張淑娟，張育貴，李東輝，吳紅偉，牛江濤，司昕蕾，李越峰*

1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000

2.甘肅省中藥質(zhì)量與標準研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根，味甘，性微溫，歸肺、脾經(jīng)，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫等功效，主要用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷等癥；炙黃芪為黃芪的蜜炙炮制加工品，炙黃芪味甘，性溫，歸肺、脾經(jīng)，更長于益氣補中[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪具有提高機體免疫功能，抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、抗病毒等藥理作用[2-6]。除藥用外，黃芪作為保健品在國際保健食品界具有一定的地位，有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪蜜炙前后其化學成分及藥效均有一定的差異[7-11]?；瘜W成分是藥物產(chǎn)生不同藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，故差異成分有可能是使黃芪與炙黃芪藥效改變的活性物質(zhì)。目前對黃芪化學成分的含量測定方面主要有單一成分以及多個成分同時測定，而關(guān)于蜜炙黃芪的質(zhì)量控制方面水平較低。研究表明，指紋圖譜結(jié)合多指標含量測定在中藥材質(zhì)量控制和相近品種區(qū)分與鑒別等方面的應(yīng)用越來越廣泛[12-14]。本實驗收集了15批黃芪藥材，擬采用HPLC法全面分析蜜炙黃芪化學成分，建立炙黃芪化學成分指紋圖譜，在此基礎(chǔ)上，建立炙黃芪飲片中毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、黃芪甲苷、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II和黃芪皂苷III 8種成分的含量測定方法，并測定8種化學成分的含量?；诤繙y定結(jié)果，進一步結(jié)合聚類分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）等化學計量學方法對不同產(chǎn)地炙黃芪飲片進行區(qū)分與比較，并尋找差異性成分?；谝陨蠈嶒炑芯浚ㄟ^對不同產(chǎn)地多批炙黃芪飲片的分析，建立炙黃芪的質(zhì)量控制研究方法，以期能提升炙黃芪飲片的質(zhì)量控制水平，為炙黃芪飲片的質(zhì)量評價提供科學依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 樣品 15批黃芪樣品為甘肅不同產(chǎn)地藥材，分別采集于甘肅隴南、隴西、渭源、岷縣、漳縣（表1），經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學王明偉教授鑒定為豆科植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根。

表1 15批黃芪藥材信息Table 1 Information of 15 batches of Astragali Radix

1.1.2 試藥 對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號PS000687）、毛蕊異黃酮（批號PS010251）、芒柄花苷（批號PS000671）、芒柄花素（批號PS000674）、黃芪甲苷（批號PS010428）、黃芪皂苷I（批號PS000459）、黃芪皂苷II（批號PS000462）、黃芪皂苷III（批號PS200514-03）均購自成都普思生物科技有限公司，所有對照品質(zhì)量分數(shù)均大于98%。乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純購于天津大茂有限公司；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（Agilent公司）；HC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測器（DAD、ELSD檢測器）；BT125D型十萬分之一天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；超聲清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；高速離心機（美國科峻儀器公司）。

2 方法

2.1 黃芪飲片切制

將收集到的15批黃芪藥材去掉泥土，快速過水，沖洗干凈，悶潤，切成厚片（2～4 mm），干燥備用。

2.2 蜜炙黃芪飲片的制備

取一定量的黃芪飲片，加沸蒸餾水稀釋過的煉蜜悶潤1 h，黃芪每100 g用煉蜜25 g，水為蜜的20%。置炒鍋內(nèi)，130 ℃炒10 min，取出，放涼，篩去碎屑，即得蜜炙黃芪飲片。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取經(jīng)處理的炙黃芪飲片粉末4 g，置圓底燒瓶中，加甲醇40 mL，加熱回流2 h，過濾，減壓回收甲醇，殘渣加水10 mL，用水飽和的正丁醇萃取2次，每次40 mL，合并正丁醇，加入氨試液洗滌2次（40 mL/次），棄去氨試液，減壓回收正丁醇，殘渣加適量甲醇使溶解，定容至5 mL量瓶中，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II和黃芪皂苷III對照品適量，以甲醇溶解，得到質(zhì)量濃度分別為0.403、0.325、0.344、0.104、7.278、1.022、1.010、1.002 mg/mL的對照品溶液。分別精密吸取這8種對照品儲存液各2 mL，用甲醇定容至10 mL，制成混合對照品溶液，備用。

2.5 色譜條件

HC-C18色譜柱（Agilent公司，型號：Agilent 4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～5 min，5%～13% A；5～10 min，13%～21% A；10～23 min，21%～37%A；23～37 min，37%～53% A；33～43 min，53%～69% A；43～45 min，69%～100% A；體積流量1 mL/min；UV檢測波長260 nm；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

HC-C18色譜柱（Agilent公司，型號：Agilent 4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫：0～5min，5%～13%A；5～10 min，13%～21% A；10～23 min，21%～37% A；23～37 min，37%～53% A；33～43 min，53%～69% A；43～50 min，69%～100% A；體積流量1 mL/min；ELSD：霧化溫度30 ℃；漂移管溫度105 ℃；氮氣流量2.5 L/min。

2.6 指紋圖譜的方法學考察

2.6.1 精密度試驗 取同一批炙黃芪飲片粉末（3號），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5”項下色譜條件連續(xù)進樣6次。記錄指紋圖譜，以芒柄花素色譜峰為參照峰，計算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果表明各共有峰的相對保留時間的RSD＜0.4%，各共有峰相對峰面積的RSD＜1.3%。

2.6.2 重復性試驗 取同一批炙黃芪飲片粉末（3號）6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5”項下色譜條件進行測定，記錄指紋圖譜，以芒柄花素色譜峰為參照峰，計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別小于2%、3%，表明該方法重復性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 取炙黃芪飲片粉末（3號），按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h按“2.5”項下色譜條件進行測定。以芒柄花素色譜峰為參照峰，結(jié)果各共有峰的相對保留時間RSD＜1.7%，相對峰面積RSD＜2.5%。

2.7 指紋圖譜的建立

取15批蜜炙黃芪飲片，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.5”項下色譜條件測定，得到15批蜜炙黃芪飲片指紋圖譜，將得到的實驗數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2012A版進行分析，設(shè)置S1為參照指紋圖譜，采用多點校正后進行全譜峰匹配，生成對照指紋圖譜（R），并對色譜峰進行指認。經(jīng)過與對照品的比對，指認了其中8個色譜峰，分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷（1號峰）、芒柄花苷（2號峰）、毛蕊異黃酮（3號峰）、芒柄花素（4號峰）、黃芪皂苷III（5號峰）、黃芪甲苷（6號峰）和黃芪皂苷II（7號峰）、黃芪皂苷I（8號峰）。將15批炙黃芪飲片指紋圖譜與對照指紋圖譜進行相似度評價，得到15批不同產(chǎn)地炙黃芪飲片指紋圖譜，見圖1。結(jié)果各產(chǎn)地炙黃芪飲片HPLC-UV指紋圖譜相似度在0.949～0.999，均大于0.90，S1～S15相似度依次為0.992、0.985、0.949、0.997、0.998、0.999、0.984、0.994、0.997、0.997、0.996、0.992、0.994、0.998、0.994；HPLC-ELSD指紋圖譜相似度在0.959～0.998；S1～S15相似度依次為0.993、0.994、0.982、0.995、0.996、0.997、0.997、0.982、0.981、0.992、0.998、0.996、0.959、0.963、0.993，均大于0.90，表明15批炙黃芪飲片的整體質(zhì)量相對穩(wěn)定，所建立的指紋圖譜方法可用于炙黃芪飲片的鑒定和質(zhì)量控制。

圖1 15批炙黃芪樣品HPLC指紋圖譜疊加圖Fig.1 Overlay of HPLC fingerprint of 15 batches of Astragali Radix stir-frying with honey

2.8 炙黃芪飲片含量測定

2.8.1 混合對照品溶液制備 同“2.4”項下混合對照品溶液的制備方法。

2.8.2 供試品溶液制備 同“2.3”項下供試品溶液的制備方法。

2.8.3 色譜條件 同“2.5”項下方法。

2.8.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液，制成6個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，按照“2.8.3”項下色譜條件進行測定，并記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，并進行線性回歸，得標準曲線方程。8個成分的線性回歸方程見表2。

表2 對照品的回歸方程Table 2 Regression equation of reference substance

2.8.5 精密度試驗 取蜜炙黃芪飲片樣品（S3），按“2.8.2”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，并記錄各個成分峰面積，計算RSD，結(jié)果毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II和黃芪皂苷III峰面積的RSD分別為0.85%、0.55%、0.65%、0.45%、0.34%、0.74%、0.67%、0.78%。

2.8.6 穩(wěn)定性試驗 取蜜炙黃芪飲片（S3）供試品溶液，按“2.8.3”項下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12、24 h測定各成分的峰面積，記錄峰面積并計算RSD，結(jié)果毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II和黃芪皂苷III峰面積的RSD分別為1.01%、0.76%、0.83%、1.15%、1.41%、0.86%、1.02%、0.97%。

2.8.7 重復性試驗 精密稱取炙黃芪樣品（S3）粉末6份，按照“2.8.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.8.3”項下方法進樣分析，記錄峰面積。計算毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II和黃芪皂苷III質(zhì)量分數(shù)的RSD值分別為1.423%、1.344%、1.343%、1.325%、1.521%、1.434%、1.353%、1.458%。

2.8.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的炙黃芪飲片樣品（S3）粉末2 g，平行6份分別加入8種成分對照品適量，按“2.8.2”項下方法制備供試品溶液并進樣分析，記錄各化學成分峰面積。計算毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II和黃芪皂苷III平均加樣回收率分別為98.3%、100.1%、98.2%、99.7%、98.8%、99.8%、98.5%、100.3%，RSD值分別為0.87%、0.65%、1.68%、1.79%、0.76%、0.73%、0.84%、1.26%。

2.8.9 樣品測定 按照“2.8.2”項下方法制備15批蜜炙黃芪飲片樣品溶液，按照“2.8.3”項下方法進樣分析，測定不同炙黃芪飲片中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪甲苷、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II和黃芪皂苷III的含量，其中黃酮類成分采用HPLD-DAD測定，皂苷類成分采用HPLC-ELSD測定。炙黃芪樣品和混合對照品色譜圖見圖2。15批炙黃芪飲片含量測定結(jié)果見表3。

圖2 炙黃芪飲片樣品和混合對照品的HPLC圖Fig.2 HPLC chart of sample and mixed reference of processed Astragali Radix

表3 15批炙黃芪飲片中8個成分的含量 (n＝3)Table 3 Contents of eight components in 15 batches of processed Astragali Radix decoction pieces (n＝3)

2.9 基于化學計量學方法的不同產(chǎn)地炙黃芪飲片的比較與區(qū)分

為了進一步比較與區(qū)分不同產(chǎn)地蜜炙黃芪飲片，尋找化學成分的差異，采用化學計量學方法以測得的8種成分的含量為變量，對15批炙黃芪飲片進行分析。

2.9.1 聚類分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件以15個不同產(chǎn)地蜜炙黃芪飲片各化學成分峰面積為變量，以平方歐氏距離（Euclidean距離）為區(qū)間，采用組內(nèi)均連法，對15批炙黃芪飲片指紋圖譜進行系統(tǒng)聚類分析。峰面積進行可視化展示，見圖3。由聚類分析結(jié)果可知，15批炙黃芪樣品可分為3類，15產(chǎn)地的為一類，4、6、10、14產(chǎn)地的聚為一類，1～3、5、7～9、11～13產(chǎn)地的聚為一類。

圖3 炙黃芪中各化學成分峰面積可視化圖Fig.3 Visualization diagram of peak area of each chemical component in processed Astragali Radix

2.9.2 主成分分析（PCA） 為了進一步評價和區(qū)分不同產(chǎn)地的炙黃芪飲片，以所測定的8種成分的含量為變量進行PCA。根據(jù)特征值和貢獻率選出主成分，結(jié)果見表4。以特征值＞1，提取出的主成分有3個，其累積貢獻率為73.543%，包含了15批炙黃芪指紋圖譜的主要信息，它們能夠反映炙黃芪的基本特征。載荷的絕對值越大，對主成分的貢獻越大，矩陣結(jié)果見表5。毛蕊異黃酮苷、黃芪甲苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮在第1主成分中有明顯的載荷值；芒柄花素、黃芪皂苷I在第2主成分中有明顯的載荷值；黃芪皂苷III在第3主成分中有明顯的載荷值。表明影響炙黃芪飲片質(zhì)量差異性的是多個成分，而不是單一成分。運用SIMCA-P 14.1分析軟件對其進行PCA，結(jié)果見圖4。由PCA圖可以看出，S15產(chǎn)地的炙黃芪飲片為一類，S4、S6、S10、S14產(chǎn)地的炙黃芪飲片為一類，其余產(chǎn)地的為一類，與聚類分析結(jié)果一致。

表4 特征值與方差貢獻率Table 4 Characteristic values and cumulative variance proportion

表5 初始因子載荷矩陣Table 5 Component matrixa

圖4 蜜炙黃芪飲片PCA圖Fig.4 PCA diagram of Astragali Radix decoction pieces stir-frying with honey

2.9.3 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）為了進一步區(qū)分15個不同產(chǎn)地炙黃芪飲片及尋找差異成分，在經(jīng)過PCA分析之后，進一步采用OPLS-DA對炙黃芪飲片進行分析。以8種化學成分的含量作為輸入變量得到相應(yīng)模型。結(jié)果見圖5、6。建立的OPLS-DA模型中，累積解釋能力參數(shù)R2X和R2Y分別為0.629和0.686，預測能力參數(shù)Q2為0.765，R2和Q2均大于0.5，表明所建模型具有一定的穩(wěn)定性及可靠性?？捎糜谠u價與區(qū)分不同炙黃芪飲片。由OPLS-DA得分圖可知，與聚類分析和PCA分析結(jié)果相似，不同產(chǎn)地炙黃芪飲片被很好的分為3類。根據(jù)模型中變量權(quán)重要性排序（VIP）預測值來篩選出具有統(tǒng)計學意義的差異標志物，在0.95的置信區(qū)間內(nèi)，選出VIP＞1.0的變量作為差異標志物，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II、黃芪皂苷III和黃芪甲苷的VIP值分別為1.04、1.05、1.03、0.77、1.20、0.29、1.31、1.00，因此確定毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、黃芪皂苷I、黃芪皂苷III和黃芪甲苷為不同炙黃芪飲片的差異性化合物，可以作為區(qū)分和評價不同炙黃芪飲片的指標性成分。

圖5 蜜炙黃芪飲片OPLS-DA圖Fig.5 OPLS-DA diagram of Astragali Radix decoction pieces stir-frying with honey

圖6 VIP值Fig.6 VIP value

3 討論

本研究采用HPLC法對15個不同產(chǎn)地的炙黃芪飲片進行分析，建立了炙黃芪飲片化學指紋圖譜，結(jié)果顯示相似度均大于0.90，表明15個不同產(chǎn)地炙黃芪飲片所含化學成分基本一致，所建立的指紋圖譜可用于炙黃芪飲片的鑒定與質(zhì)量控制。本實驗測定了不同產(chǎn)地炙黃芪飲片的8種化學成分的含量。結(jié)果顯示8種成分總量為0.997～5.118 mg/g，8種成分中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮苷質(zhì)量分數(shù)最高，分別為0.225～4.138 mg/g、0.159～0.367 mg/g，芒柄花素質(zhì)量分數(shù)最低，為0.005～0.025 mg/g。而黃芪皂苷I和黃芪皂苷II質(zhì)量分數(shù)差異不大，分別為0.059～0.249 mg/g、0.061～0.100 mg/g。

為了更好地辨識炙黃芪飲片之間的質(zhì)量差異，采用PCA和OPLS-DA分析，將15批炙黃芪樣品分成了3類，篩選出了6個差異性質(zhì)量標志物，分別是毛蕊異黃酮苷（1號峰）、芒柄花苷（2號峰）、毛蕊異黃酮（3號峰）、黃芪皂苷I（8號峰）、黃芪皂苷III（5號峰）和黃芪甲苷（6號峰）?？梢宰鳛閰^(qū)分和鑒別不同產(chǎn)地飲片的質(zhì)量控制指標。

本研究采用HPLC法建立了不同產(chǎn)地炙黃芪指紋圖譜，首次采用指紋圖譜結(jié)合PCA和OPLSDA可快速篩選出不同產(chǎn)地炙黃芪差異性質(zhì)量標志物，并建立了含量測定方法。該方法能夠有效地評價不同產(chǎn)地炙黃芪質(zhì)量以及需關(guān)注的質(zhì)量標志成分及含量，可為炙黃芪飲片的質(zhì)量控制提供科學的方法與依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突