王桂瑤，常延斌，郭建華，郭 超，奚家勤，胡利偉，蔡憲杰，宋紀(jì)真*

1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001 2.廣東省糧食科學(xué)研究所，廣州市越秀區(qū)越秀北路222號(hào) 510050 3.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海市楊浦區(qū)長(zhǎng)陽(yáng)路717號(hào) 200082

煙草粉螟［Ephestia elutella（Hübner）］，屬鱗翅目（Lepidoptera）螟蛾科（Pyralidae），又名煙草粉斑螟、煙草螟蛾等，是一種世界性倉(cāng)貯害蟲(chóng)［1］。煙草粉螟廣泛分布于熱帶及溫帶地區(qū)，其幼蟲(chóng)可為害貯存期煙草、咖啡、可可和干果等，尤其喜食含糖多、含煙堿少的中高等級(jí)烤煙［1-4］，給煙草行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

隨著測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步和生物信息學(xué)的持續(xù)發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組、基因組、蛋白組和代謝組等組學(xué)研究手段被越來(lái)越多地應(yīng)用于昆蟲(chóng)學(xué)研究，為昆蟲(chóng)學(xué)研究提供了新的機(jī)遇［5-6］。昆蟲(chóng)基因組學(xué)研究是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，目前，已有1 219項(xiàng)昆蟲(chóng)基因組測(cè)序計(jì)劃在NCBI注冊(cè)，其中有401種昆蟲(chóng)完成了基因組拼接，為昆蟲(chóng)分子生物學(xué)研究提供了豐富的數(shù)據(jù)資源［5-7］。例如，晉家正等［8］對(duì)藥用美洲大蠊（Periplaneta americana）全基因組進(jìn)行測(cè)序分析，為美洲大蠊藥用基因資源挖掘奠定基礎(chǔ)。二化螟（Chilo suppressalis）基因組研究揭示了二化螟耐寒性的遺傳基礎(chǔ)［9］。張屾［10］鑒定了棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）基因組中與食性相關(guān)的基因家族，闡述了其多食性的分子機(jī)制，為棉鈴蟲(chóng)的綠色防控奠定基礎(chǔ)。然而，由于目前煙草粉螟基因組信息的匱乏，國(guó)內(nèi)外有關(guān)煙草粉螟的研究主要集中在生物學(xué)特性、生態(tài)學(xué)特性、抗藥性及生物防治等方面［11-21］，而關(guān)于煙草粉螟遺傳、進(jìn)化、生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖等分子水平的研究還較少。因此，對(duì)煙草粉螟基因組進(jìn)行研究有助于從系統(tǒng)生物學(xué)層面闡述其爆發(fā)成災(zāi)的分子機(jī)制，篩選鑒定其潛在的生物防治或化學(xué)防治靶基因，從而為開(kāi)發(fā)綠色、安全的新型害蟲(chóng)防治策略奠定理論基礎(chǔ)。

昆蟲(chóng)基因組具有高雜合和高重復(fù)的特點(diǎn)，研究特定物種基因組，首先要對(duì)其進(jìn)行初步研究，評(píng)估其基因組大小、雜合度和重復(fù)序列，為全基因組測(cè)序和組裝提供重要依據(jù)［22］。昆蟲(chóng)基因組大小評(píng)估常使用兩種方法，一是通過(guò)流式細(xì)胞儀分析得到染色體組型信息并推斷其基因組大小，另一種是通過(guò)基因組調(diào)查分析預(yù)測(cè)基因組大小、重復(fù)序列和雜合度等［7,22］。昆蟲(chóng)之間基因組大小差異顯著，目前動(dòng)物基因組大小數(shù)據(jù)庫(kù)（Animal genome size database）提供了超過(guò)1 300條昆蟲(chóng)基因組大小數(shù)值，其中最大的是直翅目的斑腿蝗（Podisma pedestris，約16.6 Gb），基因組最小的為海濱搖蚊（Clunio tsushimensis，約68.5 Mb）［22］。基因組大小是研究基因組進(jìn)化、結(jié)構(gòu)和功能的重要參數(shù)之一，而重復(fù)序列數(shù)量、基因間隔區(qū)長(zhǎng)度和平均內(nèi)含子大小是決定昆蟲(chóng)基因組大小的主要因素［6,22-23］。另外，昆蟲(chóng)基因組大小是不斷變化的，堿基的插入和缺失、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座和染色體變異等是個(gè)體水平基因組大小進(jìn)化的原動(dòng)力［22］。

本研究中基于低深度高通量測(cè)序?qū)煵莘勖蚪M進(jìn)行初步研究，采用K-mer法預(yù)測(cè)煙草粉螟基因組大小、雜合度和重復(fù)序列等信息，利用SOAPde novo軟件對(duì)煙草粉螟測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行初步組裝，旨在為后續(xù)測(cè)序提供合理方案，并為煙草粉螟基因組的深度測(cè)序和組裝提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

煙草粉螟采集于中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院煙草倉(cāng)貯實(shí)驗(yàn)室，并用人工飼料（小麥∶燕麥片∶全麥粉=7∶7∶1）飼養(yǎng)多代形成穩(wěn)定種群。飼養(yǎng)條件：30℃±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，全暗。挑選個(gè)頭較大的煙草粉螟蛹0.5 g，去除體表附著的雜質(zhì)，液氮速凍后，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取及檢測(cè)

利用DNA提取試劑盒（Insect gDNA Isolation Kit,美國(guó)Biomiga公司）提取煙草粉螟基因組DNA。首先利用瓊脂糖凝膠電泳定量對(duì)基因組DNA進(jìn)行初步檢測(cè)，待檢測(cè)合格后，再利用Qubit Fluorometer（Invitrogen Qubit 2.0,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行DNA濃度測(cè)定，利用瓊脂糖凝膠電泳（膠濃度1%，電壓180 V）進(jìn)行DNA的完整性、純度和片段大小檢測(cè)，確保DNA質(zhì)量達(dá)到建庫(kù)測(cè)序要求。

1.3 文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

煙草粉螟基因組調(diào)查由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。檢測(cè)合格的DNA樣品通過(guò)超聲波破碎隨機(jī)打斷成小片段（250 bp、500 bp），經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成整個(gè)文庫(kù)制備。構(gòu)建好的文庫(kù)，通過(guò)Illumina Hiseq 2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行PE150雙末端測(cè)序。測(cè)序得到的原始序列（Raw reads）必須進(jìn)行精細(xì)過(guò)濾，去除其中帶接頭的、低質(zhì)量的Reads，得到Clean reads。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

取全部Raw reads，統(tǒng)計(jì)測(cè)序Reads數(shù)量、數(shù)據(jù)產(chǎn)量、測(cè)序錯(cuò)誤率、Q20含量、Q30含量和GC含量等。高通量測(cè)序中，每測(cè)一個(gè)堿基會(huì)產(chǎn)生一個(gè)相應(yīng)的質(zhì)量值，其中，Q20和Q30表示質(zhì)量值大于等于20或30的堿基所占百分比，主要是用來(lái)衡量測(cè)序準(zhǔn)確度的。測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分布在Q30（≥80%）以上才能保證后續(xù)分析正常進(jìn)行。測(cè)序錯(cuò)誤率分布檢查用于檢測(cè)在測(cè)序長(zhǎng)度范圍內(nèi)，有無(wú)異常的堿基位置存在高錯(cuò)誤率。一般情況下，每個(gè)堿基位置的測(cè)序錯(cuò)誤率都應(yīng)低于1%。GC含量分布檢查用于檢測(cè)有無(wú)AT、GC分離現(xiàn)象。

1.5 K-mer分析

基于Clean reads，采用K-mer法對(duì)煙草粉螟基因組大小進(jìn)行估計(jì)［7,22］。當(dāng)K值為17時(shí)，統(tǒng)計(jì)Kmer頻數(shù)分布，作K-mer分布曲線，計(jì)算K-mer的深度分布，并確定深度分布的峰值［24-25］，使用SOAPde novo軟件得到K-mer總數(shù)。根據(jù)公式（基因組大小=K-mer總數(shù)/峰深度）估算煙草粉螟基因組大小。通過(guò)排除錯(cuò)誤K-mer帶來(lái)的誤差影響，修正基因組大小。通過(guò)計(jì)算序列中雜合位點(diǎn)的比例得到基因組雜合度。根據(jù)主峰后1.8倍的K-mer總數(shù)占所有K-mer數(shù)的百分比計(jì)算序列重復(fù)率。

1.6 基因組初步組裝

使用SOAPde novo軟件對(duì)不同片段大小的序列進(jìn)行拼接［26］，基本過(guò)程如下：首先利用Reads之間的重疊關(guān)系，并在重復(fù)邊界位置進(jìn)行剪切，得到Contigs序列，其次根據(jù)大片段數(shù)據(jù)的Pair-end關(guān)系，構(gòu)建Scaffolds序列，最后用Reads對(duì)Scaffolds的空隙區(qū)域進(jìn)行填補(bǔ)。

1.7 鱗翅目昆蟲(chóng)基因組大小比較

將本研究中獲得的煙草粉螟基因組信息（基因組大小、GC含量和Contig N50）與NCBI上已公布的其他鱗翅目昆蟲(chóng)基因組（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome）進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA檢測(cè)

Qubit檢測(cè)DNA濃度為198 ng/μL，A260/280=1.81，A260/230=1.69，提取的DNA質(zhì)量較好。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示（圖1），樣本DNA主帶在48 000 bp以上，輕微斷裂，輕微降解，滿足建庫(kù)測(cè)序質(zhì)量要求。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Test results of agarose gel electrophoresis

2.2 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

本研究中共獲得小片段文庫(kù)測(cè)序15 Gb的原始數(shù)據(jù)量，覆蓋深度大約26.9×，獲得煙草粉螟Reads數(shù)量為52 552 733條。測(cè)序錯(cuò)誤率為0.04%，Q20=97.48%，Q30=92.73%，說(shuō)明堿基測(cè)序準(zhǔn)確度較高，滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析要求。煙草粉螟基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中A與T、C與G的互補(bǔ)堿基數(shù)基本一致，位置堿基N基本為零，但由于前幾個(gè)堿基測(cè)序質(zhì)量值較低以及DNA模板擴(kuò)增偏差等原因，常會(huì)導(dǎo)致每個(gè)Read前幾個(gè)堿基有較大波動(dòng)，屬于正常情況（圖2）。

圖2 GC含量分布結(jié)果Fig.2 Results of GC content distribution

2.3 K-mer分析

通過(guò)K-mer分析方法預(yù)測(cè)煙草粉螟基因組大小、雜合度和重復(fù)序列等基因組特征（表1）。當(dāng)取K=17時(shí)，SOAPde novo軟件預(yù)測(cè)得到的K-mer數(shù)為11 715 804 970個(gè)。根據(jù)K-mer深度分布（圖3），利用公式估算出煙草粉螟修正基因組大小為546.4 Mb，基因組雜合度為1.93%，重復(fù)序列比率為48.59%。

表1 K-mer分析所得基因組特征統(tǒng)計(jì)分析Tab.1 Genomic characteristics by K-mer analysis

圖3 深度和K-mer頻率分布圖Fig.3 Depth and K-mer frequency distribution

2.4 基因組初步組裝

利用SOAPde novo軟件對(duì)煙草粉螟測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行初步組裝（表2）。由于其基因組重復(fù)性較高，選擇K=41作為初步組裝的K-mer大小，首先組裝成Contigs，組裝得到的Contigs數(shù)量為3 192 823條，序列總長(zhǎng)為713 127 860 bp，最長(zhǎng)的序列長(zhǎng)度為59 643 bp，N50為244 bp。而后將Contigs組裝成Scaffolds，組裝得到的Scaffolds數(shù)量為3 054 965條，序列總長(zhǎng)為725 456 026 bp，最長(zhǎng)的序列長(zhǎng)度為162 813 bp，N50為288 bp。

表2 基因組組裝結(jié)果Tab.2 Results of genome assembly

2.5 鱗翅目昆蟲(chóng)基因組比較

目前已有13種鱗翅目昆蟲(chóng)（7種蛾類(lèi)和6種蝶類(lèi)）的基因組被發(fā)表（表3），其中，蛾類(lèi)基因組大小介于為337～824 Mb之間，蝶類(lèi)基因組大小介于為227～389 Mb之間，最大的是二化螟（824 Mb），最小的是玉帶鳳蝶（Papilio polytes，227 Mb），而煙草粉螟（546 Mb）基因組大小介于它們之間。煙草粉螟基因組GC含量為36.9%，與已知鱗翅目昆蟲(chóng)相近。煙草粉螟Contig N50最小，組裝質(zhì)量低，主要是由于煙草粉螟的基因組測(cè)序深度低，只對(duì)其進(jìn)行了初步組裝。

表3 鱗翅目14種昆蟲(chóng)基因組信息Tab.3 Genomic information of 14 species of Lepidoptera

3 討論

鱗翅目分為蛾類(lèi)和蝶類(lèi)，是昆蟲(chóng)綱中的第二大目，但目前已發(fā)表的鱗翅目昆蟲(chóng)基因組仍然較少［7］。另外，與流式細(xì)胞儀分析法相比，基因組調(diào)查分析是一種更精確的分析未知基因組特征的方法［24］，二化螟［9］和小菜蛾［27］等鱗翅目昆蟲(chóng)均采用基因組調(diào)查分析的方法評(píng)估基因組大小。通過(guò)對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)基因組大小進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)蛾類(lèi)基因組比蝶類(lèi)基因組大，而重復(fù)序列是導(dǎo)致不同昆蟲(chóng)基因組產(chǎn)生巨大差異的主要原因之一［22］。本研究中通過(guò)基因組調(diào)查分析預(yù)測(cè)煙草粉螟基因組大小為546.4 Mb，比大多數(shù)已知的蛾類(lèi)基因組大，推測(cè)可能原因是煙草粉螟基因組具有相對(duì)較多的重復(fù)序列。另外，基因組調(diào)查分析結(jié)果表明煙草粉螟基因組雜合度很高（1.93%），重復(fù)片段多（重復(fù)率為48.59%），屬于復(fù)雜昆蟲(chóng)基因組，組裝難度較大。因此，一方面通過(guò)自交對(duì)煙草粉螟種群進(jìn)行不斷純化，從而降低種群雜合度，另一方面通過(guò)構(gòu)建煙草粉螟二代、三代文庫(kù)，采用二代和三代相結(jié)合的測(cè)序策略，輔以Hi-C技術(shù)輔助基因組組裝，有望獲得高質(zhì)量染色體水平的煙草粉螟全基因組圖譜。

目前，二化螟［9］、棉鈴蟲(chóng)［10］和小菜蛾［27］等多種鱗翅目害蟲(chóng)的基因組已被公開(kāi)，研究人員利用基因組信息通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒定了解毒代謝、嗅覺(jué)感受和食性等相關(guān)的關(guān)鍵基因，進(jìn)而通過(guò)分子生物學(xué)和基因編輯驗(yàn)證這些基因的功能，為開(kāi)發(fā)綠色的新型害蟲(chóng)防治策略提供理論依據(jù)［10］。然而，目前僅報(bào)道了煙草粉螟線粒體基因組序列［28］，其全基因組還未見(jiàn)報(bào)道，制約了煙草粉螟生理習(xí)性和生長(zhǎng)發(fā)育等分子機(jī)理的研究。本研究中利用低深度測(cè)序?qū)煵莘勖蚪M進(jìn)行初步研究，由于測(cè)序深度較低，組裝質(zhì)量較差，仍需進(jìn)行煙草粉螟基因組的深度測(cè)序和組裝。對(duì)煙草粉螟全基因組進(jìn)行研究，進(jìn)而利用生物信息學(xué)篩選鑒定一些與煙草粉螟生理習(xí)性相關(guān)的基因，或者潛在的生物防治或化學(xué)防治的靶基因，可為煙草粉螟新型綠色殺蟲(chóng)劑的研制奠定基礎(chǔ)［29］。例如，利用煙草粉螟基因組鑒定其表皮幾丁質(zhì)降解酶基因和幾丁質(zhì)合成酶基因等昆蟲(chóng)表皮發(fā)育關(guān)鍵基因，通過(guò)基因編輯等方式研究其功能，從而篩選驗(yàn)證高致死率靶基因，有助于推動(dòng)煙草粉螟新型綠色殺蟲(chóng)劑的研制［29］。另外，利用煙草粉螟基因組鑒定其中的嗅覺(jué)基因，通過(guò)開(kāi)展嗅覺(jué)基因功能研究，利用反向化學(xué)生態(tài)學(xué)方法，有助于設(shè)計(jì)更高效安全的煙草粉螟引誘劑及交配干擾劑，從而為煙草粉螟的監(jiān)測(cè)和綠色防控提供理論依據(jù)和應(yīng)用指導(dǎo)［30］。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)煙草粉螟進(jìn)行全基因組調(diào)查分析，預(yù)測(cè)其基因組大小為546.4 Mb，雜合度為1.93%，重復(fù)序列比例為48.59%，GC含量為36.9%，屬于復(fù)雜昆蟲(chóng)基因組。由于測(cè)序深度低，采用K-mer 41進(jìn)行初步組裝，得到的Contigs總長(zhǎng)為713 127 860 bp，其N(xiāo)50為244 bp，Scaffolds總長(zhǎng)為725 456 026 bp，其N(xiāo)50為288 bp，組裝質(zhì)量較低。