謝文佩，章 昱

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)食品科學(xué)系，廣西 南寧 530222）

廣西是一個(gè)農(nóng)業(yè)比重較大的省份，其獨(dú)特的資源優(yōu)勢(shì)和氣候條件，十分適宜亞熱帶水果的生長(zhǎng)。廣西水果產(chǎn)量位居全國(guó)第五，其中有不少地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，如永福羅漢果、容縣沙田柚、百色芒果等。但是這些水果不易貯存，除少部分用于直接銷售鮮食外，大部分用于加工，在加工的過程中產(chǎn)生了大量的加工副產(chǎn)物及廢棄物，比如菠蘿皮芯、芒果皮、柚子皮等，有研究表明果皮的抗氧化能力、VC含量及多酚含量相近或高于果肉[1-2]，其中還含有糖類和膳食纖維等，富含有益健康的營(yíng)養(yǎng)成分[3]和較多的生理活性物質(zhì)，能在發(fā)酵中提供碳源，抑制雜菌生長(zhǎng)，有利于發(fā)酵[4-5]。這些副產(chǎn)物及廢棄物如若處理不當(dāng)，不僅污染環(huán)境，同時(shí)浪費(fèi)了大量的生物資源。

經(jīng)發(fā)酵后的酵素液包含了植物原料和微生物原有的維生素及功能性化學(xué)物質(zhì)，還有發(fā)酵生成的一些生理活性物質(zhì)如次生代謝產(chǎn)物、抗氧化成分、醇類、酯類、酶類等[6]。目前，有關(guān)單種的果皮酵素或水果酵素研究較多[7-9]，但4種及以上的復(fù)合型酵素研究和報(bào)道不多。市面上的酵素大致分為果蔬類、糧谷類、中草藥類等[10]，發(fā)酵方式有自然發(fā)酵和經(jīng)人工接種酵母菌、乳酸菌等微生物進(jìn)行發(fā)酵，菌種影響酵素的生理活性和安全性，縮短了發(fā)酵時(shí)間[11]，對(duì)產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝和品質(zhì)起到一定的作用[12]。Liao等[13]利用乳酸菌發(fā)酵芒果汁，提高了芒果汁的活性物質(zhì)含量和抗氧化活性；Ghosh等[14]研究表明，乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸能夠使原料中活性物質(zhì)溶出并呈游離態(tài)。廣西富產(chǎn)的芒果、柚子、菠蘿等水果香氣濃郁，芬芳怡人，結(jié)合廣西特色羅漢果作為天然甜味劑，其熱量低、風(fēng)味佳、兼具多重功能特性，刺梨富含超氧化物歧化酶（SOD），營(yíng)養(yǎng)豐富[15]，具有獨(dú)特的酸味，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，添加糖及能參與調(diào)節(jié)生理功能機(jī)制的益生元低聚半乳糖[16]，有利于提高酵素的香氣和口感。

本研究結(jié)合本地區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)特色，聯(lián)合廣西果蔬加工企業(yè)，高效綜合利用果蔬加工廢棄物，變廢為寶，通過校企聯(lián)合，使水果加工產(chǎn)物創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。探究水果酵素的制備，通過Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化，并對(duì)其進(jìn)行抗氧化能力的測(cè)定，以期為促進(jìn)廣西大宗特色水果加工及副產(chǎn)物產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

菠蘿、柚子、火龍果、芒果、羅漢果、刺梨、紅糖：均為市售；安琪酵母酸奶發(fā)酵劑8菌型：購(gòu)于安琪酵母旗艦店；低聚半乳糖：量子高科（中國(guó)）生物股份有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（分析純）、三羥甲基氨基甲烷（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；鹽酸（分析純）：廉江市愛廉化試劑有限公司；鄰苯三酚（分析純）：天津市博迪化工有限公司；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）（含10%～20%苯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗壞血酸（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；759s紫外可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；TD-5臺(tái)式低速離心機(jī)：四川蜀科儀器有限公司；手持折射儀0～90%Brix（糖）：邦西儀器科技（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

原料預(yù)處理→稱重→加入羅漢果→打漿→煮沸→加入刺梨、紅糖、低聚半乳糖→裝壇→冷卻→接種→密封→發(fā)酵→離心、過濾→裝瓶→成品

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 原料預(yù)處理

挑選成熟、無腐爛蟲害的菠蘿、柚子、火龍果、芒果，清洗、瀝干后削皮，備用。

1.2.2.2 稱重、打漿

稱取菠蘿皮、柚子皮、火龍果皮、芒果皮各100 g，加入6 g羅漢果，加入其總質(zhì)量2倍的水，放入破壁機(jī)打碎成漿。

1.2.2.3 煮沸

將打好的漿液煮沸至起泡，加入8 g刺梨、適量紅糖、2%低聚半乳糖（占漿液總質(zhì)量百分比）。

1.2.2.4 接種、密封

將冷卻好的漿液于超凈臺(tái)接入菌種1 g，搖晃均勻，密封。

1.2.2.5 發(fā)酵

將發(fā)酵后的漿液放在恒溫培養(yǎng)箱恒溫發(fā)酵。

1.2.2.6 離心、過濾

將完成發(fā)酵的果皮酵素置于低速離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速4 000 r/min，時(shí)間15 min后過濾取濾液。

1.2.3 果皮酵素單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用超氧化物歧化酶活性和感官評(píng)分這兩個(gè)指標(biāo)，選擇發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和紅糖添加量這3個(gè)因素設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)。

（1）發(fā)酵時(shí)間：在發(fā)酵溫度40℃，紅糖添加量10%條件下，分析發(fā)酵時(shí)間（5、10、15、20、25 d）對(duì)果皮酵素SOD活性及感官評(píng)分的影響。

（2）發(fā)酵溫度：在發(fā)酵時(shí)間10 d，紅糖添加量10%條件下，分析發(fā)酵溫度（36、38、40、42、44℃）對(duì)果皮酵素SOD活性及感官評(píng)分的影響。

（3）紅糖添加量：在發(fā)酵溫度40℃，發(fā)酵時(shí)間20 d條件下，分析紅糖添加量（5%、10%、15%、20%、25%）對(duì)果皮酵素SOD活性及感官評(píng)分的影響。

1.2.4 果皮酵素發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，結(jié)合SOD活性和感官評(píng)分分析，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，因素水平如表1所示。

表1 果皮酵素發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test of pericarp fermentation

1.2.5 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.5.1 感官評(píng)定

邀請(qǐng)10位食品專業(yè)同學(xué)作為評(píng)價(jià)員對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)定，果皮酵素感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 果皮酵素感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表Table 2 Sensory scoring criteria for pericarp enzymes

1.2.5.2 超氧化物歧化酶活性

參照GB/T 5009.171—2003[17]中的方法測(cè)定，其中在特定條件下，1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1微摩爾底物，或者底物中1微摩爾有關(guān)基團(tuán)所需的酶量，稱為一個(gè)國(guó)際單位（U）。

1.2.5.3 抗氧化活性

參照T/SHRH 006—2018《化妝品-自由基（DPPH）清除實(shí)驗(yàn)方法》[18]中的方法測(cè)定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2018 64Bit軟件制表格及作圖，Design Expert V8.0.6軟件制圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)果皮酵素品質(zhì)的影響

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，果皮酵素的SOD活性及感官評(píng)分均先上升后下降，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為15 d時(shí)，感官評(píng)分及SOD活性出現(xiàn)最大值，分別為91.3分、239 U/mL，酵素品質(zhì)較好。發(fā)酵時(shí)間小于15 d時(shí)，SOD活性和感官評(píng)分偏低，主要是因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間過短導(dǎo)致菌種產(chǎn)酸量較低、風(fēng)味物質(zhì)不足；發(fā)酵時(shí)間大于15 d時(shí)，過度繁殖的微生物會(huì)消耗酵素里的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，次級(jí)代謝產(chǎn)物增多，導(dǎo)致酵素口感由醇厚變得稀薄，偏酸，營(yíng)養(yǎng)成分下降[19]。因此，發(fā)酵時(shí)間選取15 d為宜。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)果皮酵素SOD活性及感官評(píng)分的影響Fig.1 Effects of fermentation time on SOD activities and sensory scores of pericarp enzymes

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)果皮酵素品質(zhì)的影響

由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的增加，果皮酵素的SOD活性呈先上升后平緩的趨勢(shì)，感官評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)。發(fā)酵溫度影響益生菌的生長(zhǎng)進(jìn)而影響發(fā)酵的速度和乳酸的積累[20]，當(dāng)發(fā)酵溫度為40℃時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大，果皮酵素口感順滑，風(fēng)味較佳，SOD活性處于上升趨勢(shì)，達(dá)到較高值（165 U/mL）；當(dāng)發(fā)酵溫度為42℃時(shí)，微生物對(duì)糖的利用降低，產(chǎn)酸變少，SOD活性達(dá)到最大值（180 U/mL），但感官評(píng)分降低，果香味較淡，局部帶有少許雜色，帶有苦味；繼續(xù)升高發(fā)酵溫度，發(fā)酵速度過快，加速了菌種老化[21]，活性物質(zhì)無明顯變化或減少，產(chǎn)品口感較為粗糙，苦味較重；溫度降低影響益生菌的發(fā)酵速率，產(chǎn)活性物質(zhì)少。綜合考慮，確定單因素最佳發(fā)酵溫度為40℃。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)果皮酵素SOD活性及感官評(píng)分的影響Fig.2 Effects of temperatures on SOD activities and sensory scores of pericarp enzymes

2.1.3 紅糖添加量對(duì)果皮酵素品質(zhì)的影響

如圖3所示，當(dāng)紅糖添加量由5%升至15%時(shí)，隨著碳源的增加，產(chǎn)品中的活性物質(zhì)含量升高，果皮酵素口感得到提升；在紅糖添加量為20%時(shí)，SOD活性達(dá)到最高值（270 U/mL），感官評(píng)分較高，說明此糖度對(duì)發(fā)酵酵素較為適宜；當(dāng)紅糖添加量高于20%時(shí)，對(duì)產(chǎn)品的口感有消極影響，同時(shí)糖添加量過多形成高滲狀態(tài)，菌體利用糖源轉(zhuǎn)化成乳酸的能力下降，活力和生長(zhǎng)速率被抑制[22]。因此，選取紅糖添加量為20%時(shí)較為適宜。

圖3 紅糖添加量對(duì)果皮酵素SOD活性及感官評(píng)分的影響Fig.3 Effects of brown sugar additions on SOD activities and sensory scores of pericarp enzymes

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

利用Design Expert 8.06響應(yīng)面軟件的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)3因素3水平優(yōu)化工藝參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

SOD是產(chǎn)品功效的重要指標(biāo)之一，為了更好更客觀地評(píng)價(jià)產(chǎn)品的品質(zhì)，故選取SOD活性作為主要指標(biāo)進(jìn)行分析。應(yīng)用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)表3的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到果皮酵素SOD活性（Y1）的回歸方程為：

Y1=296.80+20.75A-9.25C+11.25AB-30.25AC-11.75BC-28.28A2-62.27B2-51.20C2

對(duì)SOD活性的二次回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface design and results

表4 SOD活性回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model on SOD activities

由表4可見，回歸模型極顯著（P=0.008 1＜0.01），調(diào)整決定系數(shù)=0.777 7，回歸模型的決定系數(shù)R2=0.902 8，說明該模型能解釋90.28%的變差，且該回歸模型與試驗(yàn)擬合較好，能真實(shí)地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，各影響因子對(duì)果皮酵素SOD活性影響程度由大到小依次為：A紅糖添加量＞C發(fā)酵溫度＞B發(fā)酵時(shí)間，二次項(xiàng)B2對(duì)果皮酵素SOD活性影響極顯著（P＜0.01），C2的影響顯著（P＜0.05），可對(duì)果皮酵素SOD活性進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

為進(jìn)一步探討發(fā)酵時(shí)間、溫度、紅糖添加量?jī)蓛傻慕换プ饔脤?duì)果皮酵素SOD活性的影響，繪制響應(yīng)面圖，如圖4、5、6所示。

圖4 紅糖添加量及發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)SOD活性的影響Fig.4 Interaction effects of brown sugar additions and fermentation time on SOD activities

圖5 紅糖添加量及發(fā)酵溫度的交互作用對(duì)SOD活性的影響Fig.5 Interaction effects of brown sugar additions and temperatures on SOD activities

圖6 發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)SOD活性的影響Fig.6 Interaction effects of temperatures and fermentation time on SOD activities

由圖4～6可以看出，紅糖添加量和發(fā)酵溫度交互作用的響應(yīng)曲面圖最陡，二者的相互影響作用最明顯。隨著紅糖添加量和發(fā)酵溫度的增大，SOD活性呈先增大后基本保持不變的趨勢(shì)，說明酵素中的SOD活性己趨于最大值。

經(jīng)過響應(yīng)面分析得出以SOD活性為考察指標(biāo)的果皮酵素發(fā)酵最佳工藝為：發(fā)酵時(shí)間14.41 d，溫度39.61℃，紅糖添加量17.05%?？紤]實(shí)際操作，各參數(shù)稍作調(diào)整為：發(fā)酵溫度40℃，紅糖添加量17%，發(fā)酵時(shí)間15 d，SOD預(yù)測(cè)值為301.791 U/mL。按此工藝進(jìn)行平行試驗(yàn)，測(cè)得果皮酵素的SOD活性為300 U/mL，感官評(píng)分為95分。實(shí)測(cè)結(jié)果和預(yù)測(cè)結(jié)果接近，表明模型擬合良好，參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.3 抗氧化活性分析

檢測(cè)最優(yōu)工藝條件下制備果皮酵素的抗氧化活性，由表5可知，發(fā)酵后酵素液的SOD活性從247.5 U/mL提高到300 U/mL，高出了52.5 U/mL，表明通過發(fā)酵果皮酵素中的SOD活性明顯提高，與單一的菠蘿（6.39 U/mL）、芒果（11.56 U/mL）、火龍果（4.71 U/mL）、柚子（2.51 U/mL）酵素相比[23]，混合果皮酵素SOD活性明顯升高；取濃度100%果皮酵素，發(fā)酵后對(duì)DPPH自由基清除率從64.6%增加到75.3%，但均低于4 mg/mL VC的DPPH自由基清除率。

表5 發(fā)酵前后功能活性物質(zhì)比較Table 5 Comparison of functional active substances before and after fermentation

3 結(jié)論

本研究結(jié)合廣西地區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)特色，聯(lián)合廣西果蔬加工企業(yè)，通過對(duì)廣西大宗特色水果的果皮酵素的發(fā)酵工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究，結(jié)果表明，果皮酵素最佳工藝為：發(fā)酵時(shí)間15 d，發(fā)酵溫度40℃，紅糖添加量17%。該工藝下發(fā)酵得到的酵素產(chǎn)品呈紅棕褐色，富有果香味，口感細(xì)膩，SOD活性為300 U/mL，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)75.3%。