李 巧，王亞琴，賀 紅*，張 泳，張宇瑤，黎廣衛(wèi)

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源科學(xué)與工程研究中心，廣東 廣州 510006

廣藿香Pogostemon cablin(Blanco) Benth.為唇形科刺蕊草屬植物，以干燥地上部分入藥，其味辛，性微溫，具有芳香化濁，和中止嘔，發(fā)表解暑等功能，為廣東道地藥材、“十大廣藥”之一。廣藿香在種植過(guò)程中，易感染青枯病。青枯病是一種細(xì)菌性土傳病害，病原菌在植物維管束內(nèi)定殖和繁殖，破壞寄主植物的輸導(dǎo)系統(tǒng)，使植株無(wú)法正常吸收水分和養(yǎng)分導(dǎo)致枯萎死亡[1]。青枯病嚴(yán)重影響廣藿香的產(chǎn)量和質(zhì)量，危及廣藿香的生存和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)和研究病原菌致病相關(guān)基因，有助于了解病原菌致病機(jī)理、開(kāi)發(fā)抗菌的靶標(biāo)藥物及發(fā)展新的防病策略。

轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn）是DNA插入因子的一種，是一類可以在基因組中移動(dòng)的DNA片段[2]。目前細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn5的轉(zhuǎn)座機(jī)制已闡明，利用Tn5轉(zhuǎn)座突變技術(shù)，將轉(zhuǎn)座子插入到細(xì)菌基因組中，使得插入位點(diǎn)處基因發(fā)生突變并導(dǎo)致其相關(guān)功能活性喪失，從而篩選出功能發(fā)生突變的菌株[3]。如果轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)基因是病原菌致病相關(guān)基因，就可能導(dǎo)致病原菌致病力喪失或減弱，由此可發(fā)現(xiàn)致病相關(guān)基因[4-5]。本課題組前期從感染了青枯病的廣藿香植株中分離得到了青枯菌菌株Ralstonia solanacearumPRS-84[6]，并利用Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變及致病性篩選獲得了菌株P(guān)RS-84的低致病力突變株[7]。本研究以低致病力突變株P(guān)RS-84-4-7為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其進(jìn)行致病性驗(yàn)證，再以插入的Tn5轉(zhuǎn)座子序列為基礎(chǔ)，利用反向PCR擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，并對(duì)插入位點(diǎn)基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，為了解廣藿香青枯病菌的致病機(jī)制、發(fā)展新的防病策略奠定基礎(chǔ)。

1 材料

廣藿香青枯菌野生菌株Ralstonia solanacearumPRS-84（簡(jiǎn)稱PRS-84）由劉丹等[6]從感染了青枯病的廣藿香植株中分離獲得。廣藿香青枯菌低致病力突變株P(guān)RS-84-4-7由王亞琴等[7]構(gòu)建及篩選獲得。

2 方法

2.1 青枯菌的培養(yǎng)

將廣藿香青枯菌菌株P(guān)RS-84及其突變株P(guān)RS-84-4-7從?80 ℃取出，采用劃線法將其接種至NA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取單菌落并將其接種于NA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。

2.2 致病性測(cè)定

對(duì)野生菌株P(guān)RS-84及低致病力突變株P(guān)RS-84-4-7進(jìn)行培養(yǎng)，將菌液稀釋至5.0×108cfu/mL；以無(wú)菌水為對(duì)照，采用傷根浸泡法，將稀釋后的菌液分別接種至廣藿香植株，再將實(shí)驗(yàn)植株移至塑料棚中培養(yǎng)，濕度85%左右，溫度28～30 ℃。觀察植株的發(fā)病情況。

2.3 反向PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

提取低致病力突變株P(guān)RS-84-4-7基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，用T4連接酶對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接。根據(jù)Tn5轉(zhuǎn)座子序列設(shè)計(jì)的引物KAN-2 FP-1（5’-ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC-3’）及KAN-2 RP-1（5’-GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAG-3’），對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增，以獲得突變株轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列。反應(yīng)體系：連接產(chǎn)物1.0 μL；引物（10 μmol/L）各1.0 μL；Ex Taq酶12.5 μL；ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。

2.4 RsgidA基因的克隆及序列測(cè)定

根據(jù)Tn5轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)側(cè)翼序列BLAST比對(duì)獲得的同源基因序列設(shè)計(jì)特異性引物：4-7-F為CCCTCGAGTGTTCCGTCTTTTTTTTCTGGT（下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），4-7-R：CGAGCTCTGATGCTTAGGAAAATTCCAGATA（下劃線為SacⅠ酶切位點(diǎn)）。分別以野生菌株及突變菌株基因組DNA為模板，以4-7-F及4-7-R為引物對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：高保真預(yù)混合酶45 μL；引物（10μmol/L）各2.0 μL；DNA模板1.0 μL。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min。

取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用凝膠成像儀觀察，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。將純化產(chǎn)物與T載體（pClone007 simple vector）連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，采用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)。挑取抗性菌落，進(jìn)行PCR鑒定，進(jìn)一步提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒并經(jīng)XhoⅠ及SacⅠ雙酶切鑒定和測(cè)序。

2.5 生物信息學(xué)分析

將測(cè)序獲得的核苷酸序列通過(guò)ExPASy工具翻譯成氨基酸序列；以ProtParam在線工具對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)；以ProtScale軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行親疏水性預(yù)測(cè)；以SignalP 5.0軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；以TMHMM軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；以SOPMA軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；以SWISS-MODEL對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；使用NCBI中的BLAST工具搜索并下載其他植物病原中的同源氨基酸序列，利用MEGA5.1軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 低致病力突變菌株對(duì)廣藿香的致病性表型

分別用野生菌株P(guān)RS-84及突變株P(guān)RS-84-4-7對(duì)廣藿香植株進(jìn)行傷根浸泡處理，以用無(wú)菌水浸泡的植株為對(duì)照，觀察植株在7 d內(nèi)的發(fā)病情況。圖1為接種第3天的植株表型，可以看出，無(wú)菌水處理的植株保持健康，接種野生菌株P(guān)RS-84的廣藿香植株出現(xiàn)葉片下垂、萎蔫等典型的青枯病癥狀，而接種突變株P(guān)RS-84-4-7的植株無(wú)明顯的發(fā)病癥狀。結(jié)果表明，與野生菌株P(guān)RS-84相比，突變株P(guān)RS-84-4-7的致病性明顯減弱，符合低致病力突變株的表型特征。

圖1 低致病力突變菌株與野生菌株對(duì)廣藿香的致病性表型（接種第3天）Fig.1 Pathogenicity assays of low virulent mutant and wild-type strain on patchouli plants (at 3rd day postinoculation)

3.2 低致病力突變株Tn5轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的擴(kuò)增及序列測(cè)定

根據(jù)Tn5轉(zhuǎn)座子序列設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)突變株P(guān)RS-84-4-7基因組DNA進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示（圖2），該菌株擴(kuò)增出特異性條帶，說(shuō)明Tn5轉(zhuǎn)座子成功插入至廣藿香青枯菌PRS-84的基因組中。對(duì)Tn5轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)側(cè)翼序列進(jìn)行測(cè)序及分析，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)基因與gidA（glucose-inhibited division protein A）基因（Genbank accession No.CP049363.1）的相似度最高，將該基因命名為廣藿香青枯病菌RsgidA基因。

圖2 低致病力突變株Tn5轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的反向PCR檢測(cè)Fig.2 Gel electrophoresis of inverse PCR products of flanking sequences adjacent to Tn5 transposon insertion site in low virulent mutant

3.3 廣藿香青枯病菌RsgidA基因的克隆

根據(jù)Tn5轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)側(cè)翼序列BLAST比對(duì)獲得的同源基因序列設(shè)計(jì)特異性引物4-7-F/4-7-R，以野生菌株P(guān)RS-84和突變株P(guān)RS-84-4-7基因組DNA為模板，對(duì)插入突變基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示（圖3），突變株擴(kuò)增的條帶約為3000 bp，較野生菌株長(zhǎng)1000 bp左右，因Tn5轉(zhuǎn)座子全長(zhǎng)為1221 bp，與預(yù)期片段大小一致。將菌株P(guān)RS-84的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化回收，將其與T載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR及雙酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆子，表明成功克隆了廣藿香青枯病菌RsgidA基因。

圖3 低致病力突變株Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變基因的PCR檢測(cè)Fig.3 Gel electrophoresis of PCR products of Tn5 transposon insertion-site gene in low virulent mutant PRS-84-4-7

3.4 廣藿香青枯病菌RsgidA基因的生物信息學(xué)分析

3.4.1RsgidA基因的序列分析 對(duì)“3.3”項(xiàng)中獲得的陽(yáng)性克隆子進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，測(cè)序獲得RsgidA基因的全長(zhǎng)序列。該基因全長(zhǎng)從起始密碼子ATG到終止密碼子TAA為1881 bp，共編碼626個(gè)氨基酸（圖4）。

圖4 RsgidA基因的核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列Fig.4 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of gene RsgidA

3.4.2 RsGidA蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用ProtParam軟件對(duì)RsgidA基因的編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)。RsGidA蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為69 071.73，理論等電點(diǎn)為6.21，分子式為C3038H4863N867O923S24，脂肪系數(shù)為86.04，不穩(wěn)定指數(shù)為38.76，親水性平均系數(shù)為?0.319。利用ProtScale軟件對(duì)RsGidA蛋白進(jìn)行親疏水性預(yù)測(cè)，由圖5可看出，該蛋白親水性氨基酸數(shù)量多于疏水性氨基酸，預(yù)測(cè)為親水性蛋白。利用SignalP 5.0及TMHMM軟件分別對(duì)RsGidA蛋白進(jìn)行信號(hào)肽及跨膜結(jié)果預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白不含信號(hào)肽，無(wú)跨膜區(qū)。利用SOPMA軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，RsGidA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含256個(gè)α螺旋，216個(gè)無(wú)規(guī)卷曲，98個(gè)延伸鏈，56個(gè)β-轉(zhuǎn)角，分別占氨基酸總數(shù)的40.89%、34.5%、15.65%和8.95%。以大腸桿菌GidA的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：3ces）為模板，利用SWISS-MODEL軟件對(duì)RsGidA蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，其空間結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符合（圖6）。

圖5 RsGidA蛋白的疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of RsGidA protein

圖6 RsGidA蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of tertiary structure of RsGidA protein

3.4.3 RsGidA蛋白與不同植物病原細(xì)菌同源氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化分析 一般認(rèn)為氨基酸序列相似性大于30%的蛋白質(zhì)可能由同一種蛋白分化而來(lái)，為同源蛋白，可能具有相似的結(jié)構(gòu)和功能[8]。RsGidA蛋白與不同植物病原菌中的GidA氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析，blastp結(jié)果顯示，RsGidA與丁香假單胞菌Pseudomonas syringae、菠蘿泛菌Pantoea ananatis、生癌腸桿菌Enterobacter cancerogenus、西瓜食酸菌Acidovorax citrulli及野油菜黃單胞菌Xanthomonas campestris的同源氨基酸序列相似性分別為71.36%、66.77%、66.03%、64.45%及64.68%。采用MEGA 5.1軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，表明RsGidA蛋白與其他植物病原細(xì)菌同源蛋白的關(guān)系與blastp比對(duì)結(jié)果一致（圖7），其中，RsGidA蛋白與丁香假單胞菌的GidA蛋白親緣關(guān)系最近。

圖7 RsGidA蛋白與不同植物病原細(xì)菌同源氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.7 Phylogenetic tree analysis of RsGidA protein and homologous proteins from different plant pathogen strains

4 討論

GidA蛋白又名MnmG[9]（tRNA uridine 5-carboxymethylaminomethyl modification enzyme MnmG），在原核及真核細(xì)胞中廣泛存在且高度保守[10-11]，其介導(dǎo)的tRNA修飾對(duì)于蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確翻譯具有重要作用[12]，該蛋白的缺失或者突變會(huì)引起基因表達(dá)功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞正常生命活動(dòng)異常。von Meyenburg等[13]對(duì)大腸埃希菌進(jìn)行了Tn10轉(zhuǎn)座子插入突變，獲得了在含有葡萄糖培養(yǎng)基中細(xì)胞形態(tài)改變的突變株，研究表明該突變株的轉(zhuǎn)座子插入了1個(gè)功能基因，該基因在葡萄糖的作用下可以使細(xì)胞的分裂受到抑制（glucose-inhibited division），因此將該基因命名為gidA。Shippy等[14-15]對(duì)沙門(mén)氏菌的gidA基因進(jìn)行缺失突變后，細(xì)胞形態(tài)呈絲狀改變，還發(fā)現(xiàn)突變株的染色體分裂受阻，與細(xì)胞分裂相關(guān)的基因表達(dá)異常。

最近的研究表明，gidA基因還與病原菌的致病性相關(guān)。Kinscherf等[16]通過(guò)Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變獲得了丁香假單胞菌Pseudomonas syringae的毒性突變菌株，該突變株的脂肽毒素分泌能力及運(yùn)動(dòng)性消失，毒性減弱，研究發(fā)現(xiàn)突變株的轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)位于gidA基因的開(kāi)放閱讀框內(nèi)，表明gidA基因?qū)Χ∠慵賳伟亩拘跃哂姓{(diào)控作用。Gupta等[17]構(gòu)建了銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa的轉(zhuǎn)座子插入突變體庫(kù)，并篩選得到多個(gè)減毒株，其中g(shù)idA基因的失活對(duì)LasA蛋白酶和綠膿菌素等毒力因子的合成具有顯著影響。此外，張偉等[18]以生防菌熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens為研究對(duì)象，通過(guò)Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變的方法獲得gidA基因突變的菌株，該突變株生物膜形成能力及對(duì)小麥根部的定殖能力均較野生菌株顯著降低。

在細(xì)菌分類鑒定中，假單胞菌屬Pseudomonas曾是一個(gè)大屬，勞爾氏菌屬細(xì)菌Ralstonia曾隸屬于假單胞菌屬，而青枯勞爾氏菌Ralstonia solanacearum（簡(jiǎn)稱青枯菌）最早也被命名為青枯假單胞菌Pseudomonas solanacearum，表明青枯菌與假單胞菌有較大的關(guān)聯(lián)。本研究成功從廣藿香青枯菌菌株R.solanacearumPRS-84中克隆了RsgidA基因，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，該基因與丁香假單胞菌P.syringae的gidA基因具有較近的親緣關(guān)系。

有研究表明，細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性和生物膜形成能力與病原菌的致病力相關(guān)。病原菌的運(yùn)動(dòng)性在其侵染寄主植物的過(guò)程中具有重要作用[19-20]，運(yùn)動(dòng)性功能缺陷可導(dǎo)致病原菌致病性的減弱[21]。植物病原細(xì)菌的生物膜的形成有利于病原菌在寄主植物中定殖，一些植物病原細(xì)菌的生物膜可在寄主植物的木質(zhì)部中形成，導(dǎo)致導(dǎo)管堵塞，從而使植株出現(xiàn)萎蔫失水等癥狀[22-23]。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)低致病力突變株P(guān)RS-84-4-7的運(yùn)動(dòng)性及生物膜形成能力進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，與野生菌株P(guān)RS-84相比，突變株P(guān)RS-84-4-7的運(yùn)動(dòng)性降低，生物膜形成減少（未發(fā)表數(shù)據(jù)），推測(cè)RsgidA基因可能通過(guò)調(diào)控青枯菌的運(yùn)動(dòng)性和生物膜形成，從而在青枯菌侵染廣藿香及其在體內(nèi)定殖過(guò)程中發(fā)揮作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突