王 中，趙利杰，劉萍萍，鄭 美，謝小東，王 晨，張劍鋒，羅朝鵬，楊 軍，武明珠*

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001 2.湖南省煙草公司郴州市公司，湖南省郴州市北湖區(qū)燕泉北路 423000

綠原酸（Chlorogenic acid），又名咖啡單寧，是植物在有氧呼吸過程中經(jīng)苯丙氨酸途徑合成的一種苯丙素類物質(zhì)［1-2］。茄科作物多酚類物質(zhì)中綠原酸含量最高，占多酚總含量的80%［3］。煙葉中含有3%～5%的綠原酸，綠原酸是煙草中僅有的單寧類物質(zhì)，也是煙葉中含量最高的多酚類化合物，約占多酚總量的70%～90%［4-5］。綠原酸不僅影響煙草的生長發(fā)育，對煙葉香吃味、調(diào)制特性及色澤等也有重要影響［6］。由于煙草中多酚類物質(zhì)揮發(fā)性低，分解后能進(jìn)入煙氣，因此對煙氣香味有直接影響［7］。另外，多酚類物質(zhì)與煙氣含水率呈負(fù)相關(guān)［8］。煙葉中棕色素的成分主要是綠原酸和蛋白質(zhì)，所以煙葉色澤和綠原酸含量密切相關(guān)［9］。

MYB轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，在擬南芥中MYB轉(zhuǎn)錄因子占轉(zhuǎn)錄因子總數(shù)的10.4%［10］。MYB轉(zhuǎn)錄因子具有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（MYB結(jié)構(gòu)域），MYB轉(zhuǎn)錄因子的二級和三級結(jié)構(gòu)域通常具有三螺旋結(jié)構(gòu)，并且在第二和第三螺旋之間通過轉(zhuǎn)角連接形成典型的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)（helix-coilhelix）［11］。有研究認(rèn)為，第二個和第三個螺旋分別參與DNA的結(jié)合與識別，而第一個螺旋沒有明確的結(jié)構(gòu)意義［12-13］。根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域數(shù)量,將其分為R1/R2-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB 4種類型［14］，其中R2R3-MYB是植物中最重要也是含量最多的一類MYB轉(zhuǎn)錄因子。由于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的多樣性和特異性，其功能也具有多樣性［14］。R2R3-MYB廣泛參與植物生長發(fā)育過程，包括次生代謝物調(diào)控、細(xì)胞分化與形態(tài)建成及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。也有研究發(fā)現(xiàn)MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對生物與非生物脅迫中也具有重要作用［15］。MYB類的轉(zhuǎn)錄因子參與綠原酸的合成調(diào)控，過表達(dá)擬南芥MYB12轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因番茄綠原酸含量提高2倍［16］。在煙草中過表達(dá)擬南芥MYB111轉(zhuǎn)錄因子基因，轉(zhuǎn)基因煙草綠原酸含量提高4.5倍［17］。金魚草轉(zhuǎn)錄因子AmMYB308和AmMYB330轉(zhuǎn)入煙草中可抑制煙草綠原酸等多酚類物質(zhì)的合成［18］。與一些需要同其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合才能產(chǎn)生調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子（如Bhlh、WD40）不同，MYB家族轉(zhuǎn)錄因子可直接調(diào)控基因的表達(dá)［18］。但目前煙草中調(diào)控綠原酸的轉(zhuǎn)錄因子研究報(bào)道還較少，因此研究調(diào)控綠原酸的轉(zhuǎn)錄因子對于調(diào)控?zé)煵葜芯G原酸含量有著重要意義。本課題組前期利用煙草全基因組表達(dá)譜芯片分析正常生長條件下煙草全生育期、全組織的基因表達(dá)譜以及不同生物或非生物脅迫條件下煙草基因組的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對已知綠原酸合成相關(guān)基因與所有煙草轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)行共表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)其中NtMYB59轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量與綠原酸合成基因表達(dá)量呈正相關(guān)。通過同源克隆方法得到了NtMYB59基因，并對該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和組織表達(dá)特異性表達(dá)分析，以及過表達(dá)該基因煙草的綠原酸含量檢測，旨在為全面解析植物綠原酸合成調(diào)控途徑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 煙草材料

供試煙草（Nicotiana tabacum）K326種子經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10%NaClO消毒后，播種于MS培養(yǎng)基上，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中［溫度（25±1）℃，光照強(qiáng)度2 000 lx］，長至2～3片真葉時采集整株幼苗用于基因克?。?9］。同時采集種植于光照培養(yǎng)箱中的K326和過表達(dá)NtMYB59基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株旺長期的第5葉位葉片用于檢測綠原酸含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

田間試驗(yàn)設(shè)置在湖南郴州桂陽縣煙草基地。供試品種K326，煙苗長至5片真葉時移栽，采集盛花期不同部位的煙草組織，包括根、莖、不同葉位的葉片（第5、第10和第15葉位葉片）、腋芽及花等，樣品采集后置于液氮速凍，超低溫冰箱（-80℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 煙草總RNA的提取及cDNA合成

分別采用北京密碼子生物科技有限公司的ExProRNA提取試劑盒和［寶生物工程（大連）有限公司］的PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒進(jìn)行RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書。

1.3 煙草NtMYB59基因全長克隆

根 據(jù)NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中檢索得到的擬南芥AtMYB59基因的CDS序列，在中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫（www.tobaccodb.org）中進(jìn)行Blast比對分析，并使用Primer Premier6軟件對Blast結(jié)果中相似性最高的基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物NtMYB59-F：5'-ATGGTGCAAGAGG AAATCAGAAGAGGT-3'，下游引物NtMYB59-R：5'-CCGAAAGTTACTCCAGTCAAAATC-3'，PCR引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：10μLPremixTaq、上下游引物各1μL、2 μL cDNA、最后用ddH2O補(bǔ)至20μL。PCR程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30次循環(huán)；72℃延伸10 min。

取3μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.5%）電泳進(jìn)行檢測，并使用［寶生物工程（大連）有限公司］的DNA純化回收試劑盒對目的片段進(jìn)行切膠回收，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書。純化回收得到的目的片段連接到pMD19-T載體［寶生物工程（大連）有限公司］上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，以培養(yǎng)皿平板上的菌斑為模板進(jìn)行PCR陽性克隆驗(yàn)證，同時對菌斑進(jìn)行擴(kuò)繁。驗(yàn)證為陽性的菌液由北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

1.4 煙草NtMYB59基因及編碼蛋白生物信息學(xué)分析

使用Expasy在線軟件（https：//web.expasy.org/translate/）將NtMYB59基因序列翻譯成氨基酸序列；使用NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線工具分析核酸及氨基酸序列的同源性；使用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列多重比對分析；使用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件分析NtMYB59蛋白的理論分子量、等電點(diǎn)及各種氨基酸含量；使用Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）在 線 軟件分析NtMYB59蛋白的親水性及疏水性；使用SignalP-5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線軟件預(yù)測NtMYB59蛋白是否有信號肽；NtMYB59蛋白的細(xì)胞定位分析使用PSORT（https：//www.genscript.com/psort.html）在線軟件；使用Pfam（http：//pfam.xfam.org/search/sequence）在線分析軟件預(yù)測蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；二級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）軟件；三級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）軟件；采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 煙草NtMYB59基因表達(dá)分析

采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析NtMYB59基因在煙株盛花期不同組織中的相對表達(dá)量。熒光定量PCR引物根據(jù)基因克隆得到的NtMYB59基因序列設(shè)計(jì)，上游引物NtMYB59-q-F：5'-TGGGTTAAT TACTTGAATCCTGATCTC-3'，下游引物NtMYB59-q-R：5'-CAGTTCGCCCTGGTATTTTTCGT-3'；內(nèi)參基因選用煙草L25基因，上游引物L(fēng)25-q-F：5'-CCCCTCACCACAGAGTCTGC-3'，下游引物L(fēng)25-q-R：5'-AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT-3'。所用實(shí)時熒光定量PCR儀為美國伯樂公司的Bio-Rad CFX96，所用試劑SYBR Premix ExTaqTM為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。定量PCR反應(yīng)體系20μL：10μL SYBR Premix Ex TaqTM，cDNA 2μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 6μL。PCR程序：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，45個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCT方法［20］。以煙株盛花期莖節(jié)的相對表達(dá)量為對照（設(shè)定為1），基因的相對表達(dá)量為該基因在其他組織中的表達(dá)量與對照的比值。

1.6 煙草綠原酸含量測定

取50 mg冷凍保存的煙葉樣品，于液氮中研磨成粉末。轉(zhuǎn)入1.5 mL預(yù)冷的V（甲醇）∶V（水）=4∶1提取液中，常溫下超聲30 min，4℃下靜置12 h；然后在4℃，20 000 r/min條件下離心10 min，取上清液。提取的上清液用超高效液相-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司）測定綠原酸含量。分析條件：色譜柱ACQUITY uplc HSS T3（2.1×50 mm，1.8μm），3μL，流速0.4 mL/min，流動相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的甲醇溶液。梯度洗脫：0 min，5%B；1 min，60%B；3 min，70%B；3.01 min，95%B；4 min，95%B；4.01 min，5%B；5 min，5%B。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草NtMYB59基因克隆

以煙草整株幼苗（2～3片真葉）的cDNA為模板，經(jīng)由設(shè)計(jì)的特異基因克隆引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物條帶長度約為700 bp左右，見圖1。PCR產(chǎn)物經(jīng)過切膠回收及純化后連接克隆載體并測序，測序得到的基因序列全長為666 bp，共編碼221個氨基酸。

2.2 煙草NtMYB59基因及編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

NtMYB59基因核苷酸序列與其他物種的MYB59基因核苷酸序列相似性較低，與擬南芥、玉米、丹參及蘋果的相似性分別為52.06%、52.84%、51.49%和37.83%。但通過DNAMAN軟件對煙草（NtMYB59）、擬南芥（AtMYB59）、玉米（ZmMYB59）、可可樹（TcMYB59）等物種的MYB59蛋白序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，不同物種的MYB59蛋白序列相似性較高，特別在C端的相似性更高，且從煙草中得到的NtMYB59基因的保守結(jié)構(gòu)域具有DNA結(jié)合域螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的特征，見圖2。因此，將該基因命名為NtMYB59。

用MEGA 7.0軟件對NtMYB59和不同物種MYB59氨基酸序列進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明NtMYB59與玉米（Zea mays）在親緣關(guān)系上較為接近，在進(jìn)化上屬于同一分支，見圖3。

圖1 NtMYB59基因的PCR電泳圖Fig.1 PCR electrophoretogram of NtMYB59 gene

圖2 煙草NtMYB59蛋白與其他植物MYB59蛋白序列比對Fig.2 Sequence alignment of tobacco NtMYB59 protein and MYB59 protein of other plants

分析發(fā)現(xiàn)，NtMYB59蛋白預(yù)測分子量為26.26 kDa，等電點(diǎn)為8.33。有35個帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）和37個帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）。其在酵母體內(nèi)的半衰期大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)大于10 h，蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為64.90%，預(yù)測為不穩(wěn)定蛋白。該蛋白疏水性絕對值最大為0.937，親水性最大為1.778，親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，推測其為親水性蛋白。分析發(fā)現(xiàn)該蛋白沒有信號肽，不是分泌型蛋白，且定位于細(xì)胞核中。

通過蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖4）發(fā)現(xiàn)，NtMYB59蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲（Coil）和螺旋（Helix）組成，具有典型的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋構(gòu)象，這與MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白二級結(jié)構(gòu)特征相符。用Pfam預(yù)測NtMYB59的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白在8～55和61～106區(qū)段含有兩個Myb_DNA-結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域。SWISS-MODEL預(yù)測NtMYB59蛋白的三級結(jié)構(gòu)（圖5），預(yù)測得到的三級結(jié)構(gòu)符合R2R3-MYB蛋白的結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)一步證明了NtMYB59蛋白屬于MYB基因家族。

2.3 煙草不同組織部位NtMYB59基因表達(dá)分析

通過分析NtMYB59基因在煙草盛花期不同組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NtMYB59基因在不同葉位的葉片、側(cè)根、須根以及花中的表達(dá)量較高，在莖稈、莖節(jié)、腋芽以及花蕾中的表達(dá)量較低，見圖6。說明NtMYB59基因表達(dá)具有組織差異性。

圖3 植物MYB59轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進(jìn)化樹Fig.3 Evolutionary tree of plant MYB59 transcription factor

圖4 NtMYB59蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Predicted secondary structure of NtMYB59 protein

圖5 NtMYB59蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Predicted tertiary structure of NtMYB59 protein

2.4 在煙草中過表達(dá)NtMYB59基因?qū)G原酸含量的影響

NtMYB59基因序列克隆測序完成后，構(gòu)建該基因的過表達(dá)載體，并用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草K326品種。通過測定煙草旺長期T2代陽性轉(zhuǎn)基因植株（OE-1、OE-2、OE-3、OE-4和OE-5）第5葉位的葉片綠原酸含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉片中綠原酸含量顯著上升，5個獨(dú)立轉(zhuǎn)化株與對照（K326）相比綠原酸含量分別增加43.4%、28.3%、19.5%、62.9%和55.7%（圖7），說明NtMYB59基因?qū)G原酸合成具有調(diào)控作用。

圖6 NtMYB59基因在煙草盛花期不同組織中的表達(dá)Fig.6 Expression of NtMYB59 gene in different tissues at full flowering stage of tobacco

3 討論

目前在植物中已經(jīng)鑒定出多個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，在擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)MYB轉(zhuǎn)錄因子參與了花青素的生物合成，以及綠原酸、類黃酮代謝及植物次生細(xì)胞壁的形成等多種次生代謝過程［16，21-22］。本試驗(yàn)中采用基因同源克隆方法從普通煙草K326中克隆得到一個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為NtMYB59。蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明NtMYB59蛋白具有MYB轉(zhuǎn)錄因子典型的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋構(gòu)象，用Pfam預(yù)測NtMYB59的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白在8～55和61～106區(qū)段含有兩個Myb_DNA-結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)構(gòu)域可能與DNA的識別與結(jié)合有關(guān)，這與前人報(bào)道的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征相一致［23］。

NtMYB59的基因表達(dá)具有組織特異性，在葉片、側(cè)根、須根以及花中的表達(dá)量比較高，在莖稈、莖節(jié)以及花蕾中的表達(dá)量比較低。在對小麥MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究中發(fā)現(xiàn)，TaMYB59基因在其根中的表達(dá)量也較高，與煙草NtMYB59不同的是其在葉片中表達(dá)量相對較低［24］；在菊花中的研究發(fā)現(xiàn)菊花的CmMYB59基因在根及葉中的表達(dá)量最高［25］，但是菊花CmMYB59與煙草NtMYB59不同，在莖中的表達(dá)量也比較高，說明MYB59基因在植物的生長發(fā)育過程中的表達(dá)模式有一定的相似性，但也存在差異性，MYB59基因在不同的物種中調(diào)控功能可能存在差異。

通過測定轉(zhuǎn)NtMYB59基因煙草T2代植株葉片中的綠原酸含量發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)NtMYB59基因煙草中的綠原酸含量顯著提高。這與本課題組通過基因芯片大數(shù)據(jù)分析預(yù)測的NtMYB59基因參與調(diào)控綠原酸合成基因的結(jié)果相一致。綠原酸和植物的抗逆性密切相關(guān)，過表達(dá)擬南芥MYB12轉(zhuǎn)錄因子不僅增加了綠原酸含量，還增加了擬南芥抵御干旱及氧化脅迫的能力［26］。煙草中過表達(dá)NtMYB59基因能否增加煙草的抗逆性及其調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

圖7 過表達(dá)NtMYB59基因?qū)G原酸含量的影響Fig.7 Effects of over expression of NtMYB59 gene on chlorogenic acid content

4 結(jié)論

通過同源克隆方法從煙草中克隆獲得1個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，并通過生物信息學(xué)方法對該基因和基因編碼的蛋白進(jìn)行分析，并將該基因命名為NtMYB59。通過分析NtMYB59基因在煙草不同組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，該基因在煙株第5葉位葉片中的表達(dá)量最高。通過測定過表達(dá)NtMYB59基因煙草中的綠原酸含量發(fā)現(xiàn)，在煙草中過表達(dá)NtMYB59基因可顯著的提高煙草葉片中的綠原酸含量，說明NtMYB59基因能夠調(diào)控?zé)煵葜械木G原酸合成。