史 婷，劉 偉，許 彎，胡德宜，張菊華，*

（1.湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙 410125；3.湖南省火辣辣食品有限公司，湖南 寧鄉(xiāng) 410600）

辣椒富含多酚、VB1、VB2、類黃酮、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，能有效預(yù)防高血壓、糖尿病等疾病[1]。近年來的研究表明，辣椒中的辣椒紅素具有預(yù)防老化、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[2]、緩解疼痛[3]的功效。剁辣椒是湖南省的一種特色腌菜及傳統(tǒng)調(diào)味品，辣椒剁碎后經(jīng)過自然發(fā)酵加工制成的剁辣椒，口感鮮辣脆爽，易消化又能使食欲增強(qiáng)，深受大家喜愛。剁辣椒目前大多采用自然發(fā)酵，發(fā)酵時間久、易受污染、發(fā)酵結(jié)果不可控，嚴(yán)重影響了剁辣椒生產(chǎn)的規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化。

果蔬發(fā)酵制品中乳酸菌的篩選及功能活性評價已成為國內(nèi)外的研究熱點。目前已開展了泡菜、刺山柑、辣椒等發(fā)酵蔬菜高蛋白酶活性、降膽固醇等功能乳酸菌的篩選，且對其自由基清除能力、耐酸耐膽鹽等方面進(jìn)行抗氧化體系評價[4-5]。Wang等[6]采用高通量測序分析了剁辣椒發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的動態(tài)和多樣性，得出乳酸菌是起主要作用的微生物。乳酸菌不僅可抑制腐敗菌的生長，產(chǎn)生獨特的風(fēng)味物質(zhì)，還能調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群平衡[7-8]、抗衰老[9]、防治抑郁癥[10]等。乳酸菌作為新型抗氧化劑在食品加工中的應(yīng)用已備受關(guān)注。國內(nèi)抗氧化乳酸菌的篩選已有一些研究，如夏海燕等[11]從酢辣椒篩選出的短乳桿菌L3-5和發(fā)酵乳桿菌17-1具有較強(qiáng)的抗氧化能力；黃煜等[12]從皖北地區(qū)腌制菜中篩選出的菌株7-1的抗氧化能力比較強(qiáng)；肖宇等[13]從藏靈菇中篩選出優(yōu)勢菌-開菲爾乳桿菌具有較強(qiáng)的抗氧化活性。目前所篩選的菌株存在發(fā)酵環(huán)境適應(yīng)性差、單菌種發(fā)酵加工產(chǎn)品風(fēng)味不足、品質(zhì)參差不齊等問題。多菌種發(fā)酵具有發(fā)酵快、風(fēng)味濃郁等特點[14]，本研究擬通過乳酸菌的抗氧化能力初篩（H2O2耐受性）和復(fù)篩（羥自由基清除能力、還原能力、超氧陰離子清除能力、DPPH自由基清除能力），獲得抗氧化功能較強(qiáng)的菌株應(yīng)用于辣椒的發(fā)酵，以期為多菌種工業(yè)化生產(chǎn)剁辣椒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

黃貢椒：產(chǎn)地為湖南省衡陽市衡東縣三樟鎮(zhèn)；七星椒：產(chǎn)地為湖南省常德市桃源縣牛車河鎮(zhèn)；三味椒：產(chǎn)地為湖南省永州市新田縣陶嶺鄉(xiāng)；大沖辣椒：產(chǎn)地為湖南省郴州市臨武縣水東鎮(zhèn)；博辣紅牛：產(chǎn)地為湖南省武岡市鄧家鋪鎮(zhèn)；博辣艷麗、小米椒、湘研28號、長辣7號、二荊條、朝天椒：產(chǎn)地為湖南省長沙市長沙縣黃花鎮(zhèn)。

植物乳桿菌及嗜酸乳桿菌：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；MRS固體培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基：青島海博生物科技有限公司；氫氧化鈉：南京化學(xué)試劑股份有限公司；碳酸鈣：天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇：鄭州派尼化學(xué)試劑廠；鄰菲啰啉：上海市源葉生物有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）：上?？茀R生物技術(shù)有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、Tris-HCl、二乙三胺五乙酸、鄰苯三酚，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1C型超凈工作臺：北京永康樂業(yè)科技發(fā)展有限公司；UV-1800型紫外可見分光光度計：深圳市珺煌科技有限公司；MC-D500U（E）/PH-HK顯微鏡：鳳凰光學(xué)股份有限公司；LDZM-80L-III型滅菌鍋：安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司；Avanti J-26XP冷凍離心機(jī)：美國Beckman公司；TARE-ZERO電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；PHS-3C型pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；BSA124S分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；WP-UPWF-20超純水制備機(jī)：北京沃特爾水處理設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 自然發(fā)酵剁辣椒中菌株的分離純化

以大沖辣椒、博辣紅牛、博辣艷麗等10種不同產(chǎn)地的辣椒為原料，經(jīng)清洗晾干后剁碎，添加8%食鹽，混勻后分別裝壇發(fā)酵1個月。經(jīng)自然發(fā)酵，分別稱重10 g，并放入裝有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，依次梯度稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6，然后，每梯度取1 mL均勻涂布在有碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中2～3 d。挑取有鈣溶圈的單個菌落，進(jìn)行平板劃線分離純化2～3次。對可能的乳酸菌菌株進(jìn)行革蘭氏染色，再用顯微鏡觀察，過氧化氫接觸酶試驗，對革蘭氏陽性、無芽孢和接觸酶陰性的菌株斜面和甘油管進(jìn)行冷凍保存（菌液和50%甘油按1∶1比例保存）[15]。

1.2.2 高效產(chǎn)酸乳酸菌初篩與復(fù)篩

單個菌落純化后，接種在5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后用紫外可見分光光度計在600 nm處測得OD值，測得每個待測菌株發(fā)酵液中的pH，綜合選取OD值相對較高且pH相對較低的菌株，接種在MRS固體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d，再挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，吸出1 mL發(fā)酵液加50 mL無菌蒸餾水稀釋，采用0.1 mol/L的NaOH溶液測總酸含量，每組滴定做3次平行，選取產(chǎn)酸量高的菌株。

1.2.3 抗氧化乳酸菌初篩

1.2.3.1 具有抗過氧化氫能力乳酸菌的初篩

將獲得的高效產(chǎn)酸乳酸菌進(jìn)行純化，挑取單菌落接種至H2O2濃度為15 mmol/L的MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)2 h，吸取100μL在平板中進(jìn)行涂布，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察并讀取活菌落數(shù)[16-17]。

1.2.3.2 完整細(xì)胞及無細(xì)胞提取物的制備

將具有H2O2耐受性的乳酸菌菌株進(jìn)行純化，挑取單菌落接種至MRS培養(yǎng)液中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱，24 h后離心5 min，把菌體底層沉淀收集起來用無菌水沖洗3次，將菌體細(xì)胞重懸，濃度調(diào)為109CFU/mL。取其中部分菌懸液用于完整細(xì)胞（Intact cells，IC），剩下的用超聲機(jī)冰浴破碎其完整菌體，離心10 min，收集上清液作為無細(xì)胞提取物（Cell free extracts，CFE）。

1.2.4 抗氧化乳酸菌復(fù)篩

1.2.4.1 總抗氧化能力（FRAP法）

吸取1%鐵氰化鉀和0.2 mol/L磷酸緩沖液各0.5 mL，加入到體積為0.5 mL的待測樣品中混勻，在50℃的水浴中反應(yīng)20 min，立即冷卻。再加0.5 mL的10%三氯乙酸，離心10 min，取上清液1 mL，分別加入1 mL蒸餾水和0.1%FeCl3溶液，混和均勻，靜置10 min。測定700 nm處的吸光度，比較吸光度值大小，值越大表明還原能力越強(qiáng)。

1.2.4.2 DPPH自由基清除能力

吸取1 mL樣品、2 mL 0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液于10 mL離心管中混勻，靜置30 min，以10 000 r/min速度離心1 min，測出上清液在517 nm波長處的吸光度Ai。用等體積無水乙醇代替DPPH溶液測定吸光度Aj，用等體積蒸餾水代替樣品溶液測定吸光度A0[18]。DPPH自由基清除率計算公式為：

1.2.4.3 超氧陰離子自由基（O2·）清除能力

取3 mL濃度為50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.2）、1 mL二乙三胺五乙酸、1 mL鄰苯三酚、0.5 mL待測樣品，依次加入離心管，混合均勻后放入25℃的培養(yǎng)箱反應(yīng)10 min，測得325 nm波長處的吸光度[19]。不含待測物和鄰苯三酚的吸光度記為A0；A1為不含待測物、含鄰苯三酚的吸光度；A2為含待測物、不含鄰苯三酚的吸光度；A3為含待測物和鄰苯三酚的吸光度。O2·清除率計算公式為：

1.2.4.4 羥自由基清除能力

取0.75 mmol/L的鄰菲啰啉1 mL放入試管中，依次加入2 mL pH為7.4的PBS和1 mL蒸餾水，拌勻，加入1 mL濃度2.5 mmol/L的FeSO4溶液，混合均勻，加l mL 0.12%H2O2，37℃水浴1.5 h，檢測其在536 nm波長處的吸光度Ap；吸光度Ab為用1 mL蒸餾水代替H2O2檢測的吸光度；吸光度As為用1 mL樣品代替1 mL的蒸餾水檢測的吸光度[20]?！H清除率計算公式為：

1.2.5 菌株的鑒定

將斜面保存的乳酸菌在平板上涂布，37℃培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落形態(tài)，把制成的菌懸液放在10×100倍顯微鏡下，觀察菌株形態(tài)。

對篩選的乳酸菌提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，1492R：5’GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR反 應(yīng) 體 系：Mix 25μL，模板DNA 1μL，1492R 2μL，27F 2μL，ddH2O 20μL；PCR擴(kuò)增條件：94℃2 min；55℃50 s、94℃45 s、72℃2 min，經(jīng)30個循環(huán)；72℃10 min；4℃條件下延伸60 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后送至生工生物工程（上海）公司測序。在NCBI的BLAST程序中比較測序結(jié)果，并用MEGA 4.0軟件構(gòu)建同源序列系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 乳酸菌發(fā)酵辣椒制作工藝

1.2.6.1 菌種復(fù)合比例

根據(jù)前期試驗研究結(jié)果，發(fā)酵乳桿菌BLHN3不僅具有良好的產(chǎn)香性能，而且抗氧化功能表現(xiàn)突出。將BLHN3結(jié)合具有保健功能的嗜酸乳桿菌和產(chǎn)酸性能較好的植物乳桿菌接種剁辣椒發(fā)酵，3種菌的比例為1∶1∶1。

1.2.6.2 工藝流程

1.2.7 單因素試驗設(shè)計

1.2.7.1 接種量試驗

按照低鹽發(fā)酵辣椒工藝制作，固定食鹽添加量6%，溫度28℃，發(fā)酵時間10 d，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%，測定剁辣椒總酸含量，并對辣椒進(jìn)行感官評價。

1.2.7.2 食鹽添加量試驗

按照低鹽發(fā)酵辣椒工藝制作，固定接種量3%，溫度28℃，發(fā)酵時間10 d，食鹽添加量分別為2%、4%、6%、8%、10%，測定剁辣椒總酸含量，并對辣椒進(jìn)行感官評價。

1.2.7.3 發(fā)酵溫度試驗

按照低鹽發(fā)酵辣椒工藝制作，固定接種量3%，食鹽添加量6%，發(fā)酵時間10 d，發(fā)酵溫度分別為22、25、28、31、34℃，測定剁辣椒總酸含量，并對辣椒進(jìn)行感官評價。

1.2.7.4 發(fā)酵時間試驗

按照低鹽發(fā)酵辣椒工藝制作，固定食鹽添加量6%，溫度28℃，接種量3%，發(fā)酵時間分別為6、8、10、12、14 d，檢測剁辣椒總酸含量，并對辣椒進(jìn)行感官評價。

1.2.8 發(fā)酵工藝正交試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以接種量、食鹽添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為考察變量，以總酸含量及感官評價為考察指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平正交試驗，因素水平如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Levels and design factors of orthogonal experiment

1.2.9 測定項目與方法

1.2.9.1 總酸含量

參照GB/T 12456—2008[21]中的方法測定。

1.2.9.2 感官評價

邀請10位有經(jīng)驗的人員組成評價小組，分別從形態(tài)、色澤、風(fēng)味和脆度4個主特征對剁辣椒進(jìn)行感官評價，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理

通過SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果用xˉ±s表示，顯著性差異比較通過單因素方差分析得出；采用Origin 8.5繪制圖表。所有試驗重復(fù)3次。使用MEGA 4.0軟件構(gòu)建同源序列系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效產(chǎn)酸乳酸菌的篩選

產(chǎn)酸能力是評價乳酸菌的基本標(biāo)準(zhǔn)之一，菌株對酸有較好的耐受性才能在胃酸環(huán)境下維持較好的活性，提高在腸道中的存活能力。以自制的剁辣椒為原料，通過分離純化、鏡檢和接觸酶試驗，共得到54株乳酸菌。乳酸菌的耐低酸特性也是其抗氧化的重要前提[22]，通過比較各菌株發(fā)酵液的OD600值和pH，初篩得到產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的BLHN3、CL7-3、DC2等11株菌，OD值均在1.0以上，pH均小于4.5，活性較好。由圖1可知，乳酸菌BLHN3、EJT2、PDJ1的發(fā)酵液總酸含量顯著高于其他菌株（P＜0.05），其中菌株BLHN3和PDJ1的總酸含量較高，且差異不顯著，分別為1.34%和1.31%。可得出BLHN3、EJT2、PDJ1等11株具有較好的耐酸性，為下一步進(jìn)行抗氧化性乳酸菌篩選提供了基礎(chǔ)。

2.2 抗氧化能力初篩

為避免受到高濃度氧化劑的危害，采用低濃度1 mmol/L H2O2處理微生物細(xì)胞，這是因為氧化劑會刺激細(xì)胞體的防御系統(tǒng)從而產(chǎn)出各種酶，使他們能夠?qū)ρ趸瘎┯心褪苄訹23]。為提高具有抗氧化性能菌株的篩選效率，將篩出的高效產(chǎn)酸的11株乳酸菌進(jìn)行H2O2耐受性試驗，選取革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性及可在固體平板上生長的菌，試驗結(jié)果如表3所示，初步確定BLHN3、EJT2、PDJ1等對H2O2具有強(qiáng)耐受性。

圖1 不同乳酸菌產(chǎn)酸能力的比較Fig.1 Comparison of acid production abilities of different lactic acid bacteria

表3 耐受H2O2乳酸菌初篩結(jié)果Table 3 Primary screening results of lactic acid bacteria resistant to H2O2

2.3 抗氧化能力復(fù)篩

2.3.1 FRAP還原能力

有研究證明，還原能力與抗氧化性之間存在著一些相關(guān)性，可作為評價具有潛在抗氧化性的指標(biāo)。由圖2可知，具有強(qiáng)耐受H2O2的5株乳酸菌均有還原能力。整體來看，5株菌的菌體細(xì)胞（IC）的還原能力均大于無細(xì)胞提取物（CFE），證實5株乳酸菌中具有還原能力的物質(zhì)主要存在于菌體內(nèi)。各菌株的IC組還原能力范圍35.56%～61.70%，CFE組還原能力范圍22.41%～43.79%，BLHN3的IC組和CFE組相比其他菌株還原能力最強(qiáng)，IC組還原能力達(dá)到61.70%，CFE組的還原能力達(dá)到43.79%。其次PDJ1和EJT2菌株還原能力較高，XM2的還原能力最弱。有完整細(xì)胞的菌體自身存在氧化還原調(diào)節(jié)系統(tǒng)，且這些還原能力較強(qiáng)的菌株也已表明具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化衰老的效果[24]。

圖2 各菌株的還原能力比較Fig.2 Reducing ability comparison of each strain

2.3.2 DPPH自由基清除能力

DPPH紫外分光光度法基于清除劑存在時，DPPH自由基可接受一個電子或氫原子，形成可使溶液變色的原理，被用來評價抗氧化能力及篩選具有抗氧化活性的乳酸菌菌株，該法方便快捷、靈敏且重復(fù)性好。DPPH自由基清除率（包括IC和CFE的DPPH自由基清除率）大于30%可認(rèn)為是DPPH活性高的乳酸菌[25]。

由圖3可見，5株乳酸菌均具有清除DPPH自由基的能力，但清除能力有所不同。BLHN3菌株在IC組和CFE組對DPPH自由基的清除率均最高，分別達(dá)到51.60%、31.41%。在IC組中，EJT2和PDJ1菌株對DPPH自由基的清除能力相差不大，XM2清除能力最小。在CFE組中，XY28-3菌株對DPPH自由基的清除率最低，僅為15.39%。表明每株乳酸菌IC組和CFE組的DPPH自由基清除率無對應(yīng)關(guān)系。

圖3 各菌株對DPPH自由基的清除效果Fig.3 Scavenging effect of each strain on DPPH free radical

2.3.3 超氧陰離子自由基清除能力

由圖4可知，受試乳酸菌清除超氧陰離子自由基的活性物質(zhì)存在于細(xì)胞的不同部位。IC組和CFE組中，5株乳酸菌均對O2·有清除能力。IC組和CFE組中BLHN3菌株O2·清除能力均最高，清除率分別達(dá)到43.27%、31.15%，PDJ1、EJT2依次較高。O2·清除能力在不同菌株中有顯著差異（P＜0.05）。劉珊春等[26]對18株乳酸菌的超氧陰離子清除率進(jìn)行測定，最高為28.78%。李丹丹等[27]對7株乳酸菌的超氧陰離子清除率進(jìn)行測定，最高為26.91%。相比之下，BLHN3菌株O2·清除率更高。

圖4 各菌株對O2·的清除效果Fig.4 Scavenging effect of each strain on O2·

2.3.4 羥自由基清除能力

·OH氧化性很強(qiáng)，具有損傷生物膜、降解DNA作用，是造成脂質(zhì)過氧化及人細(xì)胞損傷中最主要的自由基。由于乳酸菌會在自由基與機(jī)體內(nèi)分子發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，用具有反應(yīng)活性的羥基自由基作用于活細(xì)胞中的損壞細(xì)胞避免提前終止自由基的生成。由圖5可以看出，5株乳酸菌對·OH都有清除能力。這與劉少敏[28]的結(jié)論一致。XY28-3菌株的CFE組對·OH清除能力最小，清除率僅為10.26%。IC組中BLHN3菌株對·OH的清除能力最大，清除率達(dá)到35.69%，EJT2和PDJ1次之。CFE組中BLHN3和PDJ1菌株對·OH清除能力較強(qiáng)。

乳酸菌在IC和CFE組之間清除羥基自由基的能力不同。Ren等[29]測定了9株乳酸菌的無細(xì)胞懸液中的羥自由基清除率的范圍為10.37%～94.26%，其中CGMCC 1.557菌株的OH-IC值最高，為94.26%，其次，CICC 23174菌株的值為73.19%。王帥等[16]通過對IC和CFE中4株高DPPH自由基清除活性乳酸菌（DPPH自由基清除率（IC和CFE）均高于30%）的羥自由基清除能力的測定，得出Kc13在所有測定的菌株中·OH清除率最高，其中CFE組是80.01%和IC組是89.97%。正是由于抗氧化物質(zhì)在乳酸菌中的種類差異或同種抗氧化物質(zhì)含量高低，導(dǎo)致不同乳酸菌的羥自由基清除能力差異顯著。

圖5 各菌株對羥自由基的清除率Fig.5 Scavenging rate of each strain on hydroxyl radical

綜上所述，經(jīng)對DPPH自由基清除能力、還原能力、羥基自由基清除能力及超氧陰離子清除能力評估，BLHN3菌株的抗氧化能力最強(qiáng)。

2.4 BLHN3菌株的鑒定

由圖6可以看出，BLHN3菌株的菌落為白色圓形，表面平整，易挑起，φ為1～2 mm；細(xì)胞形態(tài)為桿狀，與乳桿菌的形態(tài)特征相吻合。

圖6 BLHN3菌株的形態(tài)及顯微鏡觀察（10×100）Fig.6 Colony morphology and microscopic observation of BLHN3(10×100)

經(jīng)分析DNA基因組的PCR產(chǎn)物，電泳圖如圖7所示，菌株的擴(kuò)增序列長度均為1 448 bp。

在NCBI中，將獲得的堿基序列進(jìn)行BLAST比對，使用MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹用于同源性分析，結(jié)果如圖8所示，BLHN3菌株與發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）的相似度最高，同源性為100.00%。16S rRNA基因序列比對中，屬于同一個屬的最小同源性為95%，屬于同一物種的最小同源性為97%，可以判定菌株為L.fermentum。

圖7 PCR產(chǎn)物檢測電泳圖Fig.7 Electrophoresis of PCR amplified 16SrDNA sequence

圖8 菌株BLHN3的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 16S rDNA phylogenetic tree of BLHN3 strain

2.5 發(fā)酵工藝單因素試驗結(jié)果

2.5.1 接種量對剁辣椒的影響

接種量的不同對剁辣椒產(chǎn)酸具有一定的影響，接種量少會延長發(fā)酵時間，接種量過多菌株間會產(chǎn)生競爭性抑制。由圖9可見，隨著接種量的不斷增加，剁辣椒的感官評分先升高后降低，當(dāng)接種量為2%時，剁辣椒的感官評價最高，椒塊棱角較分明，粗細(xì)較均勻，無霉斑或白花，色澤紅亮，香氣較好，酸感和咸味均適中，有脆度，口感較好，為最佳接種量。接種量越大，剁辣椒發(fā)酵越快，乳酸菌產(chǎn)酸能力越強(qiáng)。接種量在3%～5%時，總酸趨于平緩，說明乳酸菌之間發(fā)生競爭性抑制，影響總酸的生成。

2.5.2 食鹽添加量對剁辣椒的影響

圖9 接種量對剁辣椒總酸與感官評分的影響Fig.9 Effects of inoculation amounts on total acid contents and sensory scores of chopped pepper

食鹽添加量過少，難以抑制腐敗菌的生長，食鹽添加過多，乳酸菌生長減慢，發(fā)酵時間增長。由圖10可知，剁辣椒的感官評分隨食鹽添加量的逐漸增加，先升高后緩慢降低，食鹽添加量為6%時，達(dá)到最高。剁辣椒的總酸隨食鹽量增加呈下降趨勢。綜合感官評分及產(chǎn)酸量、成本等因素，確定6%為適宜的食鹽添加量。

圖10 食鹽添加量對剁辣椒總酸與感官評分的影響Fig.10 Effects of salt additions on the total acid contents and sensory scores of chopped pepper

2.5.3 發(fā)酵溫度對剁辣椒的影響

剁辣椒的風(fēng)味會受到發(fā)酵溫度的影響。菌種活化后，總酸、感官評分與不同發(fā)酵溫度的關(guān)系如圖11所示，剁辣椒的總酸含量隨發(fā)酵溫度的不斷升高逐漸增加。在22～34℃時，剁辣椒的感官評分隨溫度的升高先增加后降低，發(fā)酵溫度為28℃時，感官評分達(dá)到最高，且椒塊棱角色澤紅亮，無腐敗現(xiàn)象，香氣較好，酸感和咸味均適中，有脆度，口感較好，即確定為適宜發(fā)酵溫度。

圖11 溫度對剁辣椒總酸與感官評分的影響Fig.11 Effects of temperatures on the total acid contents and sensory scores of chopped pepper

2.5.4 發(fā)酵時間對剁辣椒的影響

發(fā)酵時間過短，產(chǎn)酸較少，影響揮發(fā)性物質(zhì)的形成，當(dāng)發(fā)酵時間過長時，也會增加成本。由圖12可知，發(fā)酵時間為10 d時，感官評分達(dá)到最高。發(fā)酵時間太短或太長，剁辣椒產(chǎn)酸量不同，發(fā)酵時間6～10 d，總酸含量為8.53～9.99 g/kg，發(fā)酵時間10～14 d，總酸趨于平緩。結(jié)合成本考慮，選擇10 d為最佳發(fā)酵時間。

圖12 發(fā)酵時間對剁辣椒總酸與感官評分的影響Fig.12 Effects of fermentation times on the total acid contents and sensory scores of chopped pepper

2.6 發(fā)酵工藝正交試驗結(jié)果

由表4可以看出，以感官評分為指標(biāo)，影響辣椒發(fā)酵各因素的主次順序依次為：接種量＞發(fā)酵時間＞食鹽添加量＞發(fā)酵溫度，最佳組合為A2B2C3D1；以總酸含量為評價指標(biāo)，影響辣椒發(fā)酵各因素的主次順序依次為：發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時間＞鹽添加量，最優(yōu)組合為A3B1C3D2。綜合成本及感官評價考慮，A2B2C3D1為最佳組合，該組合在正交試驗中感官評分最高，產(chǎn)酸較適宜。具體發(fā)酵工藝為發(fā)酵時間10 d，接種量2%，發(fā)酵溫度26℃，食鹽添加量7%，剁辣椒總酸含量為9.32 g/kg，感官評分82.89分。

3 結(jié)論

通過對自制剁辣椒中乳酸菌篩選，獲得產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的11株菌進(jìn)行抗氧化試驗，經(jīng)過H2O2耐受性初篩，BLHN3、EJT2、PDJ1、XM2、XY28-3等對H2O2具有較強(qiáng)耐受性。5株菌的抗氧化能力評價中BLHN3菌株的綜合抗氧化能力最強(qiáng)，經(jīng)鑒定為發(fā)酵乳桿菌。以篩選出的發(fā)酵乳桿菌結(jié)合嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌開展多菌種復(fù)合發(fā)酵剁辣椒，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗確定最佳工藝為：發(fā)酵時間10 d，接種量2%，發(fā)酵溫度26℃，食鹽添加量7%，該工藝制備的剁辣椒色澤紅亮，無霉斑或白花，香氣較好，酸感和咸味均適中，脆度、口感較好，總酸含量為9.32 g/kg，感官評分82.89分。本研究結(jié)果可為抗氧化功能乳酸菌的篩選及工業(yè)化多菌種發(fā)酵辣椒提供參考，在以后的研究工作中將會結(jié)合細(xì)胞模型和體內(nèi)試驗對BLHN3菌株及其發(fā)酵產(chǎn)品的抗氧化機(jī)制做更深入的研究，以期為BLHN3發(fā)酵乳桿菌的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

表4 發(fā)酵工藝正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of fermentation process