王 寧，劉金彪

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院甲狀腺外科,洛陽(yáng) 471003)

目前，甲狀腺癌已成為全球范圍內(nèi)發(fā)病率上升最快的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，但在臨床上其具體的發(fā)病機(jī)制尚未明確，多認(rèn)為是由碘攝入不足或過(guò)量、接觸大量放射性碘或頸部放射線(xiàn)照射等原因引起甲狀腺激素異常分泌，最終導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞的惡變及癌變[1-2]。甲狀腺癌大多因無(wú)痛性頸部腫塊就診，并伴有呼吸困難、聲音嘶啞等；部分患者可能會(huì)出現(xiàn)淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處器官組織的侵犯和轉(zhuǎn)移[3-4]。甲狀腺癌根據(jù)病理類(lèi)型主要分為乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌和髓樣癌，其中以乳頭狀癌最為常見(jiàn)[5-6]。由于甲狀腺癌對(duì)一般的臨床化療藥物并不敏感，因此選擇特異性的靶向治療藥物已成為臨床治療的主要研究方向。依維莫司能通過(guò)持續(xù)有效地抑制哺乳動(dòng)物的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，發(fā)揮抑制腫瘤新生血管形成、腫瘤生長(zhǎng)與增殖、腫瘤營(yíng)養(yǎng)代謝等三重抗腫瘤作用[7]。國(guó)外的研究中[8]，依維莫司在臨床上批準(zhǔn)用于治療晚期乳腺癌、腎癌等，但依維莫司對(duì)于甲狀腺癌的療效及具體機(jī)制尚未明確。本研究主要通過(guò)給裸鼠甲狀腺癌動(dòng)物模型進(jìn)行依維莫司藥物治療，觀察和探討依維莫司對(duì)甲狀腺惡性腫瘤的治療和緩解作用，及mTOR介導(dǎo)的細(xì)胞自噬信號(hào)通路在此過(guò)程中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

依維莫司(瑞士諾華制藥有限公司，注冊(cè)證號(hào)H20150093，規(guī)格2.5 mg/片)；多克隆抗體mTOR、LC-3II、p62、Atg5、NF-κB、三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH,美國(guó)SantaCruz生物技術(shù)有限公司)；山羊抗兔IgG二抗(AP堿性磷酸酶標(biāo)記，上海碧云天生物工程有限公司，批號(hào)A0423，100 μl)。NIH3T3 “HOOK3-RET”所構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞株，甲狀腺癌細(xì)胞株SW579(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))。

1.2 儀器

Prime Script?RT和SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒(日本TaKaRa生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/C裸鼠，雌性，5～8周，體重15～20 g，實(shí)驗(yàn)室許可證號(hào)：SYXK(豫)2019-0002。晝夜循環(huán)光照(12 h/12 h)，溫度為(22±2)℃。選用小鼠胚胎成纖細(xì)胞(NIH3T3)穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建甲狀腺腫瘤BALB/C裸鼠皮下移植模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和治療組，每組30只。參考李毅等[2]構(gòu)建BALB/C裸鼠甲狀腺腫瘤的皮下移植模型的方法：采用含15%胎牛血清的培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2適應(yīng)性培養(yǎng)NIH3T3 1周，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%～90%左右，用0.25%胰酶消化，1000 r/min離心10 min，并制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整其濃度為1×107/ml。于裸鼠的頸背部皮下注射細(xì)胞懸液100 μl。每隔1天稱(chēng)量裸鼠體重，精密測(cè)量裸鼠腫瘤體積。治療組：造模成功后給予依維莫司(1.5 mg/kg)連續(xù)灌胃(ig)給藥30天[8]。模型組：造模成功后給予生理鹽水(1.5 mg/kg)連續(xù)灌胃給藥30天；對(duì)照組：未進(jìn)行造模實(shí)驗(yàn)，并灌胃給予等計(jì)量生理鹽水。

1.4 細(xì)胞分組和處理

研究發(fā)現(xiàn)依維莫司抑制細(xì)胞半數(shù)增殖的濃度為7.5 nmol/L[9]，因此將5 nmol/L定義為低劑量，10 nmol/L定義為高劑量。用不同濃度的依維莫司處理SW579細(xì)胞株培養(yǎng)48 h，分別為空白組、低劑量組和高劑量組(依維莫司0、5和10 nmol/L)制備成細(xì)胞懸液接種于96孔板中，更換培養(yǎng)基后加入10 μl CCK8試劑，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h，賽默飛FC/K3全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，并計(jì)算SW579細(xì)胞存活率。用AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行染色，貝克曼庫(kù)爾特Cyto FLEX流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)檢測(cè)SW579細(xì)胞凋亡率，象限取Q2，檢測(cè)晚期細(xì)胞凋亡。

1.5 腫瘤指標(biāo)觀察及測(cè)定

依據(jù)O’Reilly等[10]的研究，使用依維莫司(1.5 mg/kg)進(jìn)行小鼠實(shí)驗(yàn)。依維莫司連續(xù)灌胃給藥30天結(jié)束后，麻醉處死全部小鼠并獲取甲狀腺腫瘤，用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤長(zhǎng)徑(L)和短徑(W)，計(jì)算腫瘤體積：V=L×W2×0.52，測(cè)定甲狀腺腫瘤裸鼠瘤體體積和重量。然后將瘤體固定于10%中性福爾馬林，采用石蠟包埋，常規(guī)脫水、透明及浸蠟包埋，連續(xù)石蠟切片6張(5 μm/張)，切片用于HE染色。

1.6 Western Blot法檢測(cè)甲狀腺癌組織相關(guān)蛋白表達(dá)水平

取BALB/C裸鼠甲狀腺腫瘤組織剪碎后放入勻漿器反復(fù)抽吸，12 000 r/min(4 ℃)離心10 min，提取蛋白，調(diào)整蛋白水平為30 μg/μl。各組蛋白樣品在10% SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜，加入大鼠多克隆抗體mTOR、LC-3II、p62、Atg5、NF-κB、GAPDH和二抗。顯色采用ECL顯色劑，Bio-Pro Bio-Red XRS+凝膠成像分析儀(美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)成像，各泳道條帶進(jìn)行灰度掃描得出相應(yīng)蛋白表達(dá)量，采用Quantity-one軟件進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 裸鼠瘤體體積和重量

模型組和治療組裸鼠在細(xì)胞移植后逐漸成瘤，治療前瘤體體積和重量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。隨移植時(shí)間延長(zhǎng)，模型組裸鼠的瘤體體積和重量逐漸增大(P<0.05)；給予依維莫司后，治療組裸鼠的瘤體體積和重量逐漸降低(P<0.05)。見(jiàn)表1和圖1。

表1 裸鼠瘤體體積和體重變化情況

圖1 裸鼠瘤體圖片

2.2 HE染色結(jié)果

對(duì)照組裸鼠甲狀腺細(xì)胞輪廓正常清晰、胞漿豐富、核仁明顯、異型性明顯；模型組和治療組甲狀腺細(xì)胞呈島狀生長(zhǎng)方式，可見(jiàn)細(xì)胞壞死、細(xì)胞核分裂增多、細(xì)胞輪廓消失模糊不清；治療組較模型組甲狀腺細(xì)胞恢復(fù)，甲狀腺細(xì)胞壞死數(shù)量減少、異型性降低。見(jiàn)圖2。

圖2 甲狀腺細(xì)胞HE染色結(jié)果(400×)

2.3 Western Blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，模型組和治療組LC-3II、Beclin-1和Atg5蛋白水平降低，模型組mTOR、p62和NF-κB蛋白水平增加(P<0.05)；與模型組相比，治療組LC-3II、Beclin-1和Atg5蛋白水平升高，mTOR、p62和NF-κB蛋白水平降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

與對(duì)照組相比，a：P<0.05；與模型組相比，b：P<0.05

2.4 SW579細(xì)胞存活和細(xì)胞凋亡檢測(cè)

低劑量組和高劑量組的SW579細(xì)胞存活率均低于對(duì)照組，而SW579細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組；隨著依維莫司劑量的升高，SW579細(xì)胞存活率降低，SW579細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

與對(duì)照組相比，a：P<0.05

3 討論

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖與能量代謝的作用，可以抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生[11-12]。有研究證明[13-14]，AMPK/AKT/mTOR信號(hào)通路與甲狀腺腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)?；罨南佘账峄罨鞍准っ窤MPK可以負(fù)調(diào)節(jié)mTOR，在富含氨基酸和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子等充足時(shí)，細(xì)胞中被激活的mTOR可以阻斷下游自噬通路；反之mTOR活性受抑制，從而解除對(duì)自噬通路的抑制。細(xì)胞自噬與細(xì)胞增殖和存活等多種信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)，可加速誘導(dǎo)細(xì)胞的損傷和死亡[15]。自噬激活的主要細(xì)胞學(xué)標(biāo)志LC3存在于前自噬泡和自噬泡膜表面，主要用于調(diào)控mTOR信號(hào)通路[16]。Beclin1的復(fù)合體Beclin1-PI3KC3通過(guò)LC3結(jié)合參與自噬體的形成，p62是SQSTMI編碼的泛素結(jié)合蛋白，其參與自噬相關(guān)蛋白和泛素蛋白酶系統(tǒng)降解[17-18]。下游NF-κB是mTOR信號(hào)通路的主要效應(yīng)靶蛋白，可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及凋亡基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[19-20]。

本研究結(jié)果表明，模型組和治療組裸鼠在細(xì)胞移植后逐漸成瘤。隨移植時(shí)間延長(zhǎng)，模型組裸鼠的瘤體體積和重量逐漸增大；給予依維莫司治療后，治療組裸鼠的瘤體體積和重量逐漸降低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組裸鼠甲狀腺細(xì)胞輪廓正常清晰、胞漿豐富、核仁明顯、異型性明顯。模型組和治療組甲狀腺細(xì)胞呈島狀生長(zhǎng)方式，可見(jiàn)細(xì)胞壞死、細(xì)胞核分裂增多、細(xì)胞輪廓消失模糊不清；治療組較模型組甲狀腺細(xì)胞恢復(fù)，說(shuō)明給予裸鼠依維莫司治療后可有效緩解裸鼠體內(nèi)的成瘤情況和改善甲狀腺組織的損傷。低劑量組和高劑量組的SW579細(xì)胞存活率均低于對(duì)照組，而SW579細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組；且隨著依維莫司劑量的升高，SW579細(xì)胞存活率降低，SW579細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，說(shuō)明依維莫司可誘導(dǎo)SW579細(xì)胞凋亡，且隨著劑量的增加，其效果越強(qiáng)。模型組和治療組LC-3II、Beclin-1和Atg5蛋白水平降低；mTOR、p62和NF-κB蛋白水平增加；與模型組相比，治療組LC-3II、Beclin-1和Atg5蛋白水平升高；mTOR、p62和NF-κB蛋白水平降低，說(shuō)明依維莫司可有效抑制mTOR靶點(diǎn)，調(diào)控細(xì)胞自噬通路，從而抑制甲狀腺腫瘤生長(zhǎng)與增殖的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

綜上所述，mTOR及其誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬信號(hào)通路在甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展及治療過(guò)程中具有一定的調(diào)控作用；且mTOR抑制劑依維莫司可以通過(guò)抑制mTOR介導(dǎo)的自噬信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡，起到治療甲狀腺癌的作用。