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        化瘀通絡(luò)中藥通過抑制TGF-β1/ERK通路減輕糖尿病腎病大鼠腎纖維化研究

        2021-05-27 11:57:26李雅純陳志強(qiáng)
        中草藥 2021年10期
        關(guān)鍵詞:中藥模型

        郭 帥,方 敬,楊 帆,李雅純,陳志強(qiáng),2*

        1.河北中醫(yī)學(xué)院,河北 石家莊 050000

        2.河北省中醫(yī)院,河北 石家莊 050000

        糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN)是糖尿病常見且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一,是導(dǎo)致終末期腎臟病的主要原因[1]。DN的主要病理改變?yōu)槟I小球和腎間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度沉積,導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[2]。轉(zhuǎn)化細(xì)胞因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是重要的致纖維化因子[3]。Smad依賴的信號通路是傳導(dǎo)TGF-β1的主要通路,此外,Smad非依賴的TGF-β1信號通路在腎纖維化中也具有重要作用[4]。Smad非依賴途徑以細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信號通路為主,ERK信號通路是TGF-β1介導(dǎo)腎纖維化的另一重要信號通路[5]。因此,阻斷TGF-β1/ERK信號通路對于防治DN腎纖維化具有重要意義。

        DN經(jīng)久不愈,久病多瘀、久病入絡(luò)。瘀血阻絡(luò)是DN的基本病機(jī),化瘀通絡(luò)中藥臨床上對DN具有較好的療效[6-7]。課題組前期研究從DN大鼠的一般情況和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)等方面證實(shí)了DN中“血瘀證”的客觀存在[8],并篩選出化瘀通絡(luò)中藥治療DN大鼠的最佳劑量,化瘀通絡(luò)中藥具有腎保護(hù)作用,作用比陽性對照藥物厄貝沙坦更穩(wěn)定、持久;化瘀通絡(luò)中藥能夠通過抑制TGF-β1/Smad信號通路來減輕DN腎病理損傷[9-12]。本研究探討化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠腎組織TGF-β1/ERK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

        1 材料

        1.1 動物

        SPF級雄性SD大鼠40只,3~5周齡,體質(zhì)量60~80 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,動物許可證號SCXK(京)2016-0006。動物飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學(xué)院動物房,溫度(23±2)℃、濕度50%~70%,12 h光照/12 h黑暗交替,通風(fēng)良好,自由進(jìn)食飲水。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號DWLL2020052)。

        1.2 藥品與試劑

        化瘀通絡(luò)中藥所用藥物為顆粒劑,均由廣東一方制藥有限公司惠贈,規(guī)格如下:丹參(批號8080971,1.8 g/袋,相當(dāng)于10 g飲片)、川芎(批號8122561,1.3 g/袋,相當(dāng)于6 g飲片)、地龍(批號7125701,1.0 g/袋,相當(dāng)于10 g飲片)、水蛭(批號8081351,1.5 g/袋,相當(dāng)于3 g飲片)、全蝎(批號8050111,1.0 g/袋,相當(dāng)于3 g飲片);高脂飼料(批號HD001)購自北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司;鏈脲佐菌素(批號S8050)購自北京索萊寶科技有限公司;肌酐試劑盒(批號AUZ3562)、尿素氮試劑盒(批號AUZ3611)、尿酸試劑盒(批號AUZ3629)購自美國Beckman公司;III型膠原(collagen type III,Col-III)兔多克隆抗體(批號GB111629)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體(批號GB23303)購自武漢賽維爾生物科技有限公司;TGF-β1兔單克隆抗體(批號ab215715)購自英國Abcam公司;β-actin小鼠單克隆抗體(批號AF0003)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;c-Raf兔單克隆抗體(批號53745)、磷酸化c-Raf(p-c-Raf)兔單克隆抗體(批號9427)、絲裂原活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(mitogen-activated extracellular signal regulated kinase,MEK)兔單克隆抗體(批號8728)、p-MEK兔單克隆抗體(批號9154)、兔單克隆抗體(批號4695)、p-ERK兔單克隆抗體(批號4376)購自美國CST公司。

        1.3 儀器

        HEMIX-180全自動生化分析儀(日本Sysmex公司);Active血糖儀(瑞士Roche公司);RM2016病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司);BX51光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);Case Viewer 2.2掃描瀏覽軟件(匈牙利3DHISTECH公司);Image-Pro Plus 6.0圖片分析軟件(美國Media Cybemetics公司);Stepone plus熒光定量PCR儀(美國ABI公司);22331 hamburg蛋白濃度定量儀(德國Eppendorf公司);DYCZ-24DN電泳儀(北京六一生物科技有限公司);WSE-4040半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)(日本ATTO公司);Odyssey紅外激光掃描儀(美國LI-COR公司)。

        2 方法

        2.1 造模、分組與給藥

        大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機(jī)選取10只作為對照組常規(guī)飼養(yǎng),其余大鼠給予高脂飼料飼養(yǎng)6周。大鼠禁食不禁水12 h,對照組ip枸櫞酸緩沖液,其余ip鏈脲佐菌素(40 mg/kg),72 h后于尾靜脈連續(xù)采血3次,血糖≥16.7 mmol/L則表明DN模型制備成功。造模過程中無大鼠死亡,2只大鼠血糖<16.7 mmol/L予以剔除。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組和化瘀通絡(luò)中藥組,每組14只?;鐾ńj(luò)中藥組丹參、川芎、地龍、水蛭、全蝎劑量分別為1.35、1.08、0.9、0.54、0.54 g/kg(以中藥飲片量計(jì)),相當(dāng)于臨床等效劑量,以上5種顆粒按劑量配比混勻,溶于熱純凈水配制成混懸液,放置至室溫?;鐾ńj(luò)中藥組ig相應(yīng)藥物,對照組和模型組ig等體積純凈水,1次/d,連續(xù)16周。

        2.2 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠空腹血糖的影響

        給藥第0、4、8、12、16周末,大鼠尾靜脈采血,采用血糖儀檢測各組大鼠空腹血糖水平。

        2.3 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平的影響

        給藥結(jié)束后,大鼠禁食12 h,ip 10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉,腹主動脈采血,離心取上清,采用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平。

        2.4 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠腎臟組織病理變化的影響

        大鼠脫頸椎處死,取腎組織于4%中性甲醛中固定,梯度乙醇脫水、透明、浸蠟后,石蠟包埋并切片(厚3 μm),進(jìn)行PAS和Masson染色,脫水后,中性膠封片,于顯微鏡下觀察腎臟病理變化。PAS染色中,糖蛋白呈紅色,細(xì)胞核呈淺藍(lán)色;Masson染色中,膠原纖維呈藍(lán)色,免疫復(fù)合物、纖維蛋白呈紅色。

        2.5 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠腎組織Col-III和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

        取各組大鼠腎組織石蠟切片,于二甲苯常規(guī)脫蠟,加入檸檬酸抗原修復(fù),于3%雙氧水溶液室溫避光孵育25 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,于3%牛血清白蛋白中室溫封閉30 min,分別加入Col-III抗體(1∶300)、TGF-β1抗體(1∶500),4 ℃孵育過夜;加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體,室溫孵育50 min,DAB顯色并水洗后,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察,細(xì)胞核為藍(lán)色,陽性表達(dá)為棕黃色。

        2.6 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠腎組織TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響

        按照試劑盒說明書提取各組大鼠腎組織總RNA并合成cDNA,進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列:TGF-β1上游引物5’-ATGGTGGACCGCAACAAC-3’,下游引物5’-TGAGCACTGAAGCGAAAGC-3’;GAPDH上游引物5’-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3’,下游引物5’-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3’。

        2.7 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠腎組織c-Raf、p-c-Raf、MEK、p-MEK、ERK和p-ERK蛋白表達(dá)的影響

        取各組大鼠腎組織,加入裂解液勻漿,提取總蛋白,采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度,蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜,室溫封閉30 min,分別加入c-Raf抗體(1∶600)、p-c-Raf抗體(1∶750)、MEK抗體(1∶600)、p-MEK抗體(1∶800)、ERK抗體(1∶600)、p-ERK抗體(1∶750)、β-actin抗體(1∶1000),4 ℃孵育過夜;加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體,室溫孵育30 min后顯影,采用Quantity one軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

        2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)以±s表示,方差齊者采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn);方差不齊者采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。

        3 結(jié)果

        3.1 各組大鼠死亡情況

        給藥16周內(nèi),模型組大鼠死亡4只,化瘀通絡(luò)中藥組大鼠死亡3只。經(jīng)大體解剖發(fā)現(xiàn)5只大鼠死于感染,表現(xiàn)為皮下多發(fā)膿腫及腎膿腫;另2只大鼠死亡原因不明確,推測與高血糖導(dǎo)致的酮癥酸中毒或高滲性高血糖狀態(tài)有關(guān)。

        3.2 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠空腹血糖的影響

        如圖1所示,給藥第0、4、8、12、16周末,與對照組比較,模型組大鼠空腹血糖水平明顯升高(P<0.01);與模型組比較,化瘀通絡(luò)中藥組大鼠空腹血糖水平無明顯變化。

        圖1 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠空腹血糖的影響 (±s )Fig.1 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on fasting blood glucose in DN rats (±s)

        3.3 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平的影響

        如表1所示,與對照組比較,模型組大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平顯著升高(P<0.01);與模型組比較,化瘀通絡(luò)中藥組大鼠血清中肌酐和尿素氮水平顯著降低(P<0.01),尿酸水平有所降低,但無顯著性差異。

        表1 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平的影響 (±s)Table 1 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on levels of creatinine,urea nitrogen and uric acid in serum of DN rats(±s)

        表1 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠血清中肌酐、尿素氮和尿酸水平的影響 (±s)Table 1 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on levels of creatinine,urea nitrogen and uric acid in serum of DN rats(±s)

        與對照組比較:##P<0.01;與模型組比較:**P<0.01##P < 0.01 vs control group; **P < 0.01 vs model group

        組別 n 肌酐/(μmol·L?1) 尿素氮/(mmol·L?1) 尿酸/(μmol·L?1)對照 10 24.57±3.18 8.22±1.62 43.97±10.68模型 10 58.10±7.75## 18.68±1.49## 88.27±23.82##化瘀通絡(luò)中藥 11 44.85±5.71** 13.45±2.78** 70.74±16.05

        3.4 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠腎臟組織病理變化的影響

        如圖2所示,對照組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)正常,腎小球、腎小管及間質(zhì)均無異常改變;模型組大鼠腎小球毛細(xì)血管袢肥大,基底膜輕中度增厚,系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕中度增生,腎小管空泡和顆粒變性,局灶狀萎縮,腎間質(zhì)有較多的膠原纖維沉積;與模型組比較,化瘀通絡(luò)中藥組大鼠腎臟損傷和膠原纖維沉積均有一定程度地減輕。

        圖2 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠腎臟組織病理變化的影響(×200)Fig.2 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on pathological changes of kidneys in DN rats (× 200)

        3.5 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠腎組織Col-III和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

        如圖3所示,對照組大鼠腎間質(zhì)有少量Col-III和TGF-β1蛋白沉積;模型組大鼠腎小管間質(zhì)Col-III和TGF-β1陽性表達(dá)增加;化瘀通絡(luò)中藥組大鼠腎間質(zhì)Col-III和TGF-β1沉積減少。

        圖3 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠腎組織Col-III和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on expressions of Col-III and TGF-β1 in kidney tissue of DN rats

        3.6 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠腎組織TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響

        如圖4所示,與對照組比較,模型組大鼠TGF-β1mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,化瘀通絡(luò)中藥組大鼠TGF-β1mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

        圖4 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠腎組織TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響 (±s )Fig.4 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on TGF-β1 mRNA level in kidney tissue of DN rats (±s)

        3.7 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠腎組織p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表達(dá)的影響

        如圖5所示,與對照組比較,模型組大鼠腎組織p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01);與模型組比較,化瘀通絡(luò)中藥組大鼠腎組織p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。

        圖5 化瘀通絡(luò)中藥對DN大鼠腎組織p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表達(dá)的影響 (±s )Fig.5 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on expressions of p-c-Raf,p-MEK and p-ERK in kidney tissue of DN rats(±s)

        4 討論

        瘀血既是DN的主要病理產(chǎn)物,又是其重要致病因素,貫穿DN始終。DN病程冗長,葉天士在《臨證指南醫(yī)案》中強(qiáng)調(diào)“凡經(jīng)主氣,絡(luò)主血,久病血瘀”“初為氣結(jié)在經(jīng),久則血傷入絡(luò)”。瘀阻腎絡(luò),氣血不暢,水谷精微外泄而見蛋白尿;瘀血阻絡(luò),新血不生,脾腎失養(yǎng),水濕停滯,故見水腫;DN晚期,脾腎衰微、瘀血內(nèi)停、三焦壅滯、氣機(jī)逆亂,可見惡心、嘔吐、納差。因此,瘀血阻絡(luò)是貫穿DN全程的主體病機(jī)。化瘀通絡(luò)法是DN的基本治法,在辨證論證的基礎(chǔ)上加用化瘀通絡(luò)中藥成為治療DN的基本原則。課題組經(jīng)過多年的臨證篩選,最終確定了丹參、川芎、地龍、水蛭和全蝎5味中藥作為相對固定的治療DN的化瘀通絡(luò)藥物。《血證論·瘀血》謂“瘀血在經(jīng)絡(luò)臟腑之間,則結(jié)為癥瘕”,《醫(yī)宗必讀》曰“蓋積之為義,日積月累,匪伊朝夕”,可見瘀血久不消散,息以成積,深入于絡(luò),難以祛之,故在使用丹參、川芎常規(guī)活血化瘀藥物的基礎(chǔ)上,加用水蛭、地龍、全蝎等蟲類藥入絡(luò)搜剔,此5種藥合用,共奏化瘀通絡(luò)之效,可使絡(luò)脈得通、瘀滯盡去。

        DN的病理特征為正常腎單位丟失、大量肌成纖維細(xì)胞激活和增殖、ECM過度沉積、腎小球和腎小管基底膜增厚、腎小球內(nèi)K-W結(jié)節(jié)形成、小管間質(zhì)纖維化,最終導(dǎo)致DN腎纖維化[2]。膠原是ECM的骨架結(jié)構(gòu),Col-III是腎間質(zhì)ECM的主要成分。因此,檢測腎組織中Col-III蛋白表達(dá),對評估腎纖維化程度、判定DN預(yù)后具有重要意義。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠出現(xiàn)了DN典型的病理改變,腎組織Col-III蛋白表達(dá)增多,血清中肌酐、尿素氮、尿酸水平升高,表明DN模型制備成功;化瘀通絡(luò)中藥顯著減輕了腎病理損害和纖維化程度;模型組大鼠空腹血糖水平顯著升高,化瘀通絡(luò)中藥無明顯降糖作用,提示化瘀通絡(luò)中藥對DN的腎保護(hù)作用并不依賴于降低血糖。

        TGF-β1是腎纖維化的重要刺激因子,TGF-β1與細(xì)胞膜上的受體(TβRI、TβRII)結(jié)合,激活c-Raf/MEK/ERK途徑,在腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。c-Raf是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,活化的c-Raf磷酸化雙特異性激酶MEK,繼而磷酸化ERK,活性ERK易位進(jìn)入細(xì)胞核或在細(xì)胞質(zhì)中磷酸化多種底物,使細(xì)胞對外來信號產(chǎn)生生物學(xué)應(yīng)答[13]。ERK是絲裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinase,MAPK)中研究最廣泛的成員,ERK分為ERK1和ERK2 2種亞型,二者基因同源性為84%,負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、衰老、死亡、遷移等生理過程。白色念珠菌感染導(dǎo)致的小鼠腎纖維化模型中,TGF-β1/c-Raf/ERK1/2處于高度激活狀態(tài),c-Raf抑制劑可顯著減輕腎纖維化和損傷[14]。ERK信號通路在多種腎纖維化動物模型中均呈激活狀態(tài),抑制該通路可以改善腎纖維化[15-18]。TGF-β1可激活體外培養(yǎng)的足細(xì)胞ERK信號通路,并誘導(dǎo)金屬基質(zhì)蛋白酶-9表達(dá),從而抑制ECM降解[19]。在高糖處理的小鼠系膜細(xì)胞SV40-MES13中,抑制長非編碼RNA ANRIL可以通過抑制Wnt/β-catenin和MEK/ERK通路,從而抑制細(xì)胞增殖、炎癥和纖維化[20]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠腎組織中TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著升高,p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表達(dá)水平顯著升高;化瘀通絡(luò)中藥顯著下調(diào)TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)水平,顯著降低p-c-Raf、p-MEK和p-ERK蛋白表達(dá)水平,表明化瘀通絡(luò)中藥能夠抑制DN大鼠腎組織TGF-β1/ERK信號通路的激活。

        綜上所述,化瘀通絡(luò)中藥能夠改善DN大鼠的腎病理損傷和腎纖維化,其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/ERK信號通路有關(guān)。

        利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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