羅斌 姚望 闕祖俊 于盼 羅添樂 田建輝

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤科，上海 200032）

癌癥是全球非傳染性疾病的第2大死亡疾病，其中肺癌死亡人數(shù)占據(jù)第1位［1］。美國肺癌年死亡約13.6萬，中國肺癌年死亡人數(shù)約63萬，其中約90%與轉(zhuǎn)移相關(guān)［2‐3］。因此，研發(fā)治療轉(zhuǎn)移的新藥具有重要的臨床價值。轉(zhuǎn)移前微環(huán)境（pre‐metastatic niche，PMN）是肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，揭示PMN形成的分子機(jī)制，將有助于闡明轉(zhuǎn)移發(fā)生的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的干預(yù)靶點［4］。免疫抑制是PMN的首要特征，研究證實髓源性抑制細(xì)胞（myeloid‐derived suppres-sor cells，MDSCs）介導(dǎo)的免疫抑制在PMN形成過程中發(fā)揮重要作用［5‐6］。MDSCs通過分泌精氨酸酶‐1（arginase1，Arg‐1）、吲哚胺2，3‐雙加氧酶（indole-amine 2，3‐dioxygenase，IDO）、活性氧簇（reactive ox-ygen species，ROS）等介導(dǎo)免疫抑制，誘導(dǎo)肺臟區(qū)域免疫紊亂。本課題組前期研究也證實MDSCs在非小細(xì)胞肺癌（non‐small cell lung cancer，NSCLC）患者的外周血中高表達(dá)，并與NSCLC的臨床分期相關(guān)，同時研究發(fā)現(xiàn)肺積方（生黃芪、北沙參、石見穿、重樓等）具有下調(diào)腫瘤微環(huán)境中IDO表達(dá)，改善局部免疫抑制的作用［7‐8］。為了深入探索MDSCs介導(dǎo)的區(qū)域免疫抑制在誘導(dǎo)PMN形成過程中的作用機(jī)制，以及中醫(yī)藥對PMN的調(diào)節(jié)作用，本實驗從MD-SCs介導(dǎo)的肺臟區(qū)域免疫紊亂促進(jìn)PMN形成的角度，揭示中藥重樓的有效單體重樓皂苷Ⅶ干預(yù)PMN形成的機(jī)制，以初步探索惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的局部“正虛”科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠2LL‐GFP/Luc細(xì)胞購自中國生命科學(xué)院上海細(xì)胞庫；5～6周齡的C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，在上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素‐鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司；重樓皂苷Ⅶ購自四川省維克奇生物科技有限公司（貨號：C11007228）；紫杉醇購自海口市制藥廠有限公司（國 藥 準(zhǔn) 字H10980170）；CD11b（APC）/Ly‐6G（FITC）/Ly‐6C（PE）流式抗體購自達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司；免疫組化抗體IDO/Arg‐1/ROS/S100A8/S100A9購自CST公司；免疫組化試劑盒購自福建邁新生物科技有限公司；全自動多色分析流式細(xì)胞儀系統(tǒng)（FACSVerse）及紅細(xì)胞裂解液購自美國BD公司；熒光倒置顯微鏡（DMI3000B）購自德國萊卡公司；小動物活體成像儀（LB983 NC320）購自德國Berthold Technologies GmbH&Co.KG公司。

1.2 方法

1.2.1 造模及干預(yù)方法將懸浮于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中的小鼠2LL‐GFP/Luc細(xì)胞放在37℃、濕度40%、5%CO2的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到對數(shù)期時，采用細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)，然后消化備用。將實驗用C57BL/6小鼠（體重20±2 g）按體重隨機(jī)分組的方法分為生理鹽水對照組（NS）、重樓皂苷Ⅶ組（PP7）、紫杉醇組（PTX）、重樓皂苷Ⅶ+紫杉醇聯(lián)合組（PP7+PTX），每組8只；在超凈臺中，在小鼠右側(cè)腋下（去毛備皮）注射準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液（2×105個/只），建立小鼠皮下移植瘤模型。完成建模后第1天，按照計算用量及組別，分別給予紫杉醇［15 mg/(kg·d)，每隔3 d給藥1次，腹腔注射］和重樓皂苷Ⅶ［10 mg/(kg·d)，給藥方式同紫杉醇］。

從造模第一天開始每3 d做1次小鼠活體成像實驗，檢測小鼠成瘤情況及肺臟轉(zhuǎn)移情況，并記錄皮下瘤長寬徑，待第18天采用麻醉后先采靜脈血，后頸椎脫臼法處死小鼠，取瘤體稱重并留取檢測樣本。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測方法取100μl靜脈血樣本置于標(biāo)記好的流式上樣管，加入5 μl的Fc阻斷劑，避光室溫孵育5 min；在上樣管中分別加入抗體CD11b（APC）/Ly‐6G（FITC）/Ly‐6C（PE）各5 μl，避光孵育15 min；每個上樣管中加入紅細(xì)胞裂解液3 ml，避光孵育6～8 min，至澄清時離心（1 500 r/min，5 min）；棄上清，重復(fù)上述離心步驟2次，棄上清，加入生理鹽水300μl，在混懸儀器上混勻，上機(jī)檢測。

1.2.3 免疫組化檢測方法將組織石蠟包埋切片；烤片：將切好的切片置于70℃烤箱內(nèi)烤片2 h；脫蠟水化：按照順序依次以二甲苯10 min×3次、無水乙醇10 min、95%乙醇10 min、85%乙醇10 min、75%乙醇10 min，后自來水沖洗5 min；抗原修復(fù)：配置EDTA抗原修復(fù)溶液5 ml，微波中火加熱至沸騰約需210 s，然后將病理切片緩慢放入沸騰的修復(fù)液內(nèi)，微波修復(fù)20 min，自然冷卻，PBS沖洗3 min×3；封閉內(nèi)源性過氧化物酶：滴加H2O2溶液（試劑A），室溫孵育10 min，PBS沖洗3 min×3；抗原封閉：滴加動物非免疫動物血清（試劑B），室溫下孵育10 min；結(jié)合抗體：除去多余血清，每張切片加抗體1滴（1∶200），4℃過夜，PBS沖洗3 min×3。滴加生物素標(biāo)記的第二抗體（試劑C），室溫孵育10 min，PBS沖洗3 min×3。滴加鏈霉素抗生物蛋白（試劑D），室溫孵育10 min，PBS沖洗3 min×3。配備DAB溶液2 ml（A 2 ml、B 2滴、C 2滴），每張切片加100 μl新鮮配制的DAB溶液，肉眼觀察直至變黃，約3～5 min。自來水沖洗2 min，蘇木素襯染3 min，自來水沖洗5 min，PBS返藍(lán)2 min。透明，烘干，中性樹膠封片，鏡下掃描讀片，并采用Image J軟件對掃描的結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用Graphpad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重樓皂苷Ⅶ抑制模型皮下腫瘤增殖采用活體成像技術(shù)檢測小鼠肺臟轉(zhuǎn)移灶形成情況（圖1），采用HE染色檢測留取的小鼠肺臟組織樣本，發(fā)現(xiàn)PP7組的1只小鼠肺臟出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)移灶（圖2E），同時，結(jié)果顯示瘤體積在對照組與PP7+PTX組之間具有顯著性差異（圖2C）。與對照組相比，瘤重在PP7組、PP7+PTX組之間具有顯著性差異，紫杉醇組無顯著性差異（圖2B），各組之間的小鼠體重之間無顯著性差異（圖2D）。

2.2 外周血MDSC的表達(dá)比例本實驗以流式細(xì)胞術(shù)檢測皮下瘤移植模型小鼠外周血中的MDSCs的比例，以CD11b、Ly‐6G、Ly‐6C為標(biāo)志，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組的外周血中M‐MDSCs與PMN‐MDSCs無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）。

2.3 肺臟微環(huán)境中MDSCs發(fā)揮免疫抑制因子檢測為了進(jìn)一步證實MDSCs發(fā)揮免疫抑制促進(jìn)局部免疫環(huán)境紊亂，檢測了MDSCs發(fā)揮免疫抑制作用的蛋白IDO、ROS、Arg‐1在肺臟組織的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，聯(lián)合組的Arg‐1表達(dá)水平明顯下調(diào)，而IDO的表達(dá)水平，各組均下調(diào)；與紫杉醇組比較，聯(lián)合組及PP7組未見明顯差異；ROS在各組之間無顯著性差異（圖4）。

圖1 造模后第12天的小鼠活體成像檢測Fig.1 In vivo imaging of mice on the 12th day after mod-eling

2.4 MDSCs誘導(dǎo)肺臟局部免疫紊亂促進(jìn)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成采用免疫組化檢測了肺臟中S100A8/S1000A9蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，紫杉醇、PP7及聯(lián)合組均可以下調(diào)S100A8的表達(dá)，而各組之間S100A9表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5）。

圖2 重樓皂苷Ⅶ抑制皮下腫瘤增殖Fig.2 PolyphyllinⅦinhibits subcutaneous tumor prolif-eration

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組模型外周血中MDSC不同亞群的比例Fig.3 Flow cytometry was used to detect the proportion of MDSC subgroups in peripheral blood of each group

圖4 各組小鼠肺臟中MDSCs分泌的免疫抑制蛋白表達(dá)水平Fig.4 Expressions level of immunosuppressive protein se-creted by MDSCs in lung of each group

圖5 肺臟組織S100A8/S1000A9表達(dá)與PMN形成Fig.5 Expressions of S100A8/9 and PMN formation in lung tissue

3 討論

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤患者死亡的主要原因，有研究顯示NSCLC轉(zhuǎn)移的主要部位發(fā)生率是大腦（12%～47%）、骨（16%～39%）、肝臟（7%～22%）、肺內(nèi)（對側(cè)或同側(cè)肺葉，11%～26%）、胸膜（10%～13%）、胸腔淋巴結(jié)（29%）和腎上腺（6%～15%）［8］。而轉(zhuǎn)移發(fā)生的主要步驟是原發(fā)灶的免疫逃逸、外周循環(huán)生存、靶器官的定植與增殖，針對原發(fā)灶的腫瘤微環(huán)境，目前免疫治療制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用，而外周血中主要是循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTC），但是由于外周血成分復(fù)雜而且CTC缺乏明確的生物學(xué)標(biāo)記，因此靶向外周的治療手段存在較大的技術(shù)瓶頸［9‐10］。所以，阻止轉(zhuǎn)移靶器官環(huán)境形成是預(yù)防轉(zhuǎn)移發(fā)生的一個重要策略，本研究發(fā)現(xiàn)重樓的有效單體重樓皂苷Ⅶ通過下調(diào)皮下移植瘤模型肺臟S100A8表達(dá)抑制PMN形成預(yù)防肺轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能是干預(yù)MDSCs的免疫抑制作用，初步揭示了扶正中藥預(yù)防肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制，為中醫(yī)藥臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

PMN的形成是肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的必要環(huán)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)PMN的主要特征是免疫抑制［11］。在PMN形成過程中，腫瘤原發(fā)灶分泌的外泌體（含蛋白、RNA、DNA等）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、免疫細(xì)胞因子、血管內(nèi)皮生長因子、MDSCs等均發(fā)揮了重要作用［5，12‐14］。而MD-SCs作為PMN形成過程中的重要因素近年來備受學(xué)者關(guān)注［15］。MDSCs是一群具有免疫抑制作用的骨髓來源異常分化細(xì)胞，主要分為2個亞群：單核系MDSC（M‐MDSCs）和 多 核 系MDSCs（PMN‐MD-SCs）［16］。研究發(fā)現(xiàn)臨床中肺癌患者外周血中的MD-SCs表達(dá)比例與其臨床分期具有密切相關(guān)性［6］。而Lewis肺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清具有激活MDSCs糖酵解途徑，促進(jìn)其抑制T細(xì)胞的功能，MDSCs以IDO、ROS、Arg‐1、S100A8/9等 多 途徑 介導(dǎo) 機(jī) 體免 疫紊亂 是PMN形成 的重 要因 素［17，11］。肺 臟 組織 中S100A8/S1000A9/MMP9/Fn/Bv8的表達(dá)變化是PMN形成的重要指標(biāo)［11，18］。而S100A8/S1000A9是MDSC分泌的免疫炎性蛋白，是促進(jìn)肺臟局部免疫紊亂的重要因素［19‐20］。本研究發(fā)現(xiàn)外周循環(huán)MDSCs的不同亞群比例在各組之間無差異，但肺臟中MDSCs發(fā)揮免疫抑制作用的IDO、Arg‐1在對照組與各組之間存在差異，其原因可能是干預(yù)手段對外周循環(huán)的MDSCs無顯著影響，但是對肺臟MDSCs的招募及免疫抑制功能的活化可能發(fā)揮作用。另外，有研究發(fā)現(xiàn)S100A8/9在調(diào)節(jié)髓系細(xì)胞免疫功能方面發(fā)揮重要作用［21］。而LIU等［22］亦發(fā)現(xiàn)在肺癌PMN形成過程中S100A8/9、MMP9等過表達(dá)。呂彥天等［23］發(fā)現(xiàn)S100A8蛋白在NSCLC組織中明顯高于癌旁組織，隨病理分期增高及腫瘤分化程度降低，S100A8蛋白表達(dá)陽性率增高，而且研究證實MDSCs分泌S100A8/9發(fā)揮免疫抑制作用，同時S100A8高表達(dá)對MDSCs局部累積有募集作用［6，24］。因此S100A8在腫瘤模型的肺臟組織中高表達(dá)可能促進(jìn)MDSCs的招募并活化MDSCs的免疫抑制作用，促進(jìn)有利于CTC定植的肺臟PMN形成，形成臨床微轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅶ具有下調(diào)S100A8作用，故初步揭示了中醫(yī)藥干預(yù)PMN形成預(yù)防轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制是下調(diào)肺臟S100A8水平，但是具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。有研究發(fā)現(xiàn)S100A8可激活MAPK途徑和NF‐κB信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［6］。因此課題組未來將從抑制PMN形成與腫瘤細(xì)胞增殖角度出發(fā)，深入研究中醫(yī)藥干預(yù)S100A8表達(dá)預(yù)防轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤治療失敗的主要原因，而目前尚無具有明確療效的針對轉(zhuǎn)移預(yù)防的藥物，其原因主要是以下3點：一是轉(zhuǎn)移具體機(jī)制尚未闡明，缺乏成熟的理論指導(dǎo)；二是目前腫瘤轉(zhuǎn)移防治藥物的開發(fā)多以原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞為基礎(chǔ)，而建立有效的具有轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞系可能是重要方向；三是對轉(zhuǎn)移發(fā)生靶器官的認(rèn)識不足，尤其是腫瘤細(xì)胞是如何選擇生存的靶器官。在“扶正治癌”學(xué)術(shù)思想指導(dǎo)下，田建輝結(jié)合中醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科交叉的國內(nèi)外研究進(jìn)展，提出肺癌轉(zhuǎn)移的“正虛伏毒”核心病機(jī)，認(rèn)為“伏毒”是以CTC、腫瘤干細(xì)胞、休眠腫瘤細(xì)胞等為代表的潛伏因素，而“正虛”則是以免疫衰老、免疫逃逸、神經(jīng)‐內(nèi)分泌‐免疫紊亂等為代表［24‐25］。課題組已率先建立了人肺腺癌CTC系（CTC‐TJH‐01），構(gòu)建了轉(zhuǎn)移研究的藥物篩選平臺，基于CTC‐TJH‐01建立的轉(zhuǎn)移研究平臺，課題組初步揭示了扶正中藥的防治轉(zhuǎn)移的機(jī)制［26］。PMN的形成是臟腑局部免疫抑制導(dǎo)致的“正氣虧虛”，既往研究顯示重樓皂苷Ⅶ主要是抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡等［27］。本研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅶ能抑制PMN形成，提示其可能具有“扶正”的作用，這初步證實中藥多組分、多途徑、多靶點作用機(jī)制在臨床中的不同價值，將為未來篩選轉(zhuǎn)移防治藥物提供新思路。

PMN作為CTC進(jìn)入靶器官定植的關(guān)鍵條件，為其生存、增殖提供了有利環(huán)境。肺癌術(shù)后患者在臨床中缺乏明確的癥狀或體征，尤其是早期患者（Ⅰa期）西醫(yī)認(rèn)為屬于治愈，術(shù)后不需要任何的干預(yù)，僅定期隨訪即可。PMN的形成是靶器官局部的微觀變化，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)缺乏有效手段以直接觀察，因此易被忽視。中醫(yī)古籍《黃帝內(nèi)經(jīng)》曰“邪之所湊，其氣必虛”，因此術(shù)后靶器官的PMN形成可能是臟腑局部“正虛”的表現(xiàn)，局部的“正氣虧虛”形成適宜“伏毒（循環(huán)腫瘤細(xì)胞等）”生存的環(huán)境，隨著正氣的進(jìn)一步虧耗，最終形成微轉(zhuǎn)移。中醫(yī)學(xué)歷來重視“治未病”的思想，而干預(yù)PMN形成阻止CTC的定植，可能是扶正中藥預(yù)防惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵途徑，本研究對中藥單體在抑制PMN形成的作用進(jìn)行了探索，這可能為未來研究中醫(yī)藥預(yù)防轉(zhuǎn)移的臨床應(yīng)用提供新的策略。