郭風(fēng) 趙瑞敏 李景亮 劉源溪 楊淑娟（禹州市中醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，禹州 461670）

目前，肺癌在我國處于高發(fā)狀態(tài)，且發(fā)病率逐年上升［1］。作為一個全球醫(yī)療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)問題，目前針對肺癌的研究已有很多，但對肺癌治療有效的藥物仍然很少［2］。肺癌發(fā)生的分子機(jī)制十分復(fù)雜，致病因素多樣，導(dǎo)致其具有較高發(fā)病率［3］。國內(nèi)外對肺癌的藥物研發(fā)已有很多，但阿魏酸作為傳統(tǒng)中藥阿魏和川芎的提取物［4］，其對肺癌的作用研究相對較少。目前有研究表明，傳統(tǒng)中藥阿魏（feru-lic acid，F(xiàn)A）和川芎具有很好的抑癌作用［5］，但是具體的抑癌成分尚不十分清楚，阿魏酸作為阿魏和川芎的提取物在抑癌作用中起到什么作用，同樣沒有報道。因此本研究以阿魏酸為研究對象，觀察其對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，同時對其作用的分子機(jī)制做了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料A549細(xì)胞購自鄭州大學(xué)細(xì)胞庫；阿魏酸單體購自河南省食品藥品檢驗(yàn)所；蛋白定量試劑盒、SDS凝膠試劑盒、細(xì)胞裂解液購自北京碧云天；結(jié)晶紫、高錳酸鉀、草酸、冰醋酸購自鄭州馬基森生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑購自羅氏試劑生物有限公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶消化液、青 鏈 霉 素購 自HyClone；β‐actin/COX‐2、Sur-vivin、XIAP、p‐53抗體購自Abcam。

1.2 方法

1.2.1 CCK‐8增殖實(shí)驗(yàn)A549細(xì)胞4×105個/孔鋪板，細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，不同濃度阿魏酸處理48 h。結(jié)束后每孔加入20μl CCK‐8試劑，避光3 h，搖床振蕩15 min。酶標(biāo)儀450 nm檢測細(xì)胞CCK‐8混合液OD值進(jìn)行活力分析。

1.2.2 qRT‐PCR A549細(xì)胞4×105個/孔直接鋪板，細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，給予10 ng/ml TGF‐β1刺激24 h，隨后不同濃度阿魏酸給藥處理48 h，嚴(yán)格按照試劑盒說明步驟進(jìn)行提取、定量、反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)。

1.2.3 Western blot A549細(xì)胞4×105個/孔直接鋪板，細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，10 ng/ml TGF‐β1刺激24 h，20μmol/L姜黃素處理48 h。隨后消化細(xì)胞鋪至培養(yǎng)皿，細(xì)胞密度80%時收集細(xì)胞，裂解液（含有蛋白酶抑制劑）冰上裂解30 min后，4℃高速離心30 min后吸取上層蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，隨后脫脂牛奶封閉，PBST清洗Ku70、CDK12和β‐actin一抗（抗體稀釋比均為1∶1 000），4℃過夜。第2天冷PBS清洗條帶3次，二抗孵育1 h，發(fā)光儀發(fā)光拍照。

1.2.4 ELⅠSA檢測免疫炎癥因子水平A549細(xì)胞4×105個/孔直接鋪板，細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，給予不同濃度阿魏酸處理48 h。采集細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r/min離心20 min，離心分離后取上清液進(jìn)行檢測。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書步驟，檢測細(xì)胞培養(yǎng)液IL‐4、PDGF和GM‐CSF的含量。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)A549細(xì)胞4×105個/孔鋪板，細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，劃痕處理，顯微鏡下觀察拍照，給予不同濃度阿魏酸處理48 h，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)A549細(xì)胞4×105個/孔鋪板，細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，Transwell小室上室無血清DMEM接種A549細(xì)胞，下室10%血清DMEM。給予不同濃度阿魏酸處理48 h。多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫室溫染色15 min，33%乙酸脫色。酶標(biāo)儀570 nm檢測混合液OD值并進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS20.0軟件統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用F檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度阿魏酸對A549細(xì)胞增殖的抑制作用CCK‐8檢測不同濃度阿魏酸（0、0.5、1、2、4、8、16 mg/ml）給藥處理后的A549細(xì)胞活力，結(jié)果顯示不同濃度阿魏酸對A549的增殖具有抑制作用，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 阿魏酸抑制A549細(xì)胞遷移能力2、4、8 mg/ml阿魏酸給藥處理A549細(xì)胞，48 h后觀察A549細(xì)胞劃痕愈合情況。結(jié)果表明，2、4、8 mg/ml阿魏酸作用A549細(xì)胞48 h后均能顯著抑制A549細(xì)胞劃痕愈合能力，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 阿魏酸抑制A549細(xì)胞侵襲能力2、4、8 mg/ml阿魏酸給藥處理A549細(xì)胞，48 h后觀察A549細(xì)胞侵襲情況。結(jié)果表明2、4、8 mg/ml阿魏酸作用A549細(xì)胞48 h后均能顯著抑制A549細(xì)胞侵襲，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖1 不同濃度阿魏酸對A549細(xì)胞增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of ferulic acid at different concen-trations on A549 cell proliferation

圖2 不同濃度阿魏酸對A549細(xì)胞遷移抑制作用Fig.2 Different concentrations of ferulic acid on migra-tion inhibition of A549 cells

圖3 不同濃度阿魏酸對A549細(xì)胞侵襲抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of ferulic acid at different concen-trations on A549 cell invasion

圖4 不同濃度阿魏酸抑制A549細(xì)胞腫瘤相關(guān)免疫表達(dá)Fig.4 Different concentrations of ferulic acid inhibit tu-mor‐associated immune expression in A549 cells

圖5 阿魏酸抑制A549細(xì)胞JAK2/STAT6免疫信號通路激活Fig.5 Ferulic acid inhibitis activation of JAK2/STA6 im-mune sigaling pathway in A549 cells

2.4 阿魏酸抑制A549細(xì)胞腫瘤相關(guān)免疫因子表達(dá)2、4、8 mg/ml阿魏酸給藥處理A549細(xì)胞，48 h后觀察A549細(xì)胞培養(yǎng)液中腫瘤相關(guān)免疫因子IL‐PDGF和GM‐CSF的表達(dá)情況。結(jié)果表明2、4、8 mg/ml阿魏酸作用A549細(xì)胞48 h后均能顯著抑制A549細(xì)胞培養(yǎng)液中腫瘤相關(guān)免疫因子IL‐4、PDGF和GM‐CSF的表達(dá)，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

2.5 阿魏酸抑制A549細(xì)胞JAK2/STAT6免疫信號通路激活2、4、8 mg/ml阿魏酸給藥處理A549細(xì)胞，48 h后觀察A549細(xì)胞JAK2和STAT6的磷酸化以及p53、COX‐2、Survivin和XIAP的表達(dá)變化。結(jié)果表明2、4、8 mg/ml阿魏酸均能抑制JAK2和STAT6的磷酸化，上調(diào)p53的mRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)COX‐2、Survivin和XIAP的mRNA和蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

肺癌已經(jīng)成為影響人類健康的主要腫瘤疾病之一［1］。因其惡性程度高，發(fā)病的隱匿性以及難治愈性，已經(jīng)成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和臨床迫切需要解決的問題［6］。免疫信號通路的激活是肺癌細(xì)胞抗凋亡和發(fā)生腫瘤逃逸的主要原因［7‐8］，因此針對免疫信號的研究為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的思路和策略。

順鉑和紫衫醇在非小細(xì)胞肺癌的藥物治療中運(yùn)用較成熟，但是其有較強(qiáng)的副作用，對患者術(shù)后恢復(fù)和生活造成嚴(yán)重影響［9］。阿魏酸來源于傘形科植物阿魏和川芎的根莖，具有抗血小板聚集、抑制血小板5‐羥色胺釋放、抑制血小板血栓素A2（TXA2）的生成、增強(qiáng)前列腺素活性、鎮(zhèn)痛、緩解血管痙攣等作用［10］。近些年有少量研究指出阿魏酸具有一定的抗腫瘤作用［11］，但沒有具體深入的機(jī)制研究，特別是涉及腫瘤免疫信號通路。因此本研究主要探討阿魏酸在體外對非小細(xì)胞肺癌增殖、遷移和侵襲的作用及其可能的作用機(jī)制。

腫瘤細(xì)胞的快速和無限增殖是腫瘤惡化的基礎(chǔ)，本研究首先觀察不同濃度阿魏酸對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿魏酸能夠有效抑制A549細(xì)胞體外增殖，并且呈劑量依賴性。為了進(jìn)一步觀察在其他實(shí)驗(yàn)中阿魏酸是否同樣呈現(xiàn)劑量依賴性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇2、4、8 mg/ml 3個濃度作為給藥濃度。遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)是模擬驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力，這為研究阿魏酸在體內(nèi)對非小肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移作用奠定體外研究基礎(chǔ)。有研究證明JAK2/STAT6在多種腫瘤逃逸過程中扮演重要角色，作為一條經(jīng)典的腫瘤免疫信號通路，JAK2/STAT6可以通過磷酸化激活下游COX‐2、Survivin和XIAP的表達(dá)，且抑制P53的表達(dá)［12］。本研究用不同濃度阿魏酸給藥處理A549細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)阿魏酸可以有效抑制JAK2/STAT6的磷酸化，同時觀察到下游的促癌基因COX‐2、Survivin和XIAP隨著阿魏酸濃度的增高而表達(dá)降低，P53表達(dá)則與之相反，說明阿魏酸可以有效抑制JAK2/STAT6腫瘤免疫信號通路的激活。

綜上所述，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均證實(shí)阿魏酸可以抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而這些抑制作用很可能是通過抑制腫瘤免疫信號通路JAK2/STAT6的激活來實(shí)現(xiàn)的。但是阿魏酸在體內(nèi)是否可以發(fā)揮同樣的作用，這是下一步的研究內(nèi)容。