趙松子

（江西省林業(yè)科學(xué)院·江西省油茶種質(zhì)資源保護(hù)與利用實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013）

種子大小是對(duì)作物產(chǎn)量具有重要影響的數(shù)量性狀，擬南芥（Arabidopsis thaliana）CYP78A 亞基因家族基因參與種子大小的遺傳控制，該調(diào)控機(jī)制在植物中似乎是相當(dāng)保守的。擬南芥有6 個(gè)CYP78A 基因，分別 為KLU/CYP78A5、EOD3/CYP78A6、CYP78A7、CYP78A8、CYP78A9 和CYP78A10；CYP78A5 通過(guò)增加細(xì)胞分裂來(lái)促進(jìn)葉、花和種子的生長(zhǎng)，CYP78A5 功能缺失突變體的細(xì)胞分裂停止較早，導(dǎo)致花瓣、萼片、葉、莖等器官變小[1-4]；CYP78A6 在幾乎所有組織或器官遍在性地表達(dá)，功能缺失突變體沒(méi)有突變表型，過(guò)表達(dá)能增加種子大小[5]；CYP78A7 功能缺失突變體似乎具有正常表型，但CYP78A5 和CYP78A7 的雙突變體產(chǎn)生胚柄向胚的轉(zhuǎn)換并常在胚期死亡，幸存的植株矮小，并且不能產(chǎn)生種子[2]；CYP78A8 和CYP78A9 的雙突變體產(chǎn)生種子數(shù)量較少[6]；CYP78A9 過(guò)表達(dá)導(dǎo)致果莢變大，只產(chǎn)生少量種子[7]，通過(guò)RNAi 沉默櫻桃（Prunus avium）PaCYP78A9 可以使果實(shí)變小[8]；大豆（Glycine max）GmCYP78A10（CYP78A51）是CYP78A10的同源基因，野生大豆（G.soja）GmCYP78A10 的野生等位型與大豆的高產(chǎn)等位型間存在3 個(gè)SNP，等位型的不同導(dǎo)致種子重量7.2%的差異[9]。

油茶是山茶科山茶屬（Camellia）中油用物種的總稱，主要包括普通油茶（Camellia oleifera）、小果油茶（C.oleiferavar.monosperma）、攸縣油茶（C.yuhsienensis）、越南油茶（C. vietnamensis）、浙江紅花油茶（C.chekiangoleosa）、廣寧紅花油茶（C. semiserrata）、宛田紅花油茶（C. polydonta）、騰沖紅花油茶（C. reticulata）等[10-11]。油茶種子大小在物種內(nèi)和物種間均存在明顯差異，并且物種間的差異大于物種內(nèi)的差異。黃勇等調(diào)查了小果油茶18 個(gè)不同群體，種子長(zhǎng)度為12.75~19.52 mm，種子寬度為10.82~16.23 mm[12]；馬力等調(diào)查了11 種山茶屬植物，最大的為越南油茶，種子千粒質(zhì)量為1 878.77 g，最小的為攸縣油茶，千粒質(zhì)量為450.55 g[13]。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)主要是以1~6 個(gè)核苷酸為基本重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù)序列，利用SSR 差異可以開(kāi)發(fā)SSR 標(biāo)記，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好及共顯性等優(yōu)點(diǎn)。油茶物種間雜交具有較高的親和力，如越南油茶×小果油茶的座果率達(dá)36.6%[10]，物種間種子大小的巨大差異為超高產(chǎn)雜交育種提供了良好的材料，鑒別油茶種子大小等產(chǎn)量性狀相關(guān)基因，開(kāi)發(fā)與之緊密連鎖的SSR 標(biāo)記，可以開(kāi)展分子標(biāo)記輔助育種，有助于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量性狀相關(guān)優(yōu)良等位基因的聚合，大幅提高油茶產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從種植于江西省林業(yè)科學(xué)院院內(nèi)的油茶良種“贛無(wú)1 號(hào)”采收成熟種子，室內(nèi)發(fā)芽后采集長(zhǎng)約0.5 cm的根尖組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。

1.2 油茶根轉(zhuǎn)錄組分析

采集油茶根尖組織，委托深圳華大基因科技服務(wù)有限公司提取RNA 并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共得到40 529 966 條讀段，讀長(zhǎng)為90 nt，去除的低質(zhì)數(shù)據(jù)后得到37 184 398 條讀段。經(jīng)過(guò)SOAP 軟件的拼接，獲得90 698 條Unigene。經(jīng)與NR、NT、SwissProt、KEGG、COG 及GO 等6 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定CDS 有63 008 條。

1.3 生物信息學(xué)鑒定

利用BLAST 軟件，以擬南芥的CYP78A10 蛋白質(zhì)序列搜索油茶良種贛無(wú)1 的幼葉、未成熟種仁、花蕾、根轉(zhuǎn)錄組CDS 數(shù)據(jù)庫(kù)[14-16]，得到同源基因的部分CDS 序列及其蛋白質(zhì)序列，用Boetie2[17]軟件將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)單讀段比對(duì)到CDS 序列，根據(jù)讀段編號(hào)用自編的Perl 腳本提取成對(duì)的讀段，在默認(rèn)狀態(tài)下用Cap3 軟件[18]進(jìn)行序列拼接，獲得同源基因的mRNA 序列；再用Boetie2軟件將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)單讀段比對(duì)到mRNA 序列，提取成對(duì)的讀段，用Cap3 軟件再進(jìn)行序列拼接，獲得新的mRNA 序列；重復(fù)上述過(guò)程，直到mRNA 序列不再延伸。

用油茶CYP78A10 同源基因的mRNA 序列搜索油茶良種贛無(wú)1 基因組三代測(cè)序數(shù)據(jù)[19]，得到含有油茶CYP78A10 同源基因mRNA 序列的亞讀段；亞讀段經(jīng)過(guò)校正后，用Augustus[20]軟件進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，得到油茶CYP78A10 同源基因的全長(zhǎng)CDS 序列。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用COBALT[21]軟件對(duì)油茶CYP78A10 同源基因及玉米（Zea mays）、大豆、松樹(shù)（Pinus radiata）、擬南芥、水稻（Oryza sativa）、苔蘚（Physcomitrella patens）等植物中已鑒別的CYP78A 進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對(duì)，構(gòu)建CYP78A 蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Neighbor-joining 法)。

1.5 SSR 位點(diǎn)信息分析

用Boetie2 軟件將15 個(gè)油茶良種（贛無(wú)1、贛無(wú)2、贛190、贛447、贛70、贛撫20、贛6、贛永5、贛8、贛石84-3、贛石83-4、贛石84-8、贛無(wú)12、興46、贛無(wú)15）的GBS 分析數(shù)據(jù)[22]以及油茶幼葉、未成熟種仁、花蕾、根轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[14-16]比對(duì)到油茶CYP78A10 同源基因的基因組序列或mRNA 序列。用自編的Perl 腳本對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，提取成對(duì)比對(duì)、讀段距離小于300bp、僅比對(duì)1 次的讀段用于搜索SSR 序列。

搜索SSR 序列：用自編的Perl 腳本對(duì)油茶CYP78A10 同源基因的基因組序列及提取的GBS 和轉(zhuǎn)錄組讀段進(jìn)行SSR 序列搜索；搜索SSR 序列的條件為：?jiǎn)魏塑账岬闹貜?fù)次數(shù)≥16，二核苷酸的重復(fù)次數(shù)≥8，三核苷酸的重復(fù)次數(shù)≥5，四核苷酸的重復(fù)次數(shù)≥4，五核苷酸的重復(fù)次數(shù)≥3，六核苷酸的重復(fù)次數(shù)≥3。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶CYP78A10 同源基因

以擬南芥的CYP78A10 基因序列分別搜索油茶幼葉、未成熟種仁、花蕾、根轉(zhuǎn)錄組CDS 數(shù)據(jù)庫(kù)，各得到1條最佳匹配序列，合計(jì)4 條序列，經(jīng)過(guò)序列比對(duì)，從花蕾和根中得到的2 條序列為CYP78A10 的同源基因；將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)單讀段比對(duì)到油茶CYP78A10 的同源基因序列，提取成對(duì)讀段，用Cap3 軟件進(jìn)行序列拼接，獲得油茶CYP78A10 同源基因的mRNA 序列。

用油茶CYP78A10 同源基因的mRNA 序列分別搜索油茶基因組三代測(cè)序數(shù)據(jù)，得到2 條亞讀段，亞讀段經(jīng)過(guò)校正后，長(zhǎng)度分別為40817bp（GenBank 登錄號(hào)：MW143063）、15341bp（GenBank 登錄號(hào)：MW143061），用Augustus 軟件進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，得到油茶CYP78A10同源基因的全長(zhǎng)mRNA 序列、全長(zhǎng)CDS 序列及aa 序列，其結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的拼接結(jié)果基本一致，2個(gè)基因分別命名為CoCYP78A10a（GenBank 登錄號(hào)：MW143062）、CoCYP78A10b （GenBank 登錄 號(hào)：MW143060），其aa 序列相似度為81.02%。

2.2 植物CYP78A 蛋白質(zhì)序列進(jìn)化分析

用油茶CYP78A10 同源基因及其它植物中CYP78A 亞基因家族的29 條蛋白質(zhì)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（表1、圖1），結(jié)果表明，CoCYP78A10a 和CoCYP78A10b 與CYP78A10、GmCYP78A10（CYP78A51）、CYP78A68 在一個(gè)分支，是CYP78A10 的同源基因，可能參與油茶種子大小的調(diào)控。

表1 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中的CYP78A 蛋白質(zhì)及其編號(hào)Tab. 1 CYP78A proteins in phylogenetic tree and their accession numbers.

2.3 SSR 位點(diǎn)信息分析

對(duì)CoCYP78A10a 和CoCYP78A10b 的基因組序列進(jìn)行分析，分別搜索到7、15 個(gè)SSR 位點(diǎn)（表2）。用贛無(wú)1 等15 個(gè)油茶良種（表3）的GBS 分析數(shù)據(jù)與SSR位點(diǎn)的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（表3）表明：CoCYP78A10a的7 個(gè)SSR 位點(diǎn)在GBS 數(shù)據(jù)中未檢測(cè)到；CoCYP78A10b 的15 個(gè)SSR 位點(diǎn)中，在GBS 數(shù)據(jù)中檢測(cè)到5 個(gè)，其中，SSR8、SSR17 和SSR18 具有多態(tài)性。SSR18 與CoCYP78A10b 的轉(zhuǎn)錄、翻譯起始位點(diǎn)分別距離814bp、1009bp；SSR18 的基本重復(fù)單位為TTTCT，具有4 種重復(fù)序列，即4 個(gè)等位位點(diǎn)，分別為：(TTTCT)3、(TTTCT)4、(TTTCT)5、(TTTCT)6，不同等位位點(diǎn)測(cè)序深度的比例基本合理。

圖1 油茶及其它植物中CYP78A 蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 1 Neighbor-joining phylogenetic tree of CYP78A proteins in Camellia oleifera and other plants

在CoCYP78A10a 的7 個(gè)SSR 位點(diǎn)中，SSR7 位于第1 外顯子5’端的非翻譯區(qū)，與翻譯起始位點(diǎn)距離35bp，用油茶幼葉、未成熟種仁、花蕾、根轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與CoCYP78A10a 的mRNA 序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（表4）表明：SSR7 具有多態(tài)性；基本重復(fù)單位為CT，具有8 種重復(fù)序列，即8 個(gè)等位位點(diǎn)，分別為：即(CT)9、(CT)10、(CT)11、(CT)13、(CT)14、(CT)15、(CT)17、(CT)18；花蕾中有3 個(gè)等位位點(diǎn)，代表油茶良種贛無(wú)1 中SSR7 的多態(tài)性；根和種仁中分別有5、3 個(gè)等位位點(diǎn)，其中5 個(gè)等位位點(diǎn)是花蕾中所沒(méi)有的，由于油茶是異花授粉，根和種仁是贛無(wú)1 與其它品系雜交所得，其等位位點(diǎn)代表油茶群體中SSR7 的多態(tài)性。

表2 CoCYP78A10a 和CoCYP78A10b 基因組序列中的SSR位點(diǎn)Tab. 2 SSR loci in CoCYP78A10a and CoCYP78A10b genome sequences

3 結(jié)論與討論

本研究從油茶轉(zhuǎn)錄組CDS 數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出2 條與擬南芥CYP78A10 基因同源的CDS 序列，從油茶基因組三代測(cè)序數(shù)據(jù)中得到其完整的基因組序列及全長(zhǎng)CDS 序 列，并分別命名 為 CoCYP78A10a、CoCYP78A10b。經(jīng)與其它植物的CYP78A 基因序列進(jìn)行比對(duì)分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，CoCYP78A10a、CoCYP78A10b 與CYP78A10、GmCYP78A10 在一個(gè)分支，是CYP78A10 的同源基因，可能參與種子大小的調(diào)控。

對(duì)CoCYP78A10a 和CoCYP78A10b 的基因組序列進(jìn)行SSR 位點(diǎn)信息分析，分別搜索到7、15 個(gè)SSR 位點(diǎn)。用贛無(wú)1 等15 個(gè)油茶良種的GBS 數(shù)據(jù)，以及油茶幼葉、未成熟種仁、花蕾、根轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)SSR 位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行分析，SSR7、SSR8、SSR17 和SSR18 具有多態(tài)性；SSR7 位于CoCYP78A10a 第1 外顯子5’端的非翻譯區(qū)，與翻譯起始位點(diǎn)距離35bp；SSR18 位于CoCYP78A10b 的啟動(dòng)子區(qū)，與轉(zhuǎn)錄、翻譯起始位點(diǎn)分別距離814bp、1009bp。

表3 SSR18 等位位點(diǎn)在不同良種中的測(cè)序深度Tab. 3 Sequencing depth of SSR18 alleles in different cultivars

表4 SSR7 等位位點(diǎn)在不同組織中的測(cè)序深度Tab. 4 Sequencing depth of SSR7 alleles in different tissues

總體而言，油茶SSR 標(biāo)記開(kāi)發(fā)比較盲目，成功率比較低，主要原因是沒(méi)有PCR 產(chǎn)物或PCR 產(chǎn)物沒(méi)有多態(tài)性，如：Jia 等合成了150 對(duì)SSR 引物，檢測(cè)了20 個(gè)品種，只有52 對(duì)具有多態(tài)性[23]；李海波等合成了89 對(duì)SSR 引物，只有32 對(duì)能有效擴(kuò)增[24]；閆蕊等用163 對(duì)SSR 引物檢測(cè)了5 個(gè)品種，48 對(duì)引物具有多態(tài)性[25]。利用油茶基因組數(shù)據(jù)搜索SSR 位點(diǎn)，結(jié)合GBS 數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析SSR 位點(diǎn)的多態(tài)性，有利于提高SSR 標(biāo)記開(kāi)發(fā)的成功率。未來(lái)將圍繞CoCYP78A10a、CoCYP78A10b 挖掘出更多的多態(tài)性位點(diǎn)，并轉(zhuǎn)換成分子標(biāo)記，以便對(duì)油茶種質(zhì)資源群體進(jìn)行種子大小的關(guān)聯(lián)分析，研究CoCYP78A10a 和CoCYP78A10b 的功能。