王 靜 劉丁麗 羅 丹 成 婧 陸 俊 Otobong Donald Akan 羅非君

(林產(chǎn)可食資源安全與加工利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，長(zhǎng)沙 410004)(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2，長(zhǎng)沙 410004)(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所3，北京 100193)(湖南省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院4，長(zhǎng)沙 410004)

近年來(lái)，由于谷物食品對(duì)糖尿病、肥胖癥、心血管疾病等與生活方式和飲食習(xí)慣相關(guān)的疾病具有潛在抑制作用而被視為健康食品。因此，從谷物中發(fā)現(xiàn)的具有保健功效的生物活性成分已成為越來(lái)越多科研工作的研究熱點(diǎn)。藜麥(ChenopodiumQuinoawild)原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈，是安第斯人的傳統(tǒng)主食，與其他常見(jiàn)谷物相比，藜麥營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高，含有60%左右的淀粉類(lèi)化合物、約15%的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、約10%的脂質(zhì)且主要為不飽和脂肪酸，核黃素、維生素E、葉酸等維生素類(lèi)物質(zhì)也高于一般谷物、富含礦物質(zhì)(鈣、鎂、鐵、鉀等)等成分，近年來(lái)引起了廣泛關(guān)注并被其他國(guó)家引種，在我國(guó)青海、西藏、山西等地均有種植。許多地區(qū)將藜麥看作一種“功能性食品”[1]，因其具有抑制前列腺癌細(xì)胞增殖[2]，調(diào)節(jié)血糖，降低膽固醇，保護(hù)心腦血管等諸多益處[3]。研究表明，藜麥的主要活性成分有多酚、黃酮、皂苷、多糖和可溶性纖維[4]，其多酚含量與抗氧化能力呈正相關(guān)[5]。多酚具有清除自由基、減少體內(nèi)外氧化損傷、預(yù)防機(jī)體發(fā)生與氧化有關(guān)的慢性疾病等能力[6]，而藜麥種子中含有槲皮素、山奈酚、香草醛酸、阿魏酸、阿魏酸-4-葡萄糖苷等多種酚類(lèi)化合物[7，8]。此外，有報(bào)道稱(chēng)酚類(lèi)化合物可作為糖苷酶抑制劑，用于降低由腸道淀粉消化引起的餐后高血糖[9，10]。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是參與小腸碳水化合物消化降解的關(guān)鍵酶[11]，抑制它們的活性就可以減緩淀粉分解，降低糖尿病患者餐后血糖水平。

現(xiàn)階段，藜麥研究大多數(shù)集中在其物理和化學(xué)特性[12，13]、營(yíng)養(yǎng)成分、功能性[14]、加工工藝對(duì)活性成分的影響[15，16]等方面。大多數(shù)生物活性物質(zhì)在發(fā)揮其生物活性之前都要經(jīng)過(guò)胃腸道消化，不同產(chǎn)地、不同研究得到的藜麥功能活性成分含量也不盡相同。因此，本研究旨在探討經(jīng)過(guò)體外模擬胃腸道消化，藜麥中的酚類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物、抗氧化作用以及對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用的差異，為藜麥作為功能性食品原料改善人體健康提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3種脫殼藜麥(均為白藜麥)分別產(chǎn)自青海、山西和玻利維亞(進(jìn)口)。福林-酚試劑、ABTS(超純)、蘆丁(≥98%)、沒(méi)食子酸(≥99.3%)、兒茶素(≥98%)、水溶性維生素E(≥98%)、2, 4, 6-三吡啶三嗪(tripyridyltriazine，TPTZ，≥98%)、DPPH(>97%)；豬胰酶(250 N.F.U/mg)、胃蛋白酶(800～2 500 U/mg)、α-淀粉酶(>10 U/mg)、α-葡萄糖苷酶(>50 U/mg)、透析袋(YA1082-5M，MWCO 1000)，其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),JY92-Ⅲ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),AuY220電子分析天平。

1.3 方法

1.3.1 未消化樣品的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g藜麥種子粉末(40目)放入錐形瓶中，加入50 mL含0.1% HCl的70%甲醇溶液，在500 W下超聲40 min，在12 000 r/min下離心15 min，取上清液，按照相同步驟再次提取沉淀物，合并兩次提取液作為藜麥未消化樣品。

1.3.2 體外模擬胃、腸消化

根據(jù)Miller等[17]的方法作適當(dāng)修改進(jìn)行模擬消化。第一部分是模擬胃液消化，取20 g藜麥粉末和200 g生理鹽水在燒杯中充分混勻，進(jìn)行沸水浴并持續(xù)攪拌15 min。待樣品溶液冷卻后，加入去離子水調(diào)至220 g。用1 mol/L HCl將樣品懸濁液的pH值調(diào)至2.0，再加入1 mL模擬胃液(0.5 g胃蛋白酶溶于5 mL 0.01 mol/L的HCl)。鹽酸對(duì)照組用1.0 mL 0.01 mol/L的HCl代替模擬胃液，空白對(duì)照組用1 mL的去離子水替代鹽酸和胃液。錐形瓶用錫紙包裹避光，在37 ℃、100 r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器中消化2 h，離心收集上清液，再加無(wú)水乙醇(最終濃度高達(dá)60%)并放入冰箱中反應(yīng)6 h以除去糖和蛋白質(zhì)，離心取上清液作為胃消化組、鹽酸對(duì)照組和空白對(duì)照組樣品進(jìn)行分析。

第二部分是模擬腸道消化，透析袋中注入8 mL生理鹽水和2.0 mL 0.1 mol/L NaHCO3溶液再將透析袋浸入上述胃消化液中，在37 ℃、100 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中振蕩45 min。然后，在透析袋外的胃消化液中加入5 mL胰液膽汁混合液(0.4 g胰酶，2.5 g膽汁提取物溶于100 mL 0.1 mol/L的NaHCO3溶液中)模擬腸消化，腸空白組則加入5 mL 0.1 mol/L的NaHCO3溶液。兩組均在37 ℃、100 r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器中消化2 h。最后，透析袋內(nèi)外的液體去除蛋白，離心后留上清液備用，以透析袋外液分別作為腸消化組和腸空白組樣品。

1.3.3 總多酚和總黃酮的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[18]測(cè)定總多酚(TPC)和總黃酮(TFC)，以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)多酚含量進(jìn)行定量，結(jié)果表示為每克干重樣品的沒(méi)食子酸毫克當(dāng)量(mg GAE/gmd)；用兒茶素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)總黃酮進(jìn)行定量，結(jié)果以每克干重樣品中兒茶素毫克當(dāng)量表示(mg CE/gmd)。

1.3.4 生物利用率的測(cè)定

生物利用率是指人體吸收利用的有效成分總量占食品中有效成分總量的比例[19]。通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的動(dòng)力學(xué)模型，利用透析袋模擬胃腸道在體內(nèi)的消化吸收，研究體外消化對(duì)藜麥營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收利用的影響。其生物利用率按式(1)計(jì)算。

(1)

式中：C1和C2分別為透析袋內(nèi)、透析袋外的TPC或TFC/mg。

1.3.5 抗氧化活性的測(cè)定

選擇常用的三種抗氧化方法DPPH，ABTS，F(xiàn)RAP進(jìn)行抗氧化活性的測(cè)定，具體操作根據(jù)文獻(xiàn)[18]進(jìn)行，用Trolox 作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，結(jié)果以每克干重樣品中微摩爾Trolox當(dāng)量表示(μmol TE/gmd)。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶的抑制活性的測(cè)定

根據(jù)Yang等[20]的方法測(cè)定α-葡萄糖苷酶的抑制活性。200 μL樣品提取液和200 μL 0.01 mg/mL α-葡萄糖苷酶(溶于0.01 mol/L pH=6.8磷酸鈉緩沖溶液)，37 ℃反應(yīng)15 min，再加入200 μL 2.5 mmol/L 對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖(pNPG)溶液。37 ℃反應(yīng)10 min后，加入5 mL 0.10 mol/L NaCO3溶液終止反應(yīng)，在400 nm處測(cè)定吸光度A?？瞻捉M用去離子水代替樣品提取液，對(duì)照組用緩沖液代替酶。抑制率的計(jì)算見(jiàn)式(2)。

表1 藜麥的TPC、TFC以及抗氧化活性

α-葡萄糖苷酶的抑制率=

(2)

1.3.7 α-淀粉酶抑制活性測(cè)定

α-淀粉酶抑制活性根據(jù)Tao等[21]的方法測(cè)定。1.0 mL樣品提取液與0.3 mL的α-淀粉酶(溶于pH=6.8的磷酸鹽緩沖液)在37℃下放置5 min，加0.4 mL 1%淀粉溶液在37℃下反應(yīng)15 min。再加入0.5 mL DNS試劑(1.575 g 3,5-二硝基水楊酸溶于5.25 g的NaOH溶液中，加入含有45.5 g酒石酸鉀鈉熱溶液125 mL，再加入1.25 g苯酚和1.25 g亞硫酸鈉，攪拌均勻加熱至溶解，冷卻后定容至250 mL，儲(chǔ)存于棕色瓶中，放置一星期后使用)，混合溶液沸水浴5 min，冷卻至室溫，去離子水定容至25 mL，在540 nm處測(cè)量吸光度。用去離子水代替藜麥提取液作為空白組，去離子水代替α-淀粉酶溶液作對(duì)照組，抑制率按式(3)計(jì)算。

α-淀粉酶的抑制率=

(3)

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)做3次平行，所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Spearman相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)。P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 藜麥提取物的總酚、總黃酮含量及抗氧化活性

經(jīng)過(guò)超聲波輔助酸化甲醇提取后，藜麥的TPC、TFC和抗氧化活性結(jié)果如表1所示。3個(gè)品種中，青海藜麥的TPC最高，玻利維亞藜麥的TPC最低，其值均高于意大利皮亞琴察(Piacenza)藜麥粉的多酚含量(87.2 mg/100 g)[22]。青海、山西、玻利維亞藜麥的TFC含量遠(yuǎn)高于Abderrahim等[23]的報(bào)道(47～255 mg/100 g)。在一定程度上，不同的提取方法、不同產(chǎn)地或藜麥的基因型可能會(huì)造成這種差異。3種藜麥的抗氧化活性也存在一定差異，DPPH自由基清除活性從高到低依次為青海藜麥>山西藜麥>玻利維亞藜麥(表1)。ABTS自由基清除活性則依次為山西藜麥>青海藜麥>玻利維亞藜麥。FRAP法所得結(jié)果與ABTS有相似的趨勢(shì)，山西藜麥的抗氧化活性最高，玻利維亞藜麥的抗氧化活性最低，與Zhao等[24]的結(jié)果(12.74～16.57 μmol TE/gmd)相近，高于秘魯高原的黃色藜麥[(12.5±2.3)μmol TE/g]和紫紅色藜麥[(18.4±1.7)μmol TE/g]的值[25]?？寡趸钚灾g的差異可能是由于多酚和類(lèi)黃酮等抗氧化活性物質(zhì)含量的不同引起的，也可能是由產(chǎn)地、提取方法、品種等差異造成的。

2.2 模擬消化后總酚、總黃酮的釋放及生物利用率

3種藜麥在體外模擬消化后的TPC和TFC含量如圖1所示。隨著消化的進(jìn)行，TPC和TFC含量均逐漸升高。在胃消化過(guò)程中，青海、山西、玻利維亞藜麥的TPC分別比未消化組增加了102.73%、91.07%、168.93%，TFC分別比未消化組增加了127.03%、113.31%、194.36%。其中玻利維亞藜麥胃消化后的TPC和TFC增幅最大，而青海藜麥的值最高。雖然青海藜麥、山西藜麥的鹽酸組和胃消化組的TFC無(wú)顯著性差異，但胃消化組的TFC值仍高于鹽酸組。在胃蛋白酶催化作用下，可能會(huì)使更多的多酚和黃酮釋放到模擬胃液中。

腸消化過(guò)程中TPC和TFC持續(xù)升高。青海、山西、玻利維亞藜麥腸消化組的TPC分別比未消化組增加了202.41%、178.41%、270.38%，同時(shí)，TFC分別比未消化組增加了219.86%、236.79%和352.84%，也顯著高于胃消化組。值得注意的是，除了青海藜麥和山西藜麥的TFC值外，腸消化組和腸空白組之間沒(méi)有顯著差異，這可能是由于空白組的堿性環(huán)境與模擬腸液中的胰酶等物質(zhì)對(duì)多酚的釋放有類(lèi)似影響，或者是胰酶對(duì)TFC釋放的影響較大，對(duì)TPC影響較小。

注：同一評(píng)價(jià)指標(biāo)的不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)，同一柱形圖上的不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。圖1 體外模擬消化前后藜麥的TPC和TFC

模擬胃腸體外消化后，3種藜麥的TPC和TFC值顯著升高，這與Pellegrini等[26]所發(fā)現(xiàn)的變化趨勢(shì)一致。消化組總酚含量的增加可能是由于胃蛋白酶的水解作用或堿性消化環(huán)境有利于酚類(lèi)物質(zhì)從復(fù)雜的食物基質(zhì)中釋放出來(lái)。同時(shí)，大多數(shù)腸消化組和腸空白組的TPC和TFC值無(wú)顯著性差異，這可能是由于腸道消化組中的總酚和總黃酮轉(zhuǎn)移到了透析袋里面。在整個(gè)胃腸消化期結(jié)束時(shí)，玻利維亞藜麥、山西藜麥和青海藜麥總酚的17.50%、19.02%和20.49%，總黃酮的32.15%，32.13%和32.00%進(jìn)入到透析袋內(nèi)，且略高于腸空白組，即這些成分是可以被吸收的。由此可知，體外消化可以提高藜麥活性物質(zhì)在腸道水平上的消化吸收。

2.3 模擬消化對(duì)藜麥抗氧化活性的影響

模擬消化對(duì)藜麥抗氧化活性影響的結(jié)果如圖2所示。抗氧化活性值隨著消化過(guò)程的進(jìn)行而逐漸升高，呈現(xiàn)出腸消化組明顯高于胃消化組和未消化組的大致趨勢(shì)。青海藜麥、山西藜麥和玻利維亞藜麥的DPPH抗氧化活性以腸消化組抗氧化活性最高，比相應(yīng)的未消化組分別提高了124.27%、85.22%和96.39%，且顯著高于相應(yīng)的胃消化組。同樣的，經(jīng)腸消化后，3種藜麥的ABTS抗氧化活性分別比未消化組提高了86.38%、55.18%和37.36%。腸消化組的ABTS清除能力略高于腸空白組和胃消化組，這可能是因?yàn)樵谀c消化組有更多的抗氧化成分滲入透析袋導(dǎo)致透析袋外(即腸消化組)的抗氧化成分減少所致。FRAP抗氧化能力則表現(xiàn)出與DPPH法相似的趨勢(shì)，但增長(zhǎng)幅度較小。3種藜麥透析袋內(nèi)溶液的抗氧化能力分別占透析袋外溶液總抗氧化能力的19.13%～23.16%(DPPH)，26.50%～32.47%(ABTS)，12.87%～17.58%(FRAP)，均略高于腸空白組，說(shuō)明有更多的抗氧化成分進(jìn)入透析袋并在腸消化時(shí)可發(fā)揮生物活性作用。

注：同一檢測(cè)方法的不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05);同一柱形圖上的不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。圖2 體外模擬消化前后藜麥的抗氧化活性

這些結(jié)果表明通過(guò)胃蛋白酶、胰蛋白酶和膽鹽的消化可能有助于將更多的酚酸、黃酮等抗氧化成分從藜麥種子中釋放出來(lái)，而多酚物質(zhì)與藜麥的抗氧化能力呈正相關(guān)，因此體外抗氧化活性也有所提高。在本研究中，Spearman相關(guān)性分析也證實(shí)了3種抗氧化活性(DPPH、ABTS和FRAP)與多酚之間的高度相關(guān)性(P<0.01)(相關(guān)系數(shù)分別為0.913，0.960和0.933)。

2.4 藜麥對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用

消化的各個(gè)階段，3種藜麥對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的結(jié)果如圖3所示。所有受試組對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力均呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性關(guān)系(圖3)。未消化組中，以玻利維亞藜麥的抑制能力最強(qiáng)，IC50值最低(27.43 mg/mL)。模擬胃消化后，3種藜麥在各個(gè)濃度下對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性均明顯增強(qiáng)，仍以玻利維亞藜麥抑制能力最強(qiáng)，具有最低IC50值(21.90 mg/mL)。同時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)組的IC50均低于相應(yīng)的未消化組。在進(jìn)一步模擬腸道消化后，IC50值繼續(xù)下降，表明其比胃消化組的抑制活性更強(qiáng)，以山西藜麥腸消化組的抑制活性最強(qiáng)，IC50值最低(16.24 mg/mL)。這些結(jié)果表明，模擬胃腸道消化后，藜麥對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性明顯增強(qiáng)。

圖3 體外模擬消化前后藜麥對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

2.5 藜麥對(duì)α-淀粉酶的抑制活性

3種藜麥對(duì)α-淀粉酶的抑制活性也均呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系(圖4)。3種藜麥未消化組的IC50為11.43～27.43 mg/mL，低于抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值，說(shuō)明藜麥對(duì)α-淀粉酶的抑制能力強(qiáng)于α-葡萄糖苷酶。經(jīng)胃消化后，抑制活性略有提高，3種藜麥的IC50值均低于未消化組，同樣的，胃消化組中抑制α-淀粉酶的IC50值也低抑制于α-葡萄糖苷酶的IC50值。綜上可知，在模擬胃液消化的條件下，藜麥胃消化產(chǎn)物對(duì)α-淀粉酶的抑制活性明顯增強(qiáng)，且相比α-葡萄糖苷酶，對(duì)α-淀粉酶的抑制能力更強(qiáng)。

圖4 體外模擬消化前后藜麥對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響

然而，藜麥對(duì)α-淀粉酶的抑制活性并沒(méi)有隨著消化的進(jìn)行而繼續(xù)提升，反而有所降低。在模擬腸道消化階段，玻利維亞藜麥在20 mg/mL時(shí)抑制率為59.46%，明顯低于胃消化組的75.13%。 相應(yīng)的IC50值為10.67 mg/mL，也顯著大于胃消化組的IC50(6.53 mg/mL)。青海藜麥和山西藜麥與玻利維亞藜麥有相似的趨勢(shì)，IC50分別為8.17、9.17 mg/mL，均略高于各自胃消化組的IC50(分別為6.77、6.99 mg/mL)。這些結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)腸消化，藜麥對(duì)α-淀粉酶的抑制活性有所降低。這有可能是部分具有抑制α-淀粉酶活性的成分由透析外液進(jìn)入透析袋內(nèi)，引起透析外液(腸消化組)抑制活性減弱，同時(shí)的透析袋內(nèi)的抑制活性增強(qiáng)(3種藜麥透析袋內(nèi)液的IC50值分別為7.34、5.40、6.23 mg/mL)。這些結(jié)果也表明，藜麥腸消化后更容易被腸道利用以發(fā)揮其抑制α-淀粉酶的活性。此外，比較兩種酶的IC50值可知所有藜麥的腸道消化組對(duì)α-淀粉酶的IC50值均顯著低于α-葡萄糖苷酶，表明藜麥消化后對(duì)α-淀粉酶的抑制活性要強(qiáng)于對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制劑可以減緩腸道內(nèi)碳水化合物的消化從而降低餐后血糖濃度。藜麥對(duì)α-淀粉酶的抑制作用鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。Hemalatha等[27]研究了印度白藜麥麩皮和殼提取物對(duì)α-淀粉酶(IC50值分別為108.68和148.23 μg/mL)和α-葡萄糖苷酶(IC50值分別為62.1和68.14 μg/mL)的抑制作用，并證明其與高含量的總酚和總黃酮有關(guān)。抑制活性的不同可能與提取物是否消化或抑酶活性的測(cè)量條件不同有關(guān)。研究結(jié)果表明，體外消化后藜麥酚類(lèi)物質(zhì)釋放量增加，對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性更接近真實(shí)水平，尤其是透析袋中TPC和TFC的利用率適中，IC50值較低。因此，藜麥有潛力作為替代的功能食品，延緩膳食中碳水化合物的吸收，從而抑制餐后血糖水平的升高。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用體外模擬消化研究藜麥消化前后多酚、黃酮的變化情況及其抗氧化能力、抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的變化，結(jié)果表明，3種藜麥在消化前后均具有抗氧化能力、抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的能力。消化前，青海藜麥、山西藜麥總多酚、總黃酮及抗氧化能力均優(yōu)于進(jìn)口的玻利維亞藜麥。模擬消化后，3種藜麥的總酚和總黃酮含量顯著增加，生物利用率提高，DPPH、ABTS、FRAP方法測(cè)得的抗氧化活性有相似的變化趨勢(shì)且抗氧化活性都顯著增強(qiáng)，對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用也顯著增強(qiáng)，后續(xù)可研究藜麥有效成分的具體組成及利用動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證藜麥對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力。