曾文芳，李亞姝，崔曉寧，劉艷君，胡桂馨

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

氮是植物生長發(fā)育必需的三大營養(yǎng)元素之一，可提高植物光合能力，從而促進(jìn)植物生長[1]。相比之下，植物對氮素的需求量高于其他各種元素，這是因?yàn)槿~綠體中的葉綠素a與葉綠素b都需要氮素，葉綠體中氮素含量可達(dá)到葉片干重的20%～30%[2]。施氮可以增加紫花苜蓿葉片葉綠素含量[3]，提高分枝期葉片水分利用效率[4]，增強(qiáng)葉片的凈光合速率，最終促進(jìn)植物快速生長[3,5]。缺氮時(shí)，葉片中葉綠素含量下降，葉片黃化[6]。隨氮素施用量的增加，葉片中的葉綠素含量升高[7]。同樣，在低氮脅迫條件下，植物凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率降低，胞間CO2濃度顯著升高[8]。施氮后，葉片凈光合速率、水分利用率增加，蒸騰速率、胞間CO2濃度和氣孔導(dǎo)度降低，并且顯著促進(jìn)了葉綠素合成[19]。因此，施氮對植物生長發(fā)育具有重要意義。

薊馬是制約紫花苜蓿生產(chǎn)的主要害蟲。在寧夏對紫花苜蓿薊馬的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，薊馬的發(fā)生率達(dá)到100%，輕者造成5%的產(chǎn)量損失，重者毀產(chǎn)[10]，其中以牛角花齒薊馬(Odontothripsloti)為害最為嚴(yán)重[11]。在紫花苜蓿營養(yǎng)生長階段，薊馬主要采食紫花苜蓿的幼嫩組織，隨著葉片的生長展開，被害的心葉和嫩葉兩側(cè)逐漸開始卷曲、皺縮、變黃[12]，從而使紫花苜蓿的光能利用能力下降，光合效率降低[13]。研究表明，施鉀可以提高播種當(dāng)年紫花苜蓿葉片的光合速率和蒸騰速率，使氣孔導(dǎo)度增大[14]；施磷后紫花苜蓿的葉片凈光合速率和水分利用率顯著升高，蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度顯著降低，使紫花苜蓿受薊馬為害程度顯著降低[15]。目前，紫花苜蓿的施氮研究主要在提高產(chǎn)量和品質(zhì)方面，尚不明確施氮后紫花苜蓿對薊馬為害的反應(yīng)及其與光合作用的關(guān)系。因此，本試驗(yàn)以紫花苜蓿品種甘農(nóng)3號和甘農(nóng)9號為試驗(yàn)材料，探索施氮后紫花苜蓿對薊馬為害的反應(yīng)，以及葉片葉綠素與光合能力的變化，揭示施氮對紫花苜?？顾E馬的影響以及在光合方面的響應(yīng)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫花苜蓿材料：甘農(nóng)3號紫花苜蓿(Medicagosativacv.Gannong No.3)，甘農(nóng)9號紫花苜蓿(Medicagosativacv.Gannong No.9)

供試蟲源：牛角花齒薊馬(Odontothripsloti)

試驗(yàn)肥料：氮肥為尿素(含N 46%，重慶建峰化工股份有限公司生產(chǎn))，磷肥為過磷酸鈣(含P2O512%，甘肅金昌化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限公司)，鉀肥為硫酸鉀(含K2O 52%，華墾國際貿(mào)易有限公司)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草實(shí)訓(xùn)基地網(wǎng)室中進(jìn)行。取大田土，自然風(fēng)干，測定其N、P、K含量。于2019年4月底，選用直徑27 cm、高30 cm的圓柱形塑料花盆，每盆裝土5 kg，土壤速效氮為31.14 mg/kg，速效磷為3.68 mg/kg，速效鉀為22.27 mg/kg。設(shè)置4個(gè)施氮處理：0.15、0.3、0.45、0.6 g/盆，分別記為N1、N2、N3、N4，1個(gè)不施氮肥處理為對照(0 g/盆)，記為N0。P、K肥為同一水平，P肥0.25 g(P2O5)/盆、K肥0.3 g(K2O)/盆。穴播甘農(nóng)3號和甘農(nóng)9號紫花苜蓿，每個(gè)品種每處理12盆。在紫花苜蓿4葉期間苗，每盆保留長勢一致的紫花苜蓿20株。初花期刈割，待再生紫花苜蓿植株長至20 cm時(shí)，按3頭/枝條接入牛角花齒薊馬成蟲，任其取食為害。分別于接蟲后第7 d和14 d，評價(jià)紫花苜蓿的受害程度，測定紫花苜蓿葉片(倒4葉，受害級別1～2級)的葉綠素含量和光合參數(shù)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 受害指數(shù) 除去紫花苜蓿上的薊馬后，按照紫花苜蓿薊馬為害分級標(biāo)準(zhǔn)[16]，調(diào)查記錄每株紫花苜蓿位于上部三分之一、長度大于4 mm的全部葉片的受害級數(shù)，并按下式計(jì)算受害指數(shù)：

1.3.2 葉綠素含量的測定 稱取剪碎的新鮮葉片0.2 g，共3份，放入試管，加入10 mL浸提液(按丙酮∶乙醇=5∶5)，放入暗處提取24 h，其間搖動數(shù)次，混合均勻，即得到葉綠素的提取液。以浸提液為空白，在波長646，663和470 nm下測定吸光值。

Ca(葉綠素a濃度；mg/L) =12.21D663 nm-2.81D646 nm；

Cb(葉綠素b濃度；mg/L) = 20.13D646 nm-5.03D663 nm；

Cc(類胡蘿卜素濃度；mg/L)=(1 000D470nm-3.27 Ca-104 Cb) /229

葉綠素含量(mg/g) = (色素的濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù))/ 樣重

1.3.3 氣體交換參數(shù)的測定 于接蟲后7 d和14 d，利用GFS-3000光合儀測定甘農(nóng)3號和甘農(nóng)9號倒4葉的氣體交換參數(shù)。CO2濃度固定為370 μmol/mol，光子量照度設(shè)定為1 400 μmol/(m2·s)，設(shè)定后，最小穩(wěn)定時(shí)間設(shè)定為120 s，當(dāng)測量結(jié)果變異率小于0.5時(shí)，記錄測定指標(biāo)，每處理3次重復(fù)。測定指標(biāo)包括：凈光合速率[Pn：μmol/(m2·s)]、蒸騰速率[E：mmol/(m2·s)]、氣孔導(dǎo)度[Gs：mmol/(m2·s)]、胞間CO2濃度(Ci：μmol/mol)，并計(jì)算水分利用效率(WUE：mmol/mol)，公式為WUE= Pn/ E。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果。利用單因素方差分析(Duncan法，顯著性水平為α=0.05)比較不同施氮處理下紫花苜蓿植株的受害指數(shù)、葉綠素含量、氣體交換參數(shù)的差異；采用Excel 2016進(jìn)行圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施氮水平下紫花苜蓿受害指數(shù)的變化

2個(gè)紫花苜蓿品種的受害指數(shù)均升高，且隨著施氮量的增加呈先升后降的趨勢。隨著為害時(shí)間的增加，2個(gè)紫花苜蓿品種的受害指數(shù)逐漸升高。為害7 d后，兩個(gè)紫花苜蓿品種的受害指數(shù)在N2處理下最大，分別較N0處理增加了39.93%(P<0.05)和20.06%；為害14 d后，甘農(nóng)3號的受害指數(shù)在N3處理下最大，較N0處理增加了28.51%(P<0.05)，甘農(nóng)9號受害指數(shù)在N1處理下最大，較N0處理增加了23.97%(P<0.05)(表1)。

表1 不同施氮水平下紫花苜蓿的受害指數(shù)

2.2 不同施氮水平下紫花苜蓿受薊馬為害后葉綠素含量的變化

2.2.1 薊馬為害7 d后紫花苜蓿葉綠素含量的變化 2個(gè)紫花苜蓿品種葉綠素含量均增加(圖1)。在N3處理下，甘農(nóng)3號的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b和類胡蘿卜素含量均最大，分別較N0處理增加了28.43%、35.71%、29.94%和27.13%。在N2處理下，甘農(nóng)9號葉綠素a和葉綠素a+b含量最大，分別較N0處理增加了8.11%和10.24%(P<0.05)；在N1處理下，甘農(nóng)9號葉綠素b和類胡蘿卜素含量最大，分別較N0處理增加了30.03%和13.99%。

2.2.2 薊馬為害14 d后紫花苜蓿葉綠素含量的變化 在N2處理下，甘農(nóng)3號葉綠素a、葉綠素a+b和類胡蘿卜素含量均最大，分別較N0處理增加了15.21%、13.97%和26.40%(P>0.05)；在N3處理下，葉綠素b含量最大，較N0處理增加了21.84%(P>0.05)。在N2處理下，甘農(nóng)9號葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b和類胡蘿卜素含量最大，分別較N0處理增加了35.37%、53.21%、39.07%(P<0.05)和51.61%(P>0.05)(圖2)。

圖1 薊馬為害7 d后不同施氮水平下紫花苜蓿的葉綠素含量Fig.1 Chlorophyll content of alfalfa infested by O.loti for 7 days under different nitrogen application levels

圖2 薊馬為害14 d后不同施氮水平下紫花苜蓿的葉綠素含量Fig.2 Chlorophyll content of alfalfa infested by O.loti for 14 days under different nitrogen application levels

2.3 不同施氮水平下紫花苜蓿受薊馬為害后氣體交換參數(shù)的變化

2.3.1 薊馬為害7 d后不同施氮水平下紫花苜蓿氣體交換參數(shù)的變化 2個(gè)紫花苜蓿品種的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和水分利用率均高于對照，胞間CO2濃度低于對照(表2)。在N3處理下，甘農(nóng)3號紫花苜蓿的凈光合速率最大，較N0顯著增加了121.11% (P<0.05)，在N2處理下，甘農(nóng)9號紫花苜蓿的凈光合速率最大，較N0處理顯著增加了44.26% (P<0.05)。在N2處理下，甘農(nóng)3號紫花苜蓿的蒸騰速率最大，較N0增加了15.74% (P>0.05)，在N3處理下，甘農(nóng)9號紫花苜蓿的蒸騰速率最大，較N0處理增加了19.31% (P>0.05)。在N1處理下，甘農(nóng)3號紫花苜蓿的氣孔導(dǎo)度最大，較N0增加了34.92% (P>0.05)，在N3處理下，甘農(nóng)9號紫花苜蓿的氣孔導(dǎo)度最大，較N0處理顯著增加了42.89% (P<0.05)。在N1處理下，甘農(nóng)3號紫花苜蓿的胞間CO2濃度最小，較N0顯著減少了34.91% (P<0.05)，在N4處理下，甘農(nóng)9號紫花苜蓿的胞間CO2濃度最小，較N0處理減少了36.25% (P<0.05)。在N3處理下，甘農(nóng)3號紫花苜蓿的水分利用率最大，較N0顯著增加了88.65% (P<0.05)，在N2處理下，甘農(nóng)9號紫花苜蓿的水分利用率最大，較N0處理增加了23.27% (P>0.05)。

表2 薊馬為害7 d后不同施氮水平下紫花苜蓿的氣體交換參數(shù)

2.3.2 薊馬為害14 d后不紫花苜蓿氣體交換參數(shù)的變化 2個(gè)紫花苜蓿品種的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度均低于對照，水分利用率高于對照處理。在N2處理下，甘農(nóng)3號紫花苜蓿的凈光合速率、蒸騰速率、胞間CO2濃度均最小，分別較N0減少了19.32%、20.84%和38.98%(P>0.05)，在N1處理下，甘農(nóng)9號紫花苜蓿的凈光合速率、蒸騰速率、胞間CO2濃度均最小，分別較N0減少了20.57%、22.06%和32.65%(P>0.05)。在N3處理下，甘農(nóng)3號紫花苜蓿的氣孔導(dǎo)度最小，較N0減少了30.32% (P>0.05)，在N1處理下，甘農(nóng)9號紫花苜蓿的氣孔導(dǎo)度最小，較N0處理減少了24.36% (P>0.05)。隨施氮量的增加，2個(gè)紫花苜蓿品種的水分利用率持續(xù)上升，在N4處理下，甘農(nóng)3號和甘農(nóng)9號的水分利用率分別較N0增加了8.75%和10.49%(P>0.05)。

表3 薊馬為害14 d后不同施氮水平下紫花苜蓿的氣體交換參數(shù)

3 討論

土壤養(yǎng)分如氮、磷、鉀和一些微量元素的多寡影響植物抗蟲性的表達(dá)[17]，其中氮元素是一個(gè)關(guān)鍵的因子[18]。氮肥施用過多，作物易受病蟲危害[19]。隨著施氮水平的提高，水稻對褐飛虱和白背飛虱的抗性下降[20-21]。單施氮肥會明顯降低棉株的抗蚜和耐蚜力[22]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)施氮后，2個(gè)紫花苜蓿品種的受害指數(shù)均升高，說明施氮使紫花苜蓿對薊馬的抗性降低。

葉綠素是光合作用的基礎(chǔ)，研究表明，氮素與葉綠素的含量密切相關(guān)[23-25]，氮添加處理后紫花苜蓿葉綠素含量的增加，為光合生長提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)[26]，但過高的氮素添加又會導(dǎo)致葉綠素含量的降低[27]。紫花苜蓿葉片葉綠素含量隨紫花苜蓿受薊馬為害程度的增加而降低[13]。本試驗(yàn)中，施氮紫花苜蓿的葉綠素含量始終高于對照(N0)，表明施氮可以增加紫花苜蓿葉片的葉綠素含量。但隨著薊馬為害時(shí)間的增加，紫花苜蓿受害程度加重，葉綠素含量減少。

施氮可以改善植物的光合特性[28-29]。氮素添加能夠提高生長前期紫花苜蓿的凈光合速率，但在生長后期，高濃度氮素添加抑制了植物的光合作用[30]。同時(shí)，施氮也可以提高害蟲取食速率[31]，進(jìn)而影響光合能力。薊馬輕度為害條件下，紫花苜蓿凈光合速率升高，但隨著薊馬為害程度的增加，紫花苜蓿葉片中胞間CO2濃度、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度升高，凈光合速率降低[13]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)為害初期(為害7 d后)的紫花苜蓿葉片受害程度較輕，光合作用增強(qiáng)，而為害14 d后，光合作用減弱。表明施氮雖然可以增加紫花苜蓿葉片中的葉綠素含量，但施氮更促進(jìn)了薊馬的取食為害，導(dǎo)致紫花苜蓿光合速率下降。試驗(yàn)中，隨著受害程度的增加，施氮后紫花苜蓿葉片的氣孔導(dǎo)度減小，光合作用所需的CO2不足，光合能力降低。

本試驗(yàn)原計(jì)劃在紫花苜蓿6葉期進(jìn)行，但由于試驗(yàn)實(shí)施期間降水頻繁，大田采集牛角花齒薊馬成蟲困難，因此，推遲于第2茬進(jìn)行。本試驗(yàn)僅在盆栽條件下初步研究了施氮對紫花苜蓿抗性的影響，應(yīng)開展大田試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

施氮后紫花苜蓿的抗薊馬性下降；在薊馬為害初期，葉綠素含量增加，光合作用增強(qiáng)；隨著為害程度的加重，葉片中的葉綠素含量、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度均下降，光合作用物質(zhì)基礎(chǔ)的來源受阻，光合速率下降，導(dǎo)致紫花苜蓿對牛角花齒薊馬的抗(耐)害性下降。