威則日沙，劉 哲，蘭建龍，趙雪蓮，海來約布，張紹山，楊正明*，劉 圓

1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041

2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041

3.四川省羌彝藥用資源保護(hù)與利用技術(shù)工程實驗室，四川 成都 610225

4.青藏高原民族藥用資源保護(hù)與利用國家民委重點實驗室，四川 成都 610225

5.西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，四川 成都 610041

七葉一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara.為百合科重樓屬植物，是歷版《中國藥典》收載的2種基原藥材“重樓”的來源之一，以重樓皂苷I、重樓皂苷II和重樓皂苷VII總含量為其質(zhì)量評價指標(biāo)[1]。重樓甾體皂苷是重樓中含有的主要活性成分，具有抗腫瘤、消炎、止血、抗菌、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑制血管生成、保護(hù)肝臟與腎臟作用[2-3]。重樓是珍稀瀕危名貴傳統(tǒng)藥材，過度采挖已使其野生資源瀕臨滅絕，人工栽培是解決滇重樓資源危機(jī)的必然途徑。

近十多年來，重樓種植已成規(guī)模，種植面積不斷擴(kuò)大，肥料施用不均衡會導(dǎo)致重樓根莖品質(zhì)下降[4]，探討氮、磷、鉀肥配施對七葉一枝花的質(zhì)量的影響，可以為七葉一枝花的生態(tài)種植提供科學(xué)依據(jù)。目前，關(guān)于氮、磷、鉀配施對重樓活性成分影響的研究主要以滇重樓為主，相關(guān)研究[5-9]結(jié)果表明，合理施用氮、磷、鉀肥可提高滇重樓的產(chǎn)量和品質(zhì)，土壤肥力是影響滇重樓質(zhì)量的重要因素。不同植物對氮、鉀、磷的需求比例不同，單一微肥量過高或過低對藥材植物生長發(fā)育、藥效成分的積累及藥材質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)均有影響，并且元素量單一化容易使土壤惡化[4-6,10]，因此適宜的氮、磷、鉀肥配施是藥用植物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要基礎(chǔ)。本實驗采用3因素5水平二次回歸通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法，采用UPLC-ELSD法測定20個小區(qū)的七葉一枝花中重樓皂苷I等7種甾體皂苷含量，探討氮、磷、鉀配施對七葉一枝花中皂苷類成分含量的影響，以期為規(guī)范化七葉一枝花的生態(tài)栽培提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

Waters Acquity UPLC?超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）；METTLER AE240電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-5200E型超聲波清洗器（40 kHz、250 W，昆山超聲儀器有限公司）；ProElut C18反相硅膠鍵合固相萃取柱（200 μg，北京迪科馬科技有限公司）。

重樓皂苷I（批號MUST-19053105）、重樓皂苷II（批號MUST-18103104）、重樓皂苷V（批號MUST-19052102）、重樓皂苷VI（批號MUST-180717002）、重樓皂苷VII（批號MUST-18062201）、重樓皂苷H（批號MUST-19040101）、纖細(xì)薯蕷皂苷（批號MUST-15081110）均購自成都曼斯特生物有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%。乙腈為色譜純（美國Sigma公司）；水為屈臣氏蒸餾水；其余試劑為分析純。

1.2 材料

以四川省汶川縣水磨鎮(zhèn)白石村西南民族大學(xué)重樓仿野生繁育試驗基地人工栽種七葉一枝花為試驗材料，經(jīng)西南民族大學(xué)劉圓教授鑒定為百合科（Liliaceae）重樓屬ParisL.植物七葉一枝花P.polyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara.，洗凈，50 ℃烘干，粉碎，過篩（3號篩），備用。

供施肥料為尿素（總氮≥46.4%，四川宏泰生化有限公司公司）、過磷酸鈣（P2O5≥12%，四川省成都市青白江區(qū)磷肥廠）、硫酸鉀（K2O≥60%，國投新疆羅布泊鉀鹽有限責(zé)任公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 田間試驗設(shè)計

田間試驗設(shè)計見課題組前期報道[11]，試驗地位于四川省汶川縣水磨鎮(zhèn)白石村西南民族大學(xué)重樓仿野生繁育試驗基地。試驗地土壤肥力狀況：pH值為7.50；有機(jī)質(zhì)為32.36 mg/kg；堿解氮為158.67 mg/kg；速效磷為51.67 mg/kg；速效鉀為236.71 mg/kg。試驗因素為氮肥（X1）、磷肥（X2）、鉀肥（X3），采用3因素5水平二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計方法，共20個處理，20個小區(qū)隨機(jī)安排于試驗地中（試驗小區(qū)面積為16 m2）。試驗因素和水平編碼見表1。二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計與試驗方案見表2。

表1 因素水平編碼Table 1 Code of factor levels

表2 試驗設(shè)計與實施方案Table 2 Experimental design and implementation of programs

2.2 七葉一枝花中7種皂苷含量測定

2.2.1 色譜條件 參照張紹山等[12]、劉哲等[13]重樓皂苷含量測定方法，已優(yōu)化分離條件。ACQUITY UPLC?HSS C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；分析時間23 min；進(jìn)樣量2 μL；ELSD檢測器：增益500，冷卻模式，漂移管溫度55 ℃，氮氣壓力276 kPa；柱溫40 ℃；體積流量0.2 mL/min；流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序：0～23 min，10%～80%A?；旌蠈φ掌泛凸┰嚻啡芤荷V圖見圖1。

圖1 混合對照品 (A) 和供試品溶液 (B) 溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed reference (A) and sample (B)

2.2.2 對照品溶液制備 取重樓皂苷VII、重樓皂苷H、重樓皂苷VI、重樓皂苷II、重樓皂苷V、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷I，精密稱定，色譜甲醇定容到10 mL量瓶中，分別得0.522 0、0.320 0、0.526 0、0.442 0、0.460 0、0.163 0、0.476 0 mg/mL對照品溶液，用時以0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液備用。

2.2.3 供試品溶液制備 參考張紹山等[12]、劉哲等[13]的研究，取0.5 g七葉一枝花樣品粉末，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL甲醇，搖勻，靜置4 h，再超聲30 min，濾過，重復(fù)上述操作1次。合并2次濾液，45 ℃減壓旋蒸回收溶劑，殘渣加甲醇溶解，定容至5 mL，以0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液適量，稀釋到5 mL，配制成不同稀釋倍數(shù)的混合對照品溶液，進(jìn)樣2 μL，按“2.2.1”項下色譜條件測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。

表3 對照品的線性回歸方程Table 3 Linear regression equation of reference

2.2.5 樣品測定 取七葉一枝花樣品粉末，按“2.2.3”項下制備供試品溶液，以“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，外標(biāo)法計算含量。20個小區(qū)七葉一枝花樣品的7個甾體皂苷含量見表4。

2.3 氮、磷、鉀配施對七葉一枝花的皂苷類成分的影響

2.3.1 數(shù)學(xué)模型建立 根據(jù)表4試驗結(jié)果，利用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸模型分析，結(jié)合矩陣模型，建立氮肥（X1）、磷肥（X2）、鉀肥（X3）與重樓皂苷VII含量的回歸數(shù)學(xué)模型Y1、重樓皂苷VI含量的回歸數(shù)學(xué)模型Y2、重樓皂苷H含量的回歸數(shù)學(xué)模型Y3、重樓皂苷II含量的回歸數(shù)學(xué)模型Y4、纖細(xì)薯蕷皂苷含量的回歸數(shù)學(xué)模型Y5、重樓皂苷I含量的回歸數(shù)學(xué)模型Y6、重樓皂苷V含量的回歸數(shù)學(xué)模型Y7。用F檢驗法分別檢驗方程各項回歸系數(shù)、方程總回歸系數(shù)和失擬度，得到方差分析結(jié)果見表5。

表4 樣品中7種皂苷含量Table 4 Contents of seven saponins

表5 氮、磷、鉀肥與皂苷的方差分析Table 5 Analysis of variance of NPK fertilizer and saponins

通過方差分析所得方程經(jīng)F檢驗，F(xiàn)1R＝35.991 93，F(xiàn)1Lf＝0.510 26，即FR顯著，F(xiàn)Lf不顯著，說明二次回歸方程擬合得較好，其可靠程度較高。其中一次項X1、X2、X3均達(dá)到顯著，二次項X12、X22、X32達(dá)到顯著水平，交互項均未達(dá)到顯著；F2R＝17.574 89，F(xiàn)2Lf＝1.970 45，即FR顯著，F(xiàn)Lf不顯著，說明二次回歸方程擬合得較好，其可靠程度較高。其中一次項X1、X2、X3均達(dá)到顯著，二次項X22、X32達(dá)到顯著水平，交互項中X1X2達(dá)到顯著；其余所得方程經(jīng)F檢驗，F(xiàn)R不顯著，F(xiàn)Lf顯著，說明二次回歸方程擬合不好，不能說明氮肥、磷肥、鉀肥對其他皂苷有影響。經(jīng)上述檢驗，在α=0.05顯著水平剔除不顯著項后，得到簡化后的回歸方程：

2.3.2 因子主效應(yīng)分析 根據(jù)表5中各項回歸系數(shù)的F值計算各因素對因變量的貢獻(xiàn)率[14]，可得各因素對試驗結(jié)果的影響效果，得到各因素對7種重樓皂苷的貢獻(xiàn)率見表6。氮、磷、鉀對7種重樓皂苷的貢獻(xiàn)率影響不同（表6）。按貢獻(xiàn)率從大到小排列得到各因素對重樓皂苷VII的影響為鉀＞氮＞磷，對重樓皂苷VI的影響為鉀＞磷＞氮，對重樓皂苷H的影響為磷＞氮，對重樓皂苷II的影響氮＞磷、鉀，對纖細(xì)薯蕷皂苷的影響為磷>氮、鉀，對重樓皂苷I的影響為鉀＞氮＞磷，對重樓皂苷V的影響為氮＞磷＞鉀。以上可以看出，氮、磷、鉀對不同重樓皂苷含量的影響效果不同，說明氮、磷、鉀配施可能對重樓皂苷的合成有影響。

表6 單因素貢獻(xiàn)率Table 6 Single factor contribution rate

2.3.3 單因素效應(yīng)分析 通過降維處理，將磷、鉀肥2個因素固定在0水平，可得出單因素氮肥與（1）方程中重樓皂苷VII的影響方程：

同理可得磷肥、鉀肥與重樓皂苷VII之間的影響方程：

同上方法，將（2）方程進(jìn)行降維處理可得出單因素對重樓皂苷VI的影響方程：

根據(jù)方程10～12得出Y1（重樓皂苷VII）單因素回歸方程效應(yīng)影響圖，見圖2。

圖2 重樓皂苷VII單因素效應(yīng)分析Fig.2 Polyphyllin VII single factor analysis

圖2可以看出，氮肥、磷肥、鉀肥對重樓皂苷VII影響整體呈上升的趨勢。在?1.681 8～0水平，各因素對重樓皂苷VII的影響順序為磷肥＞氮肥＞鉀肥；0～1.681 8水平，各因素對重樓皂苷VII的影響順序為鉀肥＞氮肥＞磷肥。在?1.681 8～1.681 8水平，氮肥、磷肥、鉀肥呈上升狀態(tài)，表明隨著肥力水平的增加重樓皂苷VII隨之增加。在設(shè)計的5個水平中過低、過高都會影響重樓皂苷VII的增加，氮肥、磷肥、鉀肥在1.681 8水平的氮、磷、鉀配施能顯著提高重樓皂苷VII。

根據(jù)公式方程13～15得出Y2（重樓皂苷VI）回歸方程效應(yīng)影響圖，見圖3。

圖3 重樓皂苷VI單因素效應(yīng)分析Fig.3 Polyphyllin VI single factor analysis

由圖3可見，氮肥、磷肥、鉀肥對重樓皂苷VI影響整體呈上升的趨勢，各因素對重樓皂苷VI的影響順序為鉀肥＞磷肥＞氮肥。在?1.681 8～?1水平之間，磷肥、鉀肥呈下降狀態(tài)，表明隨著肥力水平的增加重樓皂苷VI隨之減小。在?1～1.681 8水平之間，氮肥、磷肥、鉀肥呈上升狀態(tài)，表明隨著肥力水平的增加重樓皂苷VI隨之增加。在設(shè)計的5個水平中過低、過高都會影響重樓皂苷VI的增加，氮肥、磷肥、鉀肥在1.681 8水平的氮、磷、鉀配施能顯著提高重樓皂苷VI。

2.3.4 互作效應(yīng)分析 試驗各因素之間不僅單獨對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響，還存在互作效應(yīng)。X1X2對重樓皂苷VI影響顯著，X1X3對重樓皂苷VI影響極顯著。因此，有必要進(jìn)一步探討氮-磷互作對重樓皂苷VI的影響。氮-磷互作效應(yīng)和氮-鉀互作效應(yīng)重樓皂苷VI的方程分別見（16）、（17）。

由圖4和圖5可以看出不同濃度的氮肥、磷肥和鉀肥都影響著重樓皂苷VI的提高，氮肥和磷肥的互作效應(yīng)、氮肥和鉀肥的互作效應(yīng)利于重樓皂苷VI的提高。氮肥和磷肥的互作效應(yīng)在1水平到1.681 8水平施肥有利于重樓皂苷VI的提高，是理想的互作區(qū)間；氮肥和鉀肥的互作效應(yīng)在1水平到1.681 8水平施肥有利于重樓皂苷VI的提高。

圖4 X1X2互作效應(yīng)含量變化Fig.4 X1X2 interaction effect on content changes

圖5 X1X3互作效應(yīng)含量變化Fig.5 X1X3 interaction effect on content changes

2.3.5 施肥方案的優(yōu)選 通過建立的產(chǎn)量回歸模型就能算出各重樓皂苷最高含量下氮、磷、鉀各最佳施用配方的理論值，因為考慮到實際生產(chǎn)過程溫度、濕度和光照等環(huán)境因素的影響，通過因子頻率計算得到一個合適的范圍，見表7。

各重樓皂苷最佳施肥范圍不同，但基本集中于0水平左右，取各重樓皂苷成分最佳施肥量范圍交集的結(jié)果，確定最優(yōu)施肥范圍為氮肥516.39～557.19 kg/hm2、磷肥2 771.70～2 848.20 kg/hm2、鉀肥461.61～502.65 kg/hm2。

3 討論

施肥是達(dá)到藥用植物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要措施，合理的肥料配施不但能促進(jìn)植物生長發(fā)育，提高藥材產(chǎn)量，還可以改善藥材品質(zhì)，對中藥材品質(zhì)保障及土壤環(huán)境保護(hù)有重要意義[15-16]。

科學(xué)合理的氮、磷、鉀肥配施對重樓藥材浸出物、總皂苷等含量積累均具有一定影響[11,17-18]。在本課題組實際研究中發(fā)現(xiàn)七葉一枝花中含有重樓皂苷VII、重樓皂苷H、重樓皂苷VI、重樓皂苷II、纖細(xì)薯蕷皂苷、重樓皂苷I、重樓皂苷V，與前人[19-22]研究相符；本實驗結(jié)果表明，氮、磷、鉀肥料配施對七葉一枝花的重樓皂苷VII、重樓皂苷VI含量有顯著影響；不同施肥處理下，除6、8、10、12和13號小區(qū)未能達(dá)到藥典規(guī)定重樓皂苷I、重樓皂苷II和重樓皂苷VII總量不得少于0.6%的要求，其余小區(qū)樣品均能滿足藥典規(guī)定。在試驗因素范圍內(nèi)氮、磷和鉀有利于七葉一枝花重樓皂苷VII含量的提高。重樓皂苷VII、重樓皂苷VI產(chǎn)量與氮、磷、鉀肥的配施的相關(guān)性均達(dá)顯著水平，當(dāng)施用氮肥555.15～713.10 kg/hm2、磷肥2 542.20～3 376.20 kg/hm2、鉀肥523.05～660.90 kg/hm2時，重樓皂苷VII含量大于0.20 %；當(dāng)施用氮肥516.45～673.50 kg/hm2、磷肥2771.85～3649.20 kg/hm2、鉀肥461.55～624.45 kg/hm2時，重樓皂苷VI含量大于0.09%。結(jié)合重樓皂苷V、Ⅳ、Ⅲ、II和I最高含量與氮、磷、鉀肥配施相關(guān)性的理論值，取交集得最佳氮、磷、鉀施肥范圍為氮肥516.39～557.19 kg/hm2、磷肥2 771.70～2 848.20 kg/hm2和鉀肥461.61～502.65 kg/hm2。

表7 各皂苷成分含量最優(yōu)施肥量Table 7 Optimum NPK application for high contents of saponins

本研究結(jié)果得出方案可為七葉一枝花的提高質(zhì)量的栽培提供理論依據(jù)，也為實際生產(chǎn)中提高七葉一枝花的品質(zhì)，對指導(dǎo)七葉一枝花野生資源人工移植馴化提供一定的參考，為七葉一枝花專用配方肥的進(jìn)一步研制提供理論依據(jù)。并且說明在一定條件下，土壤因子的養(yǎng)分含量適當(dāng)，重樓皂苷的含量越高，七葉一枝花的質(zhì)量越好。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突