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        剁辣椒中抗氧化功能乳酸菌的篩選及應(yīng)用研究

        2021-05-27 00:48:06胡德宜張菊華
        保鮮與加工 2021年5期
        關(guān)鍵詞:能力

        史 婷,劉 偉,許 彎,胡德宜,張菊華,*

        (1.湖南大學(xué)研究生院隆平分院,湖南 長沙 410125;2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,湖南 長沙 410125;3.湖南省火辣辣食品有限公司,湖南 寧鄉(xiāng) 410600)

        辣椒富含多酚、VB1、VB2、類黃酮、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分,能有效預(yù)防高血壓、糖尿病等疾病[1]。近年來的研究表明,辣椒中的辣椒紅素具有預(yù)防老化、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[2]、緩解疼痛[3]的功效。剁辣椒是湖南省的一種特色腌菜及傳統(tǒng)調(diào)味品,辣椒剁碎后經(jīng)過自然發(fā)酵加工制成的剁辣椒,口感鮮辣脆爽,易消化又能使食欲增強(qiáng),深受大家喜愛。剁辣椒目前大多采用自然發(fā)酵,發(fā)酵時間久、易受污染、發(fā)酵結(jié)果不可控,嚴(yán)重影響了剁辣椒生產(chǎn)的規(guī)?;蜆?biāo)準(zhǔn)化。

        果蔬發(fā)酵制品中乳酸菌的篩選及功能活性評價已成為國內(nèi)外的研究熱點。目前已開展了泡菜、刺山柑、辣椒等發(fā)酵蔬菜高蛋白酶活性、降膽固醇等功能乳酸菌的篩選,且對其自由基清除能力、耐酸耐膽鹽等方面進(jìn)行抗氧化體系評價[4-5]。Wang等[6]采用高通量測序分析了剁辣椒發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的動態(tài)和多樣性,得出乳酸菌是起主要作用的微生物。乳酸菌不僅可抑制腐敗菌的生長,產(chǎn)生獨特的風(fēng)味物質(zhì),還能調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群平衡[7-8]、抗衰老[9]、防治抑郁癥[10]等。乳酸菌作為新型抗氧化劑在食品加工中的應(yīng)用已備受關(guān)注。國內(nèi)抗氧化乳酸菌的篩選已有一些研究,如夏海燕等[11]從酢辣椒篩選出的短乳桿菌L3-5和發(fā)酵乳桿菌17-1具有較強(qiáng)的抗氧化能力;黃煜等[12]從皖北地區(qū)腌制菜中篩選出的菌株7-1的抗氧化能力比較強(qiáng);肖宇等[13]從藏靈菇中篩選出優(yōu)勢菌-開菲爾乳桿菌具有較強(qiáng)的抗氧化活性。目前所篩選的菌株存在發(fā)酵環(huán)境適應(yīng)性差、單菌種發(fā)酵加工產(chǎn)品風(fēng)味不足、品質(zhì)參差不齊等問題。多菌種發(fā)酵具有發(fā)酵快、風(fēng)味濃郁等特點[14],本研究擬通過乳酸菌的抗氧化能力初篩(H2O2耐受性)和復(fù)篩(羥自由基清除能力、還原能力、超氧陰離子清除能力、DPPH自由基清除能力),獲得抗氧化功能較強(qiáng)的菌株應(yīng)用于辣椒的發(fā)酵,以期為多菌種工業(yè)化生產(chǎn)剁辣椒提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與設(shè)備

        1.1.1 材料與試劑

        黃貢椒:產(chǎn)地為湖南省衡陽市衡東縣三樟鎮(zhèn);七星椒:產(chǎn)地為湖南省常德市桃源縣牛車河鎮(zhèn);三味椒:產(chǎn)地為湖南省永州市新田縣陶嶺鄉(xiāng);大沖辣椒:產(chǎn)地為湖南省郴州市臨武縣水東鎮(zhèn);博辣紅牛:產(chǎn)地為湖南省武岡市鄧家鋪鎮(zhèn);博辣艷麗、小米椒、湘研28號、長辣7號、二荊條、朝天椒:產(chǎn)地為湖南省長沙市長沙縣黃花鎮(zhèn)。

        植物乳桿菌及嗜酸乳桿菌:北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院;MRS固體培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基:青島海博生物科技有限公司;氫氧化鈉:南京化學(xué)試劑股份有限公司;碳酸鈣:天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇:鄭州派尼化學(xué)試劑廠;鄰菲啰啉:上海市源葉生物有限公司;磷酸緩沖鹽溶液(PBS):上??茀R生物技術(shù)有限公司;鐵氰化鉀、三氯乙酸、Tris-HCl、二乙三胺五乙酸、鄰苯三酚,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        1.1.2 儀器與設(shè)備

        SW-CJ-1C型超凈工作臺:北京永康樂業(yè)科技發(fā)展有限公司;UV-1800型紫外可見分光光度計:深圳市珺煌科技有限公司;MC-D500U(E)/PH-HK顯微鏡:鳳凰光學(xué)股份有限公司;LDZM-80L-III型滅菌鍋:安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司;Avanti J-26XP冷凍離心機(jī):美國Beckman公司;TARE-ZERO電子天平:梅特勒-托利多儀器有限公司;PHS-3C型pH計:上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;BSA124S分析天平:賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;WP-UPWF-20超純水制備機(jī):北京沃特爾水處理設(shè)備有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 自然發(fā)酵剁辣椒中菌株的分離純化

        以大沖辣椒、博辣紅牛、博辣艷麗等10種不同產(chǎn)地的辣椒為原料,經(jīng)清洗晾干后剁碎,添加8%食鹽,混勻后分別裝壇發(fā)酵1個月。經(jīng)自然發(fā)酵,分別稱重10 g,并放入裝有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中,依次梯度稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6,然后,每梯度取1 mL均勻涂布在有碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基,置于37℃培養(yǎng)箱中2~3 d。挑取有鈣溶圈的單個菌落,進(jìn)行平板劃線分離純化2~3次。對可能的乳酸菌菌株進(jìn)行革蘭氏染色,再用顯微鏡觀察,過氧化氫接觸酶試驗,對革蘭氏陽性、無芽孢和接觸酶陰性的菌株斜面和甘油管進(jìn)行冷凍保存(菌液和50%甘油按1∶1比例保存)[15]。

        1.2.2 高效產(chǎn)酸乳酸菌初篩與復(fù)篩

        單個菌落純化后,接種在5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),24 h后用紫外可見分光光度計在600 nm處測得OD值,測得每個待測菌株發(fā)酵液中的pH,綜合選取OD值相對較高且pH相對較低的菌株,接種在MRS固體培養(yǎng)基上,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2~3 d,再挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,吸出1 mL發(fā)酵液加50 mL無菌蒸餾水稀釋,采用0.1 mol/L的NaOH溶液測總酸含量,每組滴定做3次平行,選取產(chǎn)酸量高的菌株。

        1.2.3 抗氧化乳酸菌初篩

        1.2.3.1 具有抗過氧化氫能力乳酸菌的初篩

        將獲得的高效產(chǎn)酸乳酸菌進(jìn)行純化,挑取單菌落接種至H2O2濃度為15 mmol/L的MRS培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)2 h,吸取100μL在平板中進(jìn)行涂布,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,觀察并讀取活菌落數(shù)[16-17]。

        1.2.3.2 完整細(xì)胞及無細(xì)胞提取物的制備

        將具有H2O2耐受性的乳酸菌菌株進(jìn)行純化,挑取單菌落接種至MRS培養(yǎng)液中,放入37℃恒溫培養(yǎng)箱,24 h后離心5 min,把菌體底層沉淀收集起來用無菌水沖洗3次,將菌體細(xì)胞重懸,濃度調(diào)為109CFU/mL。取其中部分菌懸液用于完整細(xì)胞(Intact cells,IC),剩下的用超聲機(jī)冰浴破碎其完整菌體,離心10 min,收集上清液作為無細(xì)胞提取物(Cell free extracts,CFE)。

        1.2.4 抗氧化乳酸菌復(fù)篩

        1.2.4.1 總抗氧化能力(FRAP法)

        吸取1%鐵氰化鉀和0.2 mol/L磷酸緩沖液各0.5 mL,加入到體積為0.5 mL的待測樣品中混勻,在50℃的水浴中反應(yīng)20 min,立即冷卻。再加0.5 mL的10%三氯乙酸,離心10 min,取上清液1 mL,分別加入1 mL蒸餾水和0.1%FeCl3溶液,混和均勻,靜置10 min。測定700 nm處的吸光度,比較吸光度值大小,值越大表明還原能力越強(qiáng)。

        1.2.4.2 DPPH自由基清除能力

        吸取1 mL樣品、2 mL 0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液于10 mL離心管中混勻,靜置30 min,以10 000 r/min速度離心1 min,測出上清液在517 nm波長處的吸光度Ai。用等體積無水乙醇代替DPPH溶液測定吸光度Aj,用等體積蒸餾水代替樣品溶液測定吸光度A0[18]。DPPH自由基清除率計算公式為:

        1.2.4.3 超氧陰離子自由基(O2·)清除能力

        取3 mL濃度為50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.2)、1 mL二乙三胺五乙酸、1 mL鄰苯三酚、0.5 mL待測樣品,依次加入離心管,混合均勻后放入25℃的培養(yǎng)箱反應(yīng)10 min,測得325 nm波長處的吸光度[19]。不含待測物和鄰苯三酚的吸光度記為A0;A1為不含待測物、含鄰苯三酚的吸光度;A2為含待測物、不含鄰苯三酚的吸光度;A3為含待測物和鄰苯三酚的吸光度。O2·清除率計算公式為:

        1.2.4.4 羥自由基清除能力

        取0.75 mmol/L的鄰菲啰啉1 mL放入試管中,依次加入2 mL pH為7.4的PBS和1 mL蒸餾水,拌勻,加入1 mL濃度2.5 mmol/L的FeSO4溶液,混合均勻,加l mL 0.12%H2O2,37℃水浴1.5 h,檢測其在536 nm波長處的吸光度Ap;吸光度Ab為用1 mL蒸餾水代替H2O2檢測的吸光度;吸光度As為用1 mL樣品代替1 mL的蒸餾水檢測的吸光度[20]?!H清除率計算公式為:

        1.2.5 菌株的鑒定

        將斜面保存的乳酸菌在平板上涂布,37℃培養(yǎng)2~3 d,觀察菌落形態(tài),把制成的菌懸液放在10×100倍顯微鏡下,觀察菌株形態(tài)。

        對篩選的乳酸菌提取總DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物27F:5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’,1492R:5’GGTTACCTTGTTACGACTT-3’,PCR反 應(yīng) 體 系:Mix 25μL,模板DNA 1μL,1492R 2μL,27F 2μL,ddH2O 20μL;PCR擴(kuò)增條件:94℃2 min;55℃50 s、94℃45 s、72℃2 min,經(jīng)30個循環(huán);72℃10 min;4℃條件下延伸60 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,純化后送至生工生物工程(上海)公司測序。在NCBI的BLAST程序中比較測序結(jié)果,并用MEGA 4.0軟件構(gòu)建同源序列系統(tǒng)發(fā)育樹。

        1.2.6 乳酸菌發(fā)酵辣椒制作工藝

        1.2.6.1 菌種復(fù)合比例

        根據(jù)前期試驗研究結(jié)果,發(fā)酵乳桿菌BLHN3不僅具有良好的產(chǎn)香性能,而且抗氧化功能表現(xiàn)突出。將BLHN3結(jié)合具有保健功能的嗜酸乳桿菌和產(chǎn)酸性能較好的植物乳桿菌接種剁辣椒發(fā)酵,3種菌的比例為1∶1∶1。

        1.2.6.2 工藝流程

        1.2.7 單因素試驗設(shè)計

        1.2.7.1 接種量試驗

        按照低鹽發(fā)酵辣椒工藝制作,固定食鹽添加量6%,溫度28℃,發(fā)酵時間10 d,接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%,測定剁辣椒總酸含量,并對辣椒進(jìn)行感官評價。

        1.2.7.2 食鹽添加量試驗

        按照低鹽發(fā)酵辣椒工藝制作,固定接種量3%,溫度28℃,發(fā)酵時間10 d,食鹽添加量分別為2%、4%、6%、8%、10%,測定剁辣椒總酸含量,并對辣椒進(jìn)行感官評價。

        1.2.7.3 發(fā)酵溫度試驗

        按照低鹽發(fā)酵辣椒工藝制作,固定接種量3%,食鹽添加量6%,發(fā)酵時間10 d,發(fā)酵溫度分別為22、25、28、31、34℃,測定剁辣椒總酸含量,并對辣椒進(jìn)行感官評價。

        1.2.7.4 發(fā)酵時間試驗

        按照低鹽發(fā)酵辣椒工藝制作,固定食鹽添加量6%,溫度28℃,接種量3%,發(fā)酵時間分別為6、8、10、12、14 d,檢測剁辣椒總酸含量,并對辣椒進(jìn)行感官評價。

        1.2.8 發(fā)酵工藝正交試驗設(shè)計

        在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,以接種量、食鹽添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為考察變量,以總酸含量及感官評價為考察指標(biāo),進(jìn)行四因素三水平正交試驗,因素水平如表1所示。

        表1 正交試驗因素水平表Table 1 Levels and design factors of orthogonal experiment

        1.2.9 測定項目與方法

        1.2.9.1 總酸含量

        參照GB/T 12456—2008[21]中的方法測定。

        1.2.9.2 感官評價

        邀請10位有經(jīng)驗的人員組成評價小組,分別從形態(tài)、色澤、風(fēng)味和脆度4個主特征對剁辣椒進(jìn)行感官評價,評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

        1.2.10 數(shù)據(jù)處理

        通過SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù),結(jié)果用xˉ±s表示,顯著性差異比較通過單因素方差分析得出;采用Origin 8.5繪制圖表。所有試驗重復(fù)3次。使用MEGA 4.0軟件構(gòu)建同源序列系統(tǒng)發(fā)育樹。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 高效產(chǎn)酸乳酸菌的篩選

        產(chǎn)酸能力是評價乳酸菌的基本標(biāo)準(zhǔn)之一,菌株對酸有較好的耐受性才能在胃酸環(huán)境下維持較好的活性,提高在腸道中的存活能力。以自制的剁辣椒為原料,通過分離純化、鏡檢和接觸酶試驗,共得到54株乳酸菌。乳酸菌的耐低酸特性也是其抗氧化的重要前提[22],通過比較各菌株發(fā)酵液的OD600值和pH,初篩得到產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的BLHN3、CL7-3、DC2等11株菌,OD值均在1.0以上,pH均小于4.5,活性較好。由圖1可知,乳酸菌BLHN3、EJT2、PDJ1的發(fā)酵液總酸含量顯著高于其他菌株(P<0.05),其中菌株BLHN3和PDJ1的總酸含量較高,且差異不顯著,分別為1.34%和1.31%。可得出BLHN3、EJT2、PDJ1等11株具有較好的耐酸性,為下一步進(jìn)行抗氧化性乳酸菌篩選提供了基礎(chǔ)。

        2.2 抗氧化能力初篩

        為避免受到高濃度氧化劑的危害,采用低濃度1 mmol/L H2O2處理微生物細(xì)胞,這是因為氧化劑會刺激細(xì)胞體的防御系統(tǒng)從而產(chǎn)出各種酶,使他們能夠?qū)ρ趸瘎┯心褪苄訹23]。為提高具有抗氧化性能菌株的篩選效率,將篩出的高效產(chǎn)酸的11株乳酸菌進(jìn)行H2O2耐受性試驗,選取革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性及可在固體平板上生長的菌,試驗結(jié)果如表3所示,初步確定BLHN3、EJT2、PDJ1等對H2O2具有強(qiáng)耐受性。

        圖1 不同乳酸菌產(chǎn)酸能力的比較Fig.1 Comparison of acid production abilities of different lactic acid bacteria

        表3 耐受H2O2乳酸菌初篩結(jié)果Table 3 Primary screening results of lactic acid bacteria resistant to H2O2

        2.3 抗氧化能力復(fù)篩

        2.3.1 FRAP還原能力

        有研究證明,還原能力與抗氧化性之間存在著一些相關(guān)性,可作為評價具有潛在抗氧化性的指標(biāo)。由圖2可知,具有強(qiáng)耐受H2O2的5株乳酸菌均有還原能力。整體來看,5株菌的菌體細(xì)胞(IC)的還原能力均大于無細(xì)胞提取物(CFE),證實5株乳酸菌中具有還原能力的物質(zhì)主要存在于菌體內(nèi)。各菌株的IC組還原能力范圍35.56%~61.70%,CFE組還原能力范圍22.41%~43.79%,BLHN3的IC組和CFE組相比其他菌株還原能力最強(qiáng),IC組還原能力達(dá)到61.70%,CFE組的還原能力達(dá)到43.79%。其次PDJ1和EJT2菌株還原能力較高,XM2的還原能力最弱。有完整細(xì)胞的菌體自身存在氧化還原調(diào)節(jié)系統(tǒng),且這些還原能力較強(qiáng)的菌株也已表明具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化衰老的效果[24]。

        圖2 各菌株的還原能力比較Fig.2 Reducing ability comparison of each strain

        2.3.2 DPPH自由基清除能力

        DPPH紫外分光光度法基于清除劑存在時,DPPH自由基可接受一個電子或氫原子,形成可使溶液變色的原理,被用來評價抗氧化能力及篩選具有抗氧化活性的乳酸菌菌株,該法方便快捷、靈敏且重復(fù)性好。DPPH自由基清除率(包括IC和CFE的DPPH自由基清除率)大于30%可認(rèn)為是DPPH活性高的乳酸菌[25]。

        由圖3可見,5株乳酸菌均具有清除DPPH自由基的能力,但清除能力有所不同。BLHN3菌株在IC組和CFE組對DPPH自由基的清除率均最高,分別達(dá)到51.60%、31.41%。在IC組中,EJT2和PDJ1菌株對DPPH自由基的清除能力相差不大,XM2清除能力最小。在CFE組中,XY28-3菌株對DPPH自由基的清除率最低,僅為15.39%。表明每株乳酸菌IC組和CFE組的DPPH自由基清除率無對應(yīng)關(guān)系。

        圖3 各菌株對DPPH自由基的清除效果Fig.3 Scavenging effect of each strain on DPPH free radical

        2.3.3 超氧陰離子自由基清除能力

        由圖4可知,受試乳酸菌清除超氧陰離子自由基的活性物質(zhì)存在于細(xì)胞的不同部位。IC組和CFE組中,5株乳酸菌均對O2·有清除能力。IC組和CFE組中BLHN3菌株O2·清除能力均最高,清除率分別達(dá)到43.27%、31.15%,PDJ1、EJT2依次較高。O2·清除能力在不同菌株中有顯著差異(P<0.05)。劉珊春等[26]對18株乳酸菌的超氧陰離子清除率進(jìn)行測定,最高為28.78%。李丹丹等[27]對7株乳酸菌的超氧陰離子清除率進(jìn)行測定,最高為26.91%。相比之下,BLHN3菌株O2·清除率更高。

        圖4 各菌株對O2·的清除效果Fig.4 Scavenging effect of each strain on O2·

        2.3.4 羥自由基清除能力

        ·OH氧化性很強(qiáng),具有損傷生物膜、降解DNA作用,是造成脂質(zhì)過氧化及人細(xì)胞損傷中最主要的自由基。由于乳酸菌會在自由基與機(jī)體內(nèi)分子發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng),用具有反應(yīng)活性的羥基自由基作用于活細(xì)胞中的損壞細(xì)胞避免提前終止自由基的生成。由圖5可以看出,5株乳酸菌對·OH都有清除能力。這與劉少敏[28]的結(jié)論一致。XY28-3菌株的CFE組對·OH清除能力最小,清除率僅為10.26%。IC組中BLHN3菌株對·OH的清除能力最大,清除率達(dá)到35.69%,EJT2和PDJ1次之。CFE組中BLHN3和PDJ1菌株對·OH清除能力較強(qiáng)。

        乳酸菌在IC和CFE組之間清除羥基自由基的能力不同。Ren等[29]測定了9株乳酸菌的無細(xì)胞懸液中的羥自由基清除率的范圍為10.37%~94.26%,其中CGMCC 1.557菌株的OH-IC值最高,為94.26%,其次,CICC 23174菌株的值為73.19%。王帥等[16]通過對IC和CFE中4株高DPPH自由基清除活性乳酸菌(DPPH自由基清除率(IC和CFE)均高于30%)的羥自由基清除能力的測定,得出Kc13在所有測定的菌株中·OH清除率最高,其中CFE組是80.01%和IC組是89.97%。正是由于抗氧化物質(zhì)在乳酸菌中的種類差異或同種抗氧化物質(zhì)含量高低,導(dǎo)致不同乳酸菌的羥自由基清除能力差異顯著。

        圖5 各菌株對羥自由基的清除率Fig.5 Scavenging rate of each strain on hydroxyl radical

        綜上所述,經(jīng)對DPPH自由基清除能力、還原能力、羥基自由基清除能力及超氧陰離子清除能力評估,BLHN3菌株的抗氧化能力最強(qiáng)。

        2.4 BLHN3菌株的鑒定

        由圖6可以看出,BLHN3菌株的菌落為白色圓形,表面平整,易挑起,φ為1~2 mm;細(xì)胞形態(tài)為桿狀,與乳桿菌的形態(tài)特征相吻合。

        圖6 BLHN3菌株的形態(tài)及顯微鏡觀察(10×100)Fig.6 Colony morphology and microscopic observation of BLHN3(10×100)

        經(jīng)分析DNA基因組的PCR產(chǎn)物,電泳圖如圖7所示,菌株的擴(kuò)增序列長度均為1 448 bp。

        在NCBI中,將獲得的堿基序列進(jìn)行BLAST比對,使用MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹用于同源性分析,結(jié)果如圖8所示,BLHN3菌株與發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)的相似度最高,同源性為100.00%。16S rRNA基因序列比對中,屬于同一個屬的最小同源性為95%,屬于同一物種的最小同源性為97%,可以判定菌株為L.fermentum。

        圖7 PCR產(chǎn)物檢測電泳圖Fig.7 Electrophoresis of PCR amplified 16SrDNA sequence

        圖8 菌株BLHN3的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 16S rDNA phylogenetic tree of BLHN3 strain

        2.5 發(fā)酵工藝單因素試驗結(jié)果

        2.5.1 接種量對剁辣椒的影響

        接種量的不同對剁辣椒產(chǎn)酸具有一定的影響,接種量少會延長發(fā)酵時間,接種量過多菌株間會產(chǎn)生競爭性抑制。由圖9可見,隨著接種量的不斷增加,剁辣椒的感官評分先升高后降低,當(dāng)接種量為2%時,剁辣椒的感官評價最高,椒塊棱角較分明,粗細(xì)較均勻,無霉斑或白花,色澤紅亮,香氣較好,酸感和咸味均適中,有脆度,口感較好,為最佳接種量。接種量越大,剁辣椒發(fā)酵越快,乳酸菌產(chǎn)酸能力越強(qiáng)。接種量在3%~5%時,總酸趨于平緩,說明乳酸菌之間發(fā)生競爭性抑制,影響總酸的生成。

        2.5.2 食鹽添加量對剁辣椒的影響

        圖9 接種量對剁辣椒總酸與感官評分的影響Fig.9 Effects of inoculation amounts on total acid contents and sensory scores of chopped pepper

        食鹽添加量過少,難以抑制腐敗菌的生長,食鹽添加過多,乳酸菌生長減慢,發(fā)酵時間增長。由圖10可知,剁辣椒的感官評分隨食鹽添加量的逐漸增加,先升高后緩慢降低,食鹽添加量為6%時,達(dá)到最高。剁辣椒的總酸隨食鹽量增加呈下降趨勢。綜合感官評分及產(chǎn)酸量、成本等因素,確定6%為適宜的食鹽添加量。

        圖10 食鹽添加量對剁辣椒總酸與感官評分的影響Fig.10 Effects of salt additions on the total acid contents and sensory scores of chopped pepper

        2.5.3 發(fā)酵溫度對剁辣椒的影響

        剁辣椒的風(fēng)味會受到發(fā)酵溫度的影響。菌種活化后,總酸、感官評分與不同發(fā)酵溫度的關(guān)系如圖11所示,剁辣椒的總酸含量隨發(fā)酵溫度的不斷升高逐漸增加。在22~34℃時,剁辣椒的感官評分隨溫度的升高先增加后降低,發(fā)酵溫度為28℃時,感官評分達(dá)到最高,且椒塊棱角色澤紅亮,無腐敗現(xiàn)象,香氣較好,酸感和咸味均適中,有脆度,口感較好,即確定為適宜發(fā)酵溫度。

        圖11 溫度對剁辣椒總酸與感官評分的影響Fig.11 Effects of temperatures on the total acid contents and sensory scores of chopped pepper

        2.5.4 發(fā)酵時間對剁辣椒的影響

        發(fā)酵時間過短,產(chǎn)酸較少,影響揮發(fā)性物質(zhì)的形成,當(dāng)發(fā)酵時間過長時,也會增加成本。由圖12可知,發(fā)酵時間為10 d時,感官評分達(dá)到最高。發(fā)酵時間太短或太長,剁辣椒產(chǎn)酸量不同,發(fā)酵時間6~10 d,總酸含量為8.53~9.99 g/kg,發(fā)酵時間10~14 d,總酸趨于平緩。結(jié)合成本考慮,選擇10 d為最佳發(fā)酵時間。

        圖12 發(fā)酵時間對剁辣椒總酸與感官評分的影響Fig.12 Effects of fermentation times on the total acid contents and sensory scores of chopped pepper

        2.6 發(fā)酵工藝正交試驗結(jié)果

        由表4可以看出,以感官評分為指標(biāo),影響辣椒發(fā)酵各因素的主次順序依次為:接種量>發(fā)酵時間>食鹽添加量>發(fā)酵溫度,最佳組合為A2B2C3D1;以總酸含量為評價指標(biāo),影響辣椒發(fā)酵各因素的主次順序依次為:發(fā)酵溫度>接種量>發(fā)酵時間>鹽添加量,最優(yōu)組合為A3B1C3D2。綜合成本及感官評價考慮,A2B2C3D1為最佳組合,該組合在正交試驗中感官評分最高,產(chǎn)酸較適宜。具體發(fā)酵工藝為發(fā)酵時間10 d,接種量2%,發(fā)酵溫度26℃,食鹽添加量7%,剁辣椒總酸含量為9.32 g/kg,感官評分82.89分。

        3 結(jié)論

        通過對自制剁辣椒中乳酸菌篩選,獲得產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的11株菌進(jìn)行抗氧化試驗,經(jīng)過H2O2耐受性初篩,BLHN3、EJT2、PDJ1、XM2、XY28-3等對H2O2具有較強(qiáng)耐受性。5株菌的抗氧化能力評價中BLHN3菌株的綜合抗氧化能力最強(qiáng),經(jīng)鑒定為發(fā)酵乳桿菌。以篩選出的發(fā)酵乳桿菌結(jié)合嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌開展多菌種復(fù)合發(fā)酵剁辣椒,在單因素試驗的基礎(chǔ)上,通過正交試驗確定最佳工藝為:發(fā)酵時間10 d,接種量2%,發(fā)酵溫度26℃,食鹽添加量7%,該工藝制備的剁辣椒色澤紅亮,無霉斑或白花,香氣較好,酸感和咸味均適中,脆度、口感較好,總酸含量為9.32 g/kg,感官評分82.89分。本研究結(jié)果可為抗氧化功能乳酸菌的篩選及工業(yè)化多菌種發(fā)酵辣椒提供參考,在以后的研究工作中將會結(jié)合細(xì)胞模型和體內(nèi)試驗對BLHN3菌株及其發(fā)酵產(chǎn)品的抗氧化機(jī)制做更深入的研究,以期為BLHN3發(fā)酵乳桿菌的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

        表4 發(fā)酵工藝正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of fermentation process

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