，IAA），在植物種子休眠、細(xì)胞的伸長(zhǎng)、植物向性及生長(zhǎng)發(fā)育等多個(gè)生理過(guò)程中發(fā)揮作用[8-9]。近年來(lái)的研究表明，生長(zhǎng)素是影響植物側(cè)根發(fā)育的主要植物激素之一，參與了從植物側(cè)根建成細(xì)胞的選擇到側(cè)根露出的整個(gè)側(cè)根發(fā)育過(guò)程[10]。另外，生長(zhǎng)素對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的合成積累同樣具有調(diào)控作用，能顯著提高揮發(fā)油[11]、花青素[12]、類黃酮[13]等在植物中的含量。目前有關(guān)生長(zhǎng)素對(duì)丹參根系發(fā)育和有效成分積累的調(diào)控作用及機(jī)制知之甚少。本研究設(shè)置不同的IAA質(zhì)量濃度，分別采用葉面噴施和根部澆灌的方式處理丹參植株，初步探究IAA對(duì)丹參根系形態(tài)、酚酸類成分含量及丹參酮類成分含量的綜合性調(diào)控作用。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

丹參種子于2018年8月取自陜西天士力植物藥業(yè)有限責(zé)任公司商洛藥材基地，經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院吳曉霞副教授鑒定為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.。IAA購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，色譜級(jí)甲醇和乙腈購(gòu)自美國(guó)TEDIA公司，對(duì)照品丹酚酸A（批號(hào)96574-01-5）、迷迭香酸（批號(hào)20283-92-5）、丹酚酸B（批號(hào)115939-25-8）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%；隱丹參酮（110852200305）、丹參酮ⅡA（批號(hào)110766-200417）、丹參酮I（批號(hào)0867-200104）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），5804R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），SK5210HP型超聲清洗機(jī)（上海人和科學(xué)儀器有限公司），SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），?20 ℃低溫冰箱（青島海爾集團(tuán)），可調(diào)式微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司），101A-3型干燥箱（上海市儀器總廠），BS223S電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

2 方法

2.1 丹參幼苗的培養(yǎng)和IAA處理

將丹參種子直播于營(yíng)養(yǎng)缽中（缽口直徑21 cm,缽高21 cm），放入植物培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，出苗60 d后選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，20株/組共10組用于IAA處理。處理分為葉面噴施和根部澆灌2種，均設(shè)置5個(gè)IAA質(zhì)量濃度（0、5、10、20、30 mg/L）。各組處理均在同一植物培養(yǎng)室中進(jìn)行，植物培養(yǎng)室光暗周期設(shè)定為16/8 h，溫度設(shè)定為25℃/20℃晝夜變溫。IAA處理每周1次，處理4次后于正常培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)2周，收集樣品后進(jìn)行各個(gè)指標(biāo)的測(cè)定。

2.2 地上部分和根系形態(tài)指標(biāo)測(cè)定

用直尺測(cè)量株高、冠幅、根長(zhǎng)，用游標(biāo)卡尺測(cè)定蘆頭、一級(jí)側(cè)根和二級(jí)側(cè)根的直徑，用電子天平測(cè)定植株地上部分和根鮮質(zhì)量，并記錄各處理組植株的葉片數(shù)、一級(jí)側(cè)根數(shù)和二級(jí)側(cè)根數(shù)。

2.3 丹參酚酸類和丹參酮類成分的HPLC測(cè)定[14]

2.3.1 供試品溶液的制備 將樣品于45 ℃烘至恒定質(zhì)量，研缽中磨碎，過(guò)0.45 mm篩，精確稱取粉末0.05 g，加 6 mL甲醇-水（7︰3）超聲提取45 min，12 000×g離心10 min后取上清，用提取液補(bǔ)足原體積后過(guò)0.22 μm濾膜用于HPLC成分測(cè)定。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 測(cè)定的酚酸類成分包括迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A，丹參酮類成分包括隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA。精確稱量對(duì)照品粉末，水溶性成分對(duì)照品用甲醇-水（7︰3）溶解，脂溶性成分對(duì)照品用甲醇溶解。各對(duì)照品溶液按比例混合，使混合液中迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的終質(zhì)量濃度分別為0.125、0.685、0.130、0.048、0.050、0.042 5 mg/mL。

2.3.3 色譜條件 色譜條件為以乙腈（A）和0.01%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行二元梯度洗脫：0～10 min，5%～20% A；10～15 min，20%～25% A；15～25 min，25%～20% A；25～28 min，20%～30% A；28～40 min，30% A；40～45 min，30%～45% A；45～50 min，45%～50% A；50～58 min，50%～58% A；58～67 min，58%～50% A；67～70 min，50%～60% A；70～80 min，60%～65% A；80～85 min，65%～100%A，體積流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃。色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品 (A) 和丹參樣品 (B) 的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of standards (A) and samples(B)

2.3.4 方法學(xué)考察 以葉面噴施對(duì)照組樣品為材料進(jìn)行方法學(xué)考察，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)RSD值均小于3%，6個(gè)成分的平均加樣回收率為96.59%～99.48%，RSD值為0.92%～1.86%，均符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

酚酸類成分含量、丹參酮類成分含量、根系形態(tài)指標(biāo)等的差異顯著性分析利用PASW Statistics 25進(jìn)行，每組實(shí)驗(yàn)從處理的20株中隨機(jī)選取6株作為生物學(xué)重復(fù)（n＝6），數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同質(zhì)量濃度的IAA及施加方式對(duì)丹參地上部分形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響

測(cè)定了不同處理組中葉片數(shù)、冠幅、株高和地上部分鮮質(zhì)量（圖2）。結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的IAA噴施處理后，只有20 mg/L處理組中葉片數(shù)顯著增加（P＜0.05），為對(duì)照組（0 mg/L）中的1.23倍。較高濃度的IAA噴施增加了丹參植株的冠幅，如20 mg/L和30 mg/L處理組中冠幅分別為對(duì)照組的1.24倍和1.30倍。株高在IAA噴施處理后變化不大，只在30 mg/L處理組得到了顯著的提高（P＜0.05）。地上部分鮮質(zhì)量隨著IAA質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，30 mg/L處理組為對(duì)照組的1.21倍。一定質(zhì)量濃度的IAA澆灌處理后，上述形態(tài)學(xué)指標(biāo)值也得到了一定程度的提高，如5 mg/L處理組中葉片數(shù)是對(duì)照組的1.93倍。10 mg/L處理組中冠幅和地上部分鮮質(zhì)量分別是對(duì)照組的1.40倍和1.35倍。

圖2 不同質(zhì)量濃度的IAA及施加方式對(duì)丹參地上部分形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響 (n＝6)Fig.2 Effects of different concentrations of IAA and application methods on acrial part morphology of S.miltiorrhiza (n＝6）

3.2 不同質(zhì)量濃度的IAA及施加方式對(duì)丹參根系形態(tài)的影響

IAA處理顯著改變了丹參的根系形態(tài)（圖3）。IAA噴施處理后，一級(jí)側(cè)根數(shù)在5 mg/L處理組和20 mg/L處理組中顯著降低（P＜0.05），分別為對(duì)照組的45.50%和72.75%。一級(jí)側(cè)根直徑和一級(jí)側(cè)根長(zhǎng)度則顯著提高（P＜0.05），如20 mg/L處理組中一級(jí)側(cè)根直徑和一級(jí)側(cè)根長(zhǎng)度分別為對(duì)照組的1.36倍和1.18倍。IAA噴施處理顯著（P＜0.05）提高了丹參的二級(jí)側(cè)根數(shù)目，如20 mg/L處理組中二級(jí)側(cè)根數(shù)為對(duì)照組的2.00倍，二級(jí)側(cè)根直徑和長(zhǎng)度則無(wú)明顯變化。蘆頭直徑受IAA噴施處理的影響不大，根鮮質(zhì)量則在處理后顯著提高（P＜0.05），如20 mg/L處理組中根鮮質(zhì)量為對(duì)照組的1.55倍。IAA澆灌處理后，一級(jí)側(cè)根數(shù)目無(wú)顯著變化（P＞0.05），一級(jí)側(cè)根直徑和長(zhǎng)度則顯著提高（P＜0.05），如10 mg/L處理組中一級(jí)側(cè)根直徑和一級(jí)側(cè)根長(zhǎng)度分別為對(duì)照組的1.19倍和2.11倍。一定質(zhì)量濃度的IAA澆灌處理同樣促進(jìn)了丹參二級(jí)側(cè)根的發(fā)育，如5 mg/L處理組中二級(jí)側(cè)根數(shù)是對(duì)照組的1.54倍，20 mg/L處理組中二級(jí)側(cè)根直徑是對(duì)照組的1.40倍，30 mg/L處理組中二級(jí)側(cè)根長(zhǎng)度是對(duì)照組的1.72倍。除個(gè)別處理組外，IAA澆灌處理對(duì)丹參蘆頭直徑和根鮮質(zhì)量影響不大。

圖3 不同質(zhì)量濃度的IAA及施加方式對(duì)丹參根系形態(tài)的影響 (n＝6)Fig.3 Effect of different concentrations of IAA and application methods on root morphology of S.miltiorrhiza (n＝6）

3.3 不同質(zhì)量濃度的IAA及施加方式對(duì)丹參地上部分酚酸類成分積累的影響

IAA噴施處理大幅提高了丹參地上部分迷迭香酸的含量，4個(gè)處理組中迷迭香酸的量分別為對(duì)照組中的2.07、3.56、3.28、3.48倍（圖4-A）。丹參地上部分丹酚酸B的積累同樣受IAA噴施處理上調(diào)，4個(gè)處理組中的含量分別為對(duì)照組的1.17、1.61、1.77、1.33倍（圖4-B）。丹酚酸A的量在IAA噴施處理后則未呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，除20 mg/L處理組外，其余處理組中丹酚酸A的量顯著降低（P＜0.05，（圖4-C）。IAA澆灌處理后，5 mg/L處理組和20 mg/L處理中地上部分迷迭香酸的含量顯著提高（P＜0.05），分別為對(duì)照組的1.40倍和1.54倍（圖4-A）。地上部分丹酚酸B的含量則在IAA澆灌處理后顯著降低（P＜0.05），20 mg/L處理組中的含量?jī)H為對(duì)照組的42.34%（圖4-B）。地上部分丹酚酸A的含量在IAA澆灌處理后未呈現(xiàn)規(guī)律性（圖4-C）。

圖4 不同質(zhì)量濃度的IAA及施加方式對(duì)丹參地上部分迷迭香酸 (A)、丹酚酸B (B)、丹酚酸A (C) 積累的影響 (n＝6)Fig.4 Effects of different concentrations of IAA and application methods on accumulation of rosmarinic acid (A),salvianolic acid B (B) and salvianolic acid A (C) in acrial part of S.miltiorrhiza (n＝6）

3.4 不同質(zhì)量濃度的IAA及施加方式對(duì)丹參根中酚酸類成分積累的影響

IAA噴施處理有利于丹參根系中酚酸類成分的積累。迷迭香酸的含量在4個(gè)IAA濃度處理組中均顯著提高（P＜0.05），其中5 mg/L處理組中含量最高，為對(duì)照組的1.60倍（圖5-A）。和迷迭香酸的積累情況相似，根系中丹酚酸B和丹酚酸A的含量也在IAA噴施處理后顯著提高（P＜0.05），如20 mg/L處理組中丹酚酸B的含量是對(duì)照組的1.77倍，30 mg/L處理組中丹酚酸A的含量是對(duì)照組的2.42倍（圖5-B、C）。

IAA澆灌處理降低了根系中迷迭香酸的積累量，如30 mg/L處理組中迷迭香酸的含量為對(duì)照組的68.35%（圖5-A）。除30 mg/L處理組中含量顯著降低外，IAA澆灌處理對(duì)根中丹酚酸B的積累影響不大（圖5-B）。根中丹酚酸A的含量則在IAA澆灌處理后大幅提高，5 mg/L處理組中丹酚酸A的含量為對(duì)照組的3.25倍（圖5-C）。

圖5 不同質(zhì)量濃度的IAA及施加方式對(duì)丹參根系迷迭香酸 (A)、丹酚酸B (B)、丹酚酸A (C) 積累的影響 (n＝6)Fig.5 Effects of different concentrations of IAA and application methods on accumulation of rosmarinic acid (A),salvianolic acid B (B) and salvianolic acid A (C) in roots of S.miltiorrhiza (n＝6）

3.5 不同質(zhì)量濃度的IAA及施加方式對(duì)丹參根中丹參酮類成分積累的影響

IAA噴施處理顯著提高（P＜0.05）了丹參根中丹參酮類成分的含量，10 mg/L處理組中隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的含量分別是對(duì)照組的1.83、1.92、1.23倍，20 mg/L處理組中3種成分的含量則分別為對(duì)照組的1.83、1.92、1.49倍。與IAA噴施處理相似，IAA澆灌處理同樣大幅提高了丹參根中丹參酮類成分的含量，10 mg/L處理組中隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮IIA的含量分別是對(duì)照組的3.17、1.92、1.94倍，20 mg/L處理組中3種成分的含量則分別為對(duì)照組的2.25、1.75、2.23倍（圖6）。

圖6 不同濃度的IAA及施加方式對(duì)丹參根系隱丹參酮 (A)、丹參酮I (B)、丹參酮IIA (C) 積累的影響 (n＝6)Fig.6 Effects of different concentrations of IAA and application methods on accumulation of cryptotanshinone (A),tanshinone I (B),tanshinone IIA (C) in roots of S.miltiorrhiza (n＝6)

4 討論

IAA對(duì)植物側(cè)根發(fā)育的調(diào)控機(jī)制目前已經(jīng)基本明確。植物主根基部分生組織區(qū)域的中柱鞘細(xì)胞在IAA的振蕩調(diào)節(jié)下脫分化形成側(cè)根建成細(xì)胞，側(cè)根建成細(xì)胞受IAA及其下游基因的調(diào)控，進(jìn)行多次的垂周分裂和平周分裂形成側(cè)根原基。側(cè)根原基繼續(xù)分裂，并釋放果膠裂解酶等來(lái)改造其周圍皮層或表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁，助其突破皮層和表皮細(xì)胞而露出[10]。IAA對(duì)側(cè)根發(fā)育的調(diào)控具有復(fù)雜性，如在側(cè)根發(fā)生起始階段發(fā)揮作用的IAA主要來(lái)源于根尖部位，而側(cè)根露出過(guò)程中發(fā)揮作用的IAA則主要來(lái)源于地上部分的莖芽[15]。有研究表明，外源IAA同樣可以影響植物側(cè)根的發(fā)育和形態(tài)建成，且其調(diào)控作用與IAA質(zhì)量濃度密切相關(guān)。如10 μmol/L IAA可以促進(jìn)北柴胡的側(cè)根發(fā)育，當(dāng)IAA質(zhì)量濃度升高到100 μmol/L時(shí)則呈現(xiàn)出了顯著的抑制作用[16]。本研究中，葉面噴施和根部澆灌IAA均顯著影響了丹參的根系形態(tài)?？傮w上來(lái)說(shuō)，2種施加方式均增加了一級(jí)側(cè)根的數(shù)目和長(zhǎng)度，促進(jìn)了二級(jí)側(cè)根的發(fā)育，說(shuō)明外源IAA被丹參不同的器官吸收后均會(huì)被運(yùn)輸?shù)礁邪l(fā)揮作用。IAA不同的施加方式對(duì)丹參根系的影響又有不同之處，如一定質(zhì)量濃度的IAA葉面噴施后可以降低丹參一級(jí)側(cè)根數(shù)目，澆灌處理后則未發(fā)現(xiàn)類似變化。這可能是由于葉面噴施的IAA需要運(yùn)輸才能到達(dá)根部細(xì)胞，兩種施加方式對(duì)根部細(xì)胞中內(nèi)源IAA質(zhì)量濃度的影響程度不同。但具體的機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

除調(diào)控植物側(cè)根發(fā)育外，IAA還在多種植物中影響次生代謝產(chǎn)物的積累。如在0.1～1.0 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，IAA可顯著提高蕎麥Fagopyrum esculentumL.芽中蘆丁的含量[17]。IAA處理可以提高擬南芥Arabidopsis thalianaL.中槲皮素和山柰酚的含量，并使類黃酮生源途徑上的關(guān)鍵酶基因CHS、FLS和F3'H的表達(dá)量提高3.00倍以上[18]。對(duì)桃Prunus persicaL.果實(shí)施加外源IAA可以提高生長(zhǎng)素信號(hào)途徑上PpPIN和PpTIR1基因的表達(dá)，并提高果皮中花青素的含量增加果皮的著色率[19]。本研究中葉面噴施和根部澆灌IAA均影響了丹參中酚酸類成分的的含量，但相較于根部澆灌，葉面噴施IAA能更加高效地促進(jìn)丹參地上部分和根中酚酸類成分的積累。與酚酸類成分積累情況不同的是，2種IAA施加方式雖然均顯著提高了丹參根中丹參酮類成分的含量，但根部澆灌方式的促進(jìn)效果更加明顯。說(shuō)明丹參中2類主要有效成分對(duì)IAA的響應(yīng)機(jī)制不同，其具體的調(diào)控通路有待于進(jìn)一步深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突