張夢(mèng)雪，王瑞瑩，李 楠，吳晨陽(yáng)，鄭婷婷，鄒佩志，韓 杰，張 運(yùn)，黎 迎，郭一飛,2，孫桂波,2，董政起,2*

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基于經(jīng)典名方的新藥發(fā)現(xiàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen被稱為“中藥之最珍貴者”，《中國(guó)藥典》2020年版中規(guī)定，三七皂苷R1含量作為判定三七質(zhì)量的主要指標(biāo)之一。三七皂苷R1是三七總皂苷的特征化合物，具有抗炎、改善糖尿病性視網(wǎng)膜病變[1]、保護(hù)心肌細(xì)胞[2]、減輕腦損傷[3]、促進(jìn)骨細(xì)胞生成[4]、抗腫瘤[5]、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖[6]等多重藥理作用。在臨床用藥過(guò)程中發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1的生物利用度較低，這主要是由于三七皂苷R1屬于生物制藥分類系統(tǒng)（biopharmaceutics clas-sification system，BCS）分類中Ⅳ類（低溶低滲）藥物[7]，低溶低滲的特性造成三七皂苷R1在經(jīng)口服給藥后，不易被轉(zhuǎn)運(yùn)吸收。

納米給藥體系（nanometer drug delivery system，NDDS）是納米級(jí)的遞送系統(tǒng)，在藥物遞送過(guò)程中具有增溶、緩釋、提高生物利用度等優(yōu)勢(shì)[8]。為了提高三七皂苷R1的口服生物利用度，提高藥效。目前有以納米材料為載體制備三七皂苷R1納米給藥體系的相關(guān)研究，如三七皂苷R1-聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米微球[9]、三七皂苷R1殼聚糖納米粒[10]等，證明均可提高三七皂苷R1的口服生物利用度。在納米載體的選擇上，目前常添加表面活性劑類，如聚山梨酯80；有機(jī)溶劑類，如聚乙二醇[11]；環(huán)糊精[12]等對(duì)難溶藥物進(jìn)行增溶。雖然起到了很好的作用，但此類外源化合物載體可能會(huì)引發(fā)安全性問(wèn)題，出現(xiàn)不良反應(yīng)等[13-14]。擬在三七自身尋找一種“自源性”成分作為藥物載體，在提高三七皂苷R1溶解度同時(shí)增強(qiáng)其治療效果。

近年來(lái)，天然多糖因其生物相容性好、來(lái)源廣泛、易降解等優(yōu)勢(shì)被廣泛關(guān)注[15]。提取三七皂苷類成分后的三七藥材殘?jiān)谐：兴苄缘娜叨嗵牵≒anax notoginsengpolysaccharide，PNP），安全、無(wú)毒、可降解，官能團(tuán)眾多，水溶性良好且具有一定黏性。此外PNP還具有降血糖[16]、促進(jìn)骨細(xì)胞生成[17]、抗氧化[18]、改善脂質(zhì)代謝紊亂[19]、抗腫瘤[20]、免疫調(diào)節(jié)[21]、抗衰老[22]等藥理作用。

基于多糖載體在納米給藥體系中的應(yīng)用，借鑒同源載體及藥物的協(xié)同作用，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究同樣源自于三七藥材的成分三七多糖，對(duì)其進(jìn)行分級(jí)純化得到低相對(duì)分子質(zhì)量三七多糖（low molecular weightPanax notoginsengpolysaccharide，PNP-L）作為遞送三七皂苷R1的載體，通過(guò)乳化溶劑揮發(fā)法形成納米粒，方法簡(jiǎn)單且未添加其他外源輔料，保證了制劑的安全性。探索PNP-L作為三七皂苷R1載體的優(yōu)勢(shì)以及聯(lián)用后對(duì)于缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，使其用于更多心腦疾病的治療。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；島津LC-20AD液相色譜儀，日本島津公司；Secura224-1CN電子分析天平，德國(guó)Satrorius公司；Zetasizer Nano ZS納米粒度及Zeta電位分析儀，英國(guó)Malvern公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SP131010-33Q加熱磁力攪拌器，美國(guó)Barnstead Thermolyne；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；JEM-1200EX（120 kV）透射電子顯微鏡（TEM），JEOL公司；Spark多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；Pion μDiss藥物溶解吸收測(cè)試系統(tǒng)，美國(guó)Pion公司；L550臺(tái)式低速大容量離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；371二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Scientific公司；Type III型厭氧手套培養(yǎng)箱，美國(guó)COY Laboratory；超凈工作臺(tái)，上海力申科學(xué)儀器有限公司；25 cm2培養(yǎng)瓶、96孔板，美國(guó)Corning公司。

1.2 藥品與試劑

三七皂苷R1（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.06%）、三七多糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%），上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展公司；娃哈哈純凈水；窄分布聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）標(biāo)樣組（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%），日本TOSOH（TSK東曹）公司；對(duì)照品葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、巖藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，對(duì)照品阿拉伯糖、N-乙酰-氨基半乳糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、N-乙酰-氨基葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，單糖對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、乙醇、濃硫酸、鹽酸，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、苯酚，天津市大茂化學(xué)試劑廠；正丁醇，北京化工廠；三氯甲烷，北京市通廣精細(xì)化工公司；硝酸鈉、疊氮化鈉、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、三氟乙酸，上海麥克林生化科技有限公司；醋酸雙氧鈾，北京中鏡科儀技術(shù)有限公司；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心；Cell Counting Kit-8，日本同仁公司；DMEM培養(yǎng)基、進(jìn)口胎牛血清，美國(guó)Gibco公司；胰酶細(xì)胞消化液，Beyotime公司；二甲基亞砜，美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 三七多糖的制備及性質(zhì)研究

2.1.1 三七多糖的分級(jí)純化 將三七多糖用Sevage法除蛋白后，根據(jù)葡聚糖凝膠色譜柱分子篩原理對(duì)其進(jìn)行分級(jí)色譜，每次取三七多糖100.0 mg溶解于2.0 mL水中，過(guò)0.45 μm濾膜，經(jīng)Sephadex G-100凝膠色譜柱（100 cm×2.0 cm），用純水洗脫，經(jīng)苯酚-硫酸法顯色后于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度，直至檢測(cè)不到吸光度，并繪制管數(shù)-吸光度曲線，得到2部分三七多糖，分開(kāi)收集并凍干機(jī)冷凍干燥24 h，記為高相對(duì)分子質(zhì)量三七多糖（high molecular weightPanax notoginsengpolysaccharide，PNP-H）、PNP-L。為確保每次多糖分離的重現(xiàn)性，需保證柱內(nèi)凝膠體積一致，上樣量與質(zhì)量濃度一致，如若體積流量變慢，則需更換新的凝膠，每次多糖分離均采用苯酚-硫酸法進(jìn)行吸光度測(cè)定，以此保證實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性。

2.1.2 三七多糖相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 選用TSK gel G4000 PWXL凝膠色譜柱；流動(dòng)相為0.05 mol/L硝酸鈉＋0.06%疊氮化鈉水溶液；體積流量0.6 mL/min；柱溫35 ℃；PEG標(biāo)樣組，相對(duì)分子質(zhì)量500～500 000；手動(dòng)六通閥進(jìn)樣器（定量環(huán)20 μL）。取三七多糖、PNP-H、PNP-L粉末，加純凈水制成10 mg/mL溶液，25 ℃超聲10 min，靜置3 h使其充分溶解，搖勻，5000 r/min離心10 min，取上清液作為供試品進(jìn)樣分析。另取PEG標(biāo)樣組，作為對(duì)照品溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，相對(duì)校正法測(cè)三七多糖、PNP-H、PNP-L的相對(duì)分子質(zhì)量。

重均相對(duì)分子質(zhì)量（Mw）和數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量（Mn）測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，Mn＝3124的PNP-L占比較大，約占三七多糖的82.21%，其余為Mn＝34 173的PNP-H。從相對(duì)分子質(zhì)量分布系數(shù)（Mw/Mn）來(lái)看，PNP-L值較小，說(shuō)明相對(duì)均一，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)PNP-L水溶性優(yōu)于PNP-H。通常情況下低相對(duì)分子質(zhì)量多糖相比于高相對(duì)分子質(zhì)量多糖水溶性好，生物相容度高，相對(duì)生物活性也更高[23]；此外，有研究發(fā)現(xiàn)低相對(duì)分子質(zhì)量多糖較高相對(duì)分子質(zhì)量多糖更易被益生菌利用，促進(jìn)益生菌的增殖效果更為顯著，對(duì)于腸道吸收的藥物具有現(xiàn)實(shí)意義[24]，因此，后續(xù)研究主要針對(duì)三七多糖和PNP-L展開(kāi)。

表1 三七多糖、PNP-H、PNP-L相對(duì)分子質(zhì)量Table 1 Molecular weight of PNP,PNP-H and PNP-L

2.1.3 單糖組成的測(cè)定 為進(jìn)一步了解多糖的組成，采用PMP衍生化/HPLC法對(duì)三七多糖、PNP-L水解產(chǎn)物的單糖組分進(jìn)行鑒定并用單標(biāo)定量法計(jì)算各單糖組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

（1）色譜條件：島津LC-20AD液相色譜儀；色譜柱為Xtimate C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（氫氧化鈉溶液調(diào)pH 6.70）-乙腈（83∶17）。

（2）對(duì)照品溶液：精密稱取甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、N-乙酰-氨基葡萄糖、葡萄糖、N-乙酰-氨基半乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖對(duì)照品適量，加水溶解稀釋至各對(duì)照品均為50 μg/mL的混合對(duì)照溶液。

（3）對(duì)照品溶液衍生：精確吸取250 μL混合對(duì)照溶液到5 mL EP管中，加入250 μL 0.6 mol/L NaOH水溶液、500 μL 0.4 mol/L PMP甲醇溶液，70 ℃條件下反應(yīng)1 h，冷水中冷卻10 min；加入500 μL 0.3 mol/L HCl水溶液中和，再加入1 mL氯仿漩渦1 min，3000 r/min離心10 min，小心取上清液，重復(fù)萃取3次，上清液用于HPLC分析。

（4）待測(cè)樣品水解：精密稱取三七多糖、PNP-L樣品適量至5 mL安培瓶中，加入5 mL，2 mol/L三氟乙酸于5 mL安瓿中，封管，110 ℃酸解4 h，取出揮干三氟乙酸后加1.0 mL水復(fù)溶。

（5）樣品溶液衍生：精確吸取250 μL樣品溶液到5 mL EP管中，加入250 μL 0.6 mol/L NaOH水溶液，500 μL 0.4 mol/L PMP甲醇溶液，70 ℃條件下反應(yīng)1 h，冷水中冷卻10 min；加入500 μL 0.3 mol/L HCl中和，再加入1 mL氯仿漩渦1 min，3000 r/min離心10 min，小心取上清液，重復(fù)萃取3次，取上清液，即得。

HPLC結(jié)果見(jiàn)圖1，單糖組成結(jié)果見(jiàn)表2，三七多糖主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖，還有少量葡萄糖醛酸、甘露糖、巖藻糖和半乳糖組成；PNP-L主要由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖，還有少量甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、巖藻糖組成。與三七多糖相比，PNP-L葡萄糖、甘露糖比例更高。

圖1 混合對(duì)照品 (A)、三七多糖 (B)、PNP-L (C) HPLC圖Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A),PNP (B)and PNP-L (C)

表2 三七多糖、PNP-L單糖組成Table 2 Monosaccharide ratio of PNP and PNP-L

2.2 三七皂苷R1納米粒載體的篩選

HPLC法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定納米粒中三七皂苷R1，通過(guò)考察和比較R1-PNP納米粒和R1-PNP-L納米粒的載藥量和包封率，篩選出三七皂苷R1納米粒最佳的多糖載體。

2.2.1 納米粒制備方法 采用溶劑揮發(fā)法制備納米粒，將三七多糖和PNP-L配制成1.0 mg/mL水溶液，三七皂苷R1配制為2.0 mg/mL乙醇溶液，按照藥載質(zhì)量比1∶2制備納米粒，用注射器（13 mm×0.45 mm）將三七皂苷R1乙醇溶液分別逐滴加入三七多糖和PNP-L水溶液中，超聲20 min，使其形成納米乳液，室溫下在磁力攪拌器上攪拌2 h除去有機(jī)溶劑，以13 000 r/min超速離心30 min收集納米粒，45 ℃真空干燥48 h后即得三七皂苷R1-三七多糖（R1-PNP）納米粒和三七皂苷R1-PNP-L（R1-PNP-L）納米粒。

2.2.2 三七皂苷R1含量測(cè)定方法

（1）色譜條件：色譜柱為Agilent TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（22∶78）；柱溫30 ℃；體積流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；進(jìn)樣量10 μL；理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3000[10]。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將三七皂苷R1配制成0.050、0.100、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL甲醇溶液，超聲后過(guò)0.45 μm濾膜，用HPLC測(cè)定三七皂苷R1質(zhì)量濃度，計(jì)算線性回歸方程。以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度的回歸方程為Y＝2.803 2X－30.699，r＝0.999 9，其線性范圍良好，線性范圍為0.050～1.000 mg/mL。

（3）精密度試驗(yàn)：分別配制低、中、高（0.050、0.125、1.000 mg/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度的三七皂苷R1對(duì)照品，測(cè)得各質(zhì)量濃度三七皂苷R1日內(nèi)精密度RSD分別為1.06%、0.25%、0.38%，日間精密度分別為1.75%、1.26%、1.19%，RSD均＜2%，表明該方法精密度良好。

（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)：配制0.1 mg/mL三七皂苷R1對(duì)照品甲醇溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8 h，測(cè)定其峰面積并計(jì)算得到RSD為1.22%，表明在室溫下8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，可滿足自動(dòng)進(jìn)樣的要求。

（5）重復(fù)性試驗(yàn)：平行制備6份0.1 mg/mL三七皂苷R1對(duì)照品溶液，相同條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到RSD為1.43%，說(shuō)明重復(fù)性良好。

（6）回收率試驗(yàn)：取未經(jīng)冷凍干燥空白納米粒1 mL，分別加入0.4、0.6、1.0 mg/mL的三七皂苷R1對(duì)照品甲醇溶液1 mL，每個(gè)濃度平行3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到平均回收率分別為98.27%、98.64%、99.21%，RSD分別為1.32%、1.86%、1.55%，符合含量測(cè)定的方法學(xué)要求。

2.2.3 載藥量和包封率的測(cè)定 制備納米粒時(shí)的藥物投入量記為W1，精確稱定凍干后的納米粒粉末，質(zhì)量記為W2；加入適量的甲醇溶液使納米粒完全溶解，采用“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定三七皂苷R1質(zhì)量濃度，得到納米粒中三七皂苷R1質(zhì)量（W3），根據(jù)下述公式計(jì)算載藥量和包封率。由表3可見(jiàn)，R1-PNP-L納米粒比R1-PNP納米粒載藥量和包封率均有顯著提高，因此，選擇PNP-L作為三七皂苷R1載體。

表3 納米粒的載藥量、包封率測(cè)定結(jié)果 (±s,n=3)Table 3 Measurement results of drug loading and encapsulation efficiency (±s,n=3)

表3 納米粒的載藥量、包封率測(cè)定結(jié)果 (±s,n=3)Table 3 Measurement results of drug loading and encapsulation efficiency (±s,n=3)

納米粒 載藥量/% 包封率/%R1-PNP 23.92±0.12 71.76±1.27 R1-PNP-L 28.62±0.14 85.85±1.21

2.3 納米粒對(duì)三七皂苷R1溶解度的影響

按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備R1-PNP-L納米粒，將三七皂苷R1與PNP-L按照質(zhì)量比1∶2溶于納米粒等體積的水中，玻璃棒攪拌至溶解即得物理混合制劑組，考察PNP-L的加入與不同結(jié)合方式對(duì)三七皂苷R1溶解度的影響。

采用Pion μDiss藥物溶解吸收測(cè)試系統(tǒng)，將過(guò)量的三七皂苷R1、R1-PNP-L物理混合制劑及R1-PNP-L納米粒溶于20 mL水中，并置于樣品杯中（保持三七皂苷R1質(zhì)量濃度相同），動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)三七皂苷R1、R1-PNP-L物理混合制劑及R1-PNP-L納米粒中三七皂苷R1的溶解度，37 ℃條件下以200 r/min的速度攪拌，采集間隔為60 s，直至溶解度在1 h內(nèi)保持穩(wěn)定，并按公式增溶倍數(shù)＝物理混合制劑或納米粒中三七皂苷R1溶解度/三七皂苷R1溶解度計(jì)算得相應(yīng)增溶倍數(shù)。由圖2可知，R1-PNP-L物理混合制劑將三七皂苷R1溶解度提升至22.75倍，納米粒將三七皂苷R1溶解度提升至32.26倍。

圖2 物理混合制劑、納米粒對(duì)三七皂苷R1溶解度的影響Fig.2 Solubilization effect of physical mixing and nanoparticles on notoginsenoside R1

實(shí)驗(yàn)均采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2種制劑與單獨(dú)使用三七皂苷R1相比，均具有顯著性（P＜0.001），納米粒組對(duì)于物理混合制劑組對(duì)提高溶解度也具有顯著性差異（P＜0.001），說(shuō)明PNP-L與三七皂苷R1聯(lián)用，可以有效提高三七皂苷R1在水中的溶解度，納米粒制劑在提高溶解度方面具有更加明顯的優(yōu)勢(shì)。

2.4 R1-PNP-L納米粒測(cè)量與表征

2.4.1 平均粒徑、多分散指數(shù)（PDI）、Zeta電位測(cè)定 取一定量的R1-PNP-L納米粒，在納米粒度及Zeta電位分析儀上分析其平均粒徑、PDI及Zeta電位，結(jié)果R1-PNP-L納米粒的平均粒徑為（139.17±7.22）nm，PDI為0.41±0.19，Zeta電位為（?19.14±3.14）mV。納米粒粒徑較小，Zeta電位較大。但PDI較大，這與PNP-L自身性質(zhì)有關(guān)，PNP-L成分復(fù)雜，已作均質(zhì)處理，為確保PNP-L保持其藥理活性，此處未針對(duì)PNP-L的PDI進(jìn)行過(guò)多優(yōu)化處理。

2.4.2 R1-PNP-L納米粒晶型分析 用DSC差示掃描量熱儀對(duì)三七皂苷R1、PNP-L、R1-PNP-L物理混合制劑、R1-PNP-L納米粒進(jìn)行分析。以空白坩堝為參比物，另一坩堝放入6～10 mg樣品，溫度范圍為40～200 ℃，10 ℃/min。氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，保護(hù)氣體積流量為60 mL/min；吹掃氣體體積流量為40 mL/min。由圖3可知，三七皂苷R1在174.43 ℃有1吸熱峰，判定為其熔融峰，在結(jié)晶之后熔融，PNP-L熔融峰為154.06 ℃，R1-PNP-L物理混合制劑在145.23、158.88 ℃存在2個(gè)熔融峰，說(shuō)明沒(méi)有形成一穩(wěn)定物質(zhì)，R1-PNP-L納米粒熔融峰為156.90 ℃，納米粒中三七皂苷R1的熔融峰完全消失，說(shuō)明三七皂苷R1被包載在載體中，該納米粒在人工模擬的胃腸液中6 h內(nèi)可穩(wěn)定存在，粒徑變化范圍較小，無(wú)肉眼可見(jiàn)沉淀產(chǎn)生，推測(cè)可有效減少三七皂苷R1在胃中被酸性環(huán)境破壞。

圖3 三七皂苷R1 (A)、PNP-L (B)、三七皂苷R1與PNP-L物理混合制劑 (C)、R1-PNP-L納米粒 (D) 的DSC圖Fig.3 DSC thermograms of notoginsenoside R1 (A),PN-L(B),physical mixed preparation of notoginsenoside R1 and PNP-L (C) and R1-PNP-L nanoparticles (D)

2.4.3 R1-PNP-L納米粒的形態(tài)學(xué)考察 將R1-PNPL納米粒負(fù)染制樣：將鍍碳支持膜銅網(wǎng)放到封口膜上，滴1滴樣品（約30 μm）到支持膜上，停留2～5 min，用帶尖的濾紙從邊緣部分吸去多余的溶液，拿到濾紙上停留10 min左右。再把干燥后的支持膜放到封口膜上，滴1滴醋酸雙氧鈾染液，染色90 s，用帶尖的濾紙吸去多余的染液，夾到濾紙上干燥3 h，在透射電鏡下觀察。如圖4所示，納米粒呈球狀，粒徑均為200 nm下。

圖4 R1-PNP-L的TEM圖Fig.4 TEM image of R1-PNP-L

2.5 體外釋藥特性研究

精密吸取三七皂苷R1質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的三七皂苷R1原料藥、R1-PNP-L物理混合制劑、R1-PNP-L納米粒各5 mL，裝入經(jīng)蒸餾水浸泡處理過(guò)的透析袋（相對(duì)分子質(zhì)量3000）內(nèi)，將袋口扎緊，以50 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）為釋放介質(zhì)。在37 ℃水浴恒溫?cái)嚢瑁?00 r/min）。在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)（0、1、2、4、6、8、10、12 h）取樣1 mL，同時(shí)補(bǔ)加相同體積釋放介質(zhì)。由于更換溶質(zhì)為PBS，因此按照“2.2.2”項(xiàng)下的色譜條件，重新進(jìn)樣測(cè)定后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到峰面積對(duì)質(zhì)量濃度的線性回歸方程為Y＝4.013 2X－0.316 4，r＝0.999 6，線性范圍49.2～1 000.4 μg/mL。將所取樣品10 000 r/min離心10 min后，取上清液通過(guò)HPLC法測(cè)定釋放介質(zhì)中三七皂苷R1的含量，計(jì)算累積釋放率（實(shí)驗(yàn)平行3份），繪制體外釋放曲線。由圖5可知，與三七皂苷R1原料藥相比，R1-PNP-L物理混合制劑組中的三七皂苷R1釋放速度略有減慢，說(shuō)明與PNP-L聯(lián)用可減緩三七皂苷R1釋放速率，但并不明顯；而納米粒組釋放速度明顯減慢，在4 h時(shí)，累積釋放率達(dá)到80.07%，10 h后累積釋放率達(dá)到90%以上，說(shuō)明具有一定的緩釋作用。這可能是由于三七皂苷R1與PNP-L通過(guò)氫鍵結(jié)合形成相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，可有效減緩三七皂苷R1的釋放速度。

圖5 三七皂苷R1體外釋放曲線 (±s,n=3)Fig.5 In vitro release curve of notoginsenoside R1 (±s,n=3)

2.6 R1-PNP-L納米粒細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

培養(yǎng)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞，按照1×105個(gè)/mL的密度鋪板，并在實(shí)驗(yàn)前生長(zhǎng)36 h。在96孔板中，移入SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞，加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2條件下孵育至鋪滿96孔板后，棄去原培養(yǎng)液。取三七皂苷R1、PNP-L、三七皂苷R1與PNP-L物理混合制劑、R1-PNP-L納米粒，用不含胎牛血清DMEM培養(yǎng)基配制成不同質(zhì)量濃度（12.5、62.5、125.0、250.0、500.0 μg/mL）的各藥物作為給藥組，以直接加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基作為對(duì)照組，用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力，用酶標(biāo)儀在450 nm下測(cè)量每個(gè)孔的吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力，SPSS軟件計(jì)算是否有顯著性差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

細(xì)胞活力＝(給藥組或模型組細(xì)胞吸光度值－本底吸光度值)/(對(duì)照細(xì)胞吸光度值－本底吸光度值)

由圖6可知，三七皂苷R1、PNP-L、R1-PNP-L物理混合制劑、R1-PNP-L納米粒在500.0 μg/mL內(nèi)對(duì)正常SH-SY5Y細(xì)胞安全、無(wú)毒性，與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，可在此范圍內(nèi)選擇適合的濃度開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

圖6 三七皂苷R1 (a)、PNP-L (b)、R1-PNP-L物理混合制劑 (c)、R1-PNP-L納米粒 (d) 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響Fig.6 Effects of notoginsenoside R1 (a),PNP-L (b),R1-PNP-L physical mixed preparation (c),and R1-PNP-L nanoparticles (d) on viability of SH-SY5Y cells

2.7 R1-PNP-L納米粒對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞接種在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰酶消化并收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度1×105個(gè)/mL并加入到96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，在5%CO2，37 ℃培養(yǎng)條件下孵育24 h，至細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合率，棄舊培養(yǎng)液，依次加入12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL質(zhì)量濃度的三七皂苷R1、R1-PNP-L物理混合制劑、R1-PNP-L納米粒。作用2 h后，在厭氧培養(yǎng)箱中缺氧處理4.5 h，再移入CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧2 h構(gòu)建缺氧/復(fù)氧模型。復(fù)氧2 h后，避光加入CCK-8，每孔10 μL。1.5 h后，在酶標(biāo)儀上450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，計(jì)算每孔細(xì)胞活力，SPSS軟件計(jì)算是否有顯著性差異。

由圖7可知，R1-PNP-L物理混合組相比于三七皂苷R1，細(xì)胞活力略有提高，在低質(zhì)量濃度12.5 μg/mL時(shí)，差異顯著（P＜0.01），三七皂苷R1、R1-PNP-L納米粒對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的凋亡具有抑制作用，并均呈劑量相關(guān)性，隨著藥物質(zhì)量濃度的提高，存活的細(xì)胞比例升高。各質(zhì)量濃度R1-PNP-L納米粒與三七皂苷R1單用相比，細(xì)胞活力均有顯著提高。

圖7 三七皂苷R1、R1-PNP-L物理混合、R1-PNP-L納米粒對(duì)SH-SY5Y缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用Fig.7 Protective effects of notoginsenoside R1,R1-PNP-L physical mixed preparation,R1-PNP-L nanoparticles on SH-SY5Y hypoxia-reoxygenation

在100 μg/mL時(shí)，納米粒組與單獨(dú)用三七皂苷R1相比，細(xì)胞活力從49.66%提升至61.60%。推測(cè)PNP-L具有PNP的抗氧化、抗炎等多重作用，與三七皂苷R1聯(lián)用在低濃度時(shí)有效抑制了缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)作用，而納米粒組更易被細(xì)胞攝取發(fā)揮藥效。

3 討論

PNP-L水溶性良好，以溶劑揮發(fā)法包載三七皂苷R1，采用毒性較低的乙醇作為有機(jī)相且未引入其他外源輔料，可以最大限度保證制劑的“自源性”。由于多糖成分復(fù)雜且具有一定的黏性，有著大量官能團(tuán)，因此，PNP-L在包載三七皂苷R1的過(guò)程中可能起到一種天然的表面活性劑的作用[25]，能夠有效提高中藥成分的溶解度以提高生物利用度。由于人體內(nèi)缺乏直接分解非淀粉類多糖的酶類，因此非淀粉類多糖難以被胃腸道消化吸收，并且對(duì)胃腸動(dòng)力有一定的積極作用[26]，這為多糖作載體的納米粒提供了口服給藥的可能性。

PNP-L相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)均一，相比于PNP來(lái)說(shuō)在水溶液中性質(zhì)更加穩(wěn)定，R1-PNP-L納米粒在模擬人工胃、腸液中穩(wěn)定性良好，6 h內(nèi)粒徑未有明顯變化，無(wú)可見(jiàn)沉淀產(chǎn)生。由于PNP-L組成中主要單糖為葡萄糖，推測(cè)可給受損的SH-SY5Y細(xì)胞提供能量；此外，PNP也具有抗炎、抗氧化等多重藥理作用，可能與三七皂苷R1配伍發(fā)揮協(xié)同作用，因此R1-PNP-L納米粒比單獨(dú)使用三七皂苷R1時(shí)對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡效果增強(qiáng)。

作為藥物遞送載體，中藥多糖本身成分復(fù)雜，因此如何控制多糖的質(zhì)量，還需不斷地探索，應(yīng)從產(chǎn)地、運(yùn)輸方式、儲(chǔ)存方法、含量及單糖組成等加以控制，才有可能大范圍應(yīng)用到臨床用藥中。本實(shí)驗(yàn)采用葡聚糖凝膠柱分離三七多糖，為保證分離完全，選擇相對(duì)細(xì)且長(zhǎng)的凝膠柱且上樣量較小，可減少多糖在柱內(nèi)凝膠的吸附，結(jié)果更加準(zhǔn)確且有利于凝膠的重復(fù)利用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PNP-L有成為一種遞送三七皂苷類成分良好載體的潛力，有利于三七資源可持續(xù)利用，對(duì)于其他皂苷成分是否具有普適性仍需繼續(xù)驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突