李佳威 曲超陳一方 鄭金娟 肖瑤 黃學(xué)洙 金丹 李芳芳

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室，延吉 133002）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全世界范圍內(nèi)癌癥死亡的關(guān)鍵原因之一［1］。由于飲食習(xí)慣的改變、經(jīng)濟(jì)發(fā)展的進(jìn)步及生活質(zhì)量的提高，CRC的發(fā)病率逐年上升。結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌（colitis‐as-sociated colorectal cancer，CAC）通常在患有長期腸道炎癥的患者如炎癥性腸?。╥nflammatory bowel dis-ease，IBD）患者中發(fā)展，且其腫瘤可能在體內(nèi)其他部位形成。CAC是IBD的主要并發(fā)癥，其發(fā)病率和死亡率呈逐年遞增趨勢［2］。目前關(guān)于慢性炎癥性疾病和癌癥之間的關(guān)聯(lián)（包括有關(guān)IBD演變?yōu)镃AC的各種理論）尚不明確。

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）是一種名貴的藥用真菌，具有多種活性物質(zhì)，包括樺褐孔菌多糖、樺褐孔菌醇、超氧化物歧化酵素、氧化三萜類以及樺褐孔菌素和葉酸衍生物等多種化合物［3‐5］。其中以樺褐孔菌中多糖（Inonotus obliquuspolysaccharide，IOP）的研究最為深入。據(jù)報(bào)道，IOP在多種癌癥中發(fā)揮抗腫瘤作用，且具有多層次、多靶點(diǎn)等作用［6‐8］。還有研究表明，IOP可通過NF‐κB或NLRP3信號(hào)通路預(yù)防腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如肝癌，黑色素瘤等，但對(duì)于CRC的研究較為少見［9‐10］。課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，IOP對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有抑制作用，但對(duì)于CAC的作用尚不明確［11］。基于以上研究，課題組提 出IOP通過 影響NF‐κB和NLRP3通 路 干 預(yù)CAC的發(fā)生發(fā)展的可能性。因此，本研究通過SW620細(xì)胞株及建立AOM/DSS誘導(dǎo)的CAC小鼠模型，初步研究IOP在CAC中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。6～8周齡BALB/c雄性小鼠購自億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度：（22±2）℃，濕度：40%～60%。本實(shí)驗(yàn)符合延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 主要試劑樺褐孔菌由本校藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室鑒定，IOP由延邊大學(xué)免疫生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提取；氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）購自Sigma公司；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）購自MP公司；DMEM培養(yǎng)基購自BI公司；TRIzol購自Invitrogen公司；M‐MLV，Oligo（dt）購自Promega公 司；rTaq購 自TaKaRa公 司；ASC、NF‐κBp65、Cleaved Caspase‐3、β‐actin抗體購自CST公司；NL-RP3、Caspase‐1、Bax、Bcl‐2抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將SW620細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.2 小 鼠CAC模 型 的 建 立6～8周 齡 雄 性BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組（AOM/DSS）和IOP組（150 mg/kg·d）。模型組和IOP組腹腔內(nèi)單次注射10 mg/kg AOM，1周后，將含2.5%DSS（w/v）的飲用水給小鼠飲用1周，隨后換成新鮮飲用水飲用2周，以每給予1周DSS和2周新鮮飲用水為1個(gè)周期，重復(fù)循環(huán)4次。IOP組隔天灌胃給予IOP溶液。在第101天建模結(jié)束后處死全部小鼠，并收集小鼠結(jié)腸及血液。

1.2.3 小鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)檢測 取小鼠結(jié)腸組織固定于4%甲醛溶液，并制成厚度為4μm的石蠟切片，HE染色觀察小鼠結(jié)腸組織病理變化。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Pathological scoring standard

1.2.4 CCK‐8法檢測細(xì)胞增殖細(xì)胞1×104個(gè)/孔接種于96孔板，加入不同濃度的IOP（0、50、100、150μg/ml）培養(yǎng)48 h，以10μl/孔加入CCK‐8溶液，孵育2 h后檢測細(xì)胞增殖。

1.2.5 RT‐PCR檢測基因表達(dá)以TRIzol法提取組織和細(xì)胞中的總RNA，取1 μl樣品檢測RNA質(zhì)量，OD260/OD280在1.8～2.0之間可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用M‐MLV及Oligo（dt）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。最后以rTaq及相關(guān)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為95℃6 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，72℃5 min。人源引物序列：NLRP3 F：5'‐TGGCTGTAA-CATTCGGAGATTG‐3'，R：5'‐GAAGTCACCGAGGGC-GTTGT‐3'；Caspase‐1 F：5'‐GGAAACAAAAGTCG-GCAGAG‐3'，R：5'‐ACGCTGTACCCCAGATTTTG‐3'；ASC F：5'‐GGTCACAAACGTTGAGTGGC‐3'，R：5'‐AGAGCTTCCGCATCTTGCTT‐3'；GAPDH F：5'‐CCA-CATCGCTCAGACACCAT‐3'，R：5'‐GCAACAATATAC-CACTTTACCA‐3'，鼠 源 引 物 序 列：NLRP3 F：5'‐GAGTTCTTCGCTGCTATGT‐3'，R：5'‐ACCTTCACGT‐CTCGGTTC‐3'，Caspase‐1 F：5'‐TATCCAGGAGG‐GAATATGTG‐3'；R：5'‐ACAACACCACTCCTTGTTTC‐3'；ASC F：5'‐ACACTTTGTGGACCAGCACA‐3'，R：5'‐CACGAACTGCCTGGTACTGT‐3'；IL‐6 F：5'‐ACATT-GTGGACCAGCACA‐3'，R：5'‐CACGAACTGCCGTAC‐TGT‐3'；TNF‐α F：5'‐GGCAGGTCTCTTTGGAGTCTG‐3'，R：5'‐ACATTCGAGGCTCCAGTCATCG‐3'；β‐actin F：5'‐TCTGGTCGTACCACAGGCAT‐3'，R：5'‐CGCTC-GTTGCCAATAGTGAT‐3'。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)裂解細(xì)胞和結(jié)腸組織，提取相關(guān)蛋白，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)在8%～15%SDS‐PAGE凝膠上分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將印跡與一抗孵育24 h，洗滌印跡，加入標(biāo)記有HRP的山羊抗兔或抗鼠IgG孵育1 h，再次洗滌，加入ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影并成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Graph Pad Prism 7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ⅠOP可抑制SW620細(xì)胞增殖如表2所示，IOP可有效抑制SW620細(xì)胞增殖（P＜0.05），且表現(xiàn)出劑量依賴性。因此，選擇0、50、100、150 μg/ml 4個(gè)劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 ⅠOP誘導(dǎo)SW620細(xì)胞凋亡如圖1所示，IOP可顯著增加Bax和Cleaved Caspase‐3表達(dá)，降低Bcl‐2表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。以上結(jié)果提示，IOP可誘導(dǎo)SW620細(xì)胞凋亡。

2.3 ⅠOP增加SW620細(xì)胞中NF‐κBp65磷酸化及NLRP3炎癥小體的水平如圖2所示，IOP可上調(diào)NLRP3炎癥小體達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞中p‐p65表達(dá)。以上結(jié)果提示，IOP可通過激活NF‐κB和NLRP3炎癥小體表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤能力。

2.4 ⅠOP改善AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠CAC與模型組相比，IOP組小鼠體型明顯增大，背部毛發(fā)較光澤，豎毛現(xiàn)象明顯減少，且IOP組的小鼠體重明顯上調(diào)（表3）。此外，在整個(gè)建立模型的過程中，模型組小鼠生存率為41.67%，IOP組為66.67%，正常組無死亡情況。HE染色結(jié)果表明，與模型組比，IOP組小鼠出現(xiàn)較少的腫瘤性腺體及炎癥細(xì)胞浸潤，部分隱窩結(jié)構(gòu)丟失，存在部分杯狀細(xì)胞（圖3）。以上結(jié)果提示，IOP可明顯緩解AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠CAC。

2.5 ⅠOP可緩解小鼠的結(jié)腸長度和結(jié)腸內(nèi)腫瘤情況IOP治療后觀察各組小鼠結(jié)腸及腫瘤變化。與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸長度明顯降低；與模型組相比，IOP組呈增加趨勢（表4，P＜0.05）。此外，如表5所示，IOP可明顯下調(diào)結(jié)腸內(nèi)腫瘤情況（腫瘤數(shù)量、腫瘤大小、腫瘤負(fù)荷）。以上結(jié)果提示，IOP可抑制CAC小鼠腫瘤的發(fā)生。

表2 SW620細(xì)胞增殖能力的比較(±s)Tab.2 Comparison of SW620 cell proliferation ability(±s)

表2 SW620細(xì)胞增殖能力的比較(±s)Tab.2 Comparison of SW620 cell proliferation ability(±s)

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with IOP low dose group，2）P＜0.05；compared with IOP middle dose group，3）P＜0.05.

Incubation time（48 h）100.00±3.18 87.50±9.561）77.92±8.831）69.66±2.951）2）3）Groups Control IOP low dose IOP middle dose IOP high dose Concentration（μg/ml）0 50 100 150

圖1 IOP誘導(dǎo)SW620細(xì)胞凋亡Fig.1 IOP induced SW620 cell apoptosis

圖2 IOP增加SW620細(xì)胞中NF‐κBp65磷酸化及NLRP3炎癥小體水平Fig.2 IOP increased levels of NF‐κBp65 phosphorylation and NLRP3 inflammasome in SW620 cells

2.6 ⅠOP可下調(diào)結(jié)腸組織中ⅠL‐6和TNF‐α表達(dá)如圖4所示，經(jīng)IOP處理后，IL‐6和TNF‐α的基因和蛋白表達(dá)降低（P＜0.05或P＜0.01）。提示IOP可抑制CAC小鼠中炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。

2.7 ⅠOP可上調(diào)結(jié)腸組織中NF‐κBp65磷酸化及ASC、Caspase‐1及NLRP3表達(dá)與正常組相比，模型組中ASC、Caspase‐1、NLRP3的基因和蛋白水平均升高，經(jīng)IOP處理后，三者表達(dá)被進(jìn)一步升高。此外，IOP可明顯增加p‐p65蛋白表達(dá)。以上結(jié)果提示，IOP可通過激活NF‐κB信號(hào)途徑進(jìn)一步激活NL-RP3炎癥小體，從而預(yù)防CAC的發(fā)生發(fā)展（圖5，P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組小鼠體重比較(±s)Tab.3 Comparison of body weight of mice in each group(±s)

表3 各組小鼠體重比較(±s)Tab.3 Comparison of body weight of mice in each group(±s)

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

Groups Concentration（mg/kg）Number of animals（Start）Number of animals（End）Mice body weight（g）38.06±4.94 25.98±2.311）27.52±2.462）Control Model IOP 0 -5 150 12 12 5 5 8

表4 各組小鼠結(jié)腸長度的比較(±s)Tab.4 Comparison of colon length of mice in each group(±s)

表4 各組小鼠結(jié)腸長度的比較(±s)Tab.4 Comparison of colon length of mice in each group(±s)

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

Colon length（cm）9.867±0.57 7.600±0.351）8.400±0.352）Groups Concentration（mg/kg）Number of animals Control Model IOP 0 -150 5 5 8

圖4 IOP可下調(diào)結(jié)腸組織中IL‐6和TNF‐α表達(dá)Fig.4 IOP down‐regulated expression of IL‐6 and TNF‐α in colon tissues

圖5 IOP可上調(diào)結(jié)腸組織中NF‐κBp65磷酸化及ASC、Caspase‐1及NLRP3表達(dá)Fig.5 IOP up‐regulated phosphorylation of NF‐κBp65 and expression of ASC，Caspase‐1，NLRP3 in co-lon tissues

表5 各組小鼠結(jié)腸腺瘤的比較(±s)Tab.5 Comparison of mouse colonic adenomas in each group(±s)

表5 各組小鼠結(jié)腸腺瘤的比較(±s)Tab.5 Comparison of mouse colonic adenomas in each group(±s)

Note：Compared with model group，1）P＜0.05.

Tumor volume（mm3）59.09±8.27 24.99±6.481）Groups Model IOP Concentration（mg/kg）-150 Number of animals 5 8 Tumor number 24.5±3.32 14.0±3.091）Tumor load（mm）3.48±0.68 1.50±0.461）

3 討論

慢性炎癥引發(fā)癌變的過程十分復(fù)雜。在伴有IBD的CAC病例中，疾病的嚴(yán)重程度、病程和炎癥程度均與腫瘤的發(fā)展有關(guān)［12］。因此，IBD的有效治療在預(yù)防CAC的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。目前，IBD已廣泛使用5‐氨基水楊酸、皮質(zhì)類固醇、胍基嘌呤和TNF‐α阻滯劑治療［13‐14］。但這些藥物與CAC的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系尚不明確。因此，迫切需要用于CAC的新型安全有效的藥物。

細(xì)胞無限增殖是腫瘤細(xì)胞最顯著的特點(diǎn)。大量文獻(xiàn)表明，中藥對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖起到抑制作用。如姜黃素可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移、人參皂苷CK可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長［15‐16］。也有研究表明，IOP可抑制肺癌細(xì)胞的活力和集落形成能力［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，IOP可有效抑制SW620細(xì)胞增殖，且隨著濃度的增加，抑制作用明顯提高。此外，IOP還可改善AOM/DSS誘導(dǎo)的CAC小鼠結(jié)腸腫瘤的損害。說明IOP可通過抑制細(xì)胞增殖和結(jié)腸腫瘤的生長減輕CAC發(fā)展。

Bcl‐2家族的蛋白質(zhì)是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控基因，包括抗凋亡蛋白Bcl‐2和促凋亡蛋白Bax。Bcl‐2在多種腫瘤組織中表達(dá)，可通過增加線粒體膜電位并抑制線粒體鈣離子釋放啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞凋亡。Bax是受Bcl‐2調(diào)節(jié)的促凋亡蛋白，可誘導(dǎo)線粒體通透性發(fā)生變化、激活凋亡相關(guān)蛋白并釋放細(xì)胞色素［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，SW620細(xì)胞經(jīng)IOP處理后，凋亡蛋白Bcl‐2表達(dá)水平顯著降低，而Bax、Cleaved Cas-pase‐3蛋白表達(dá)明顯升高，說明IOP誘導(dǎo)SW620細(xì)胞發(fā)生凋亡。

NLRP3是炎癥小體NLRP家族主要的成員之一，當(dāng)受到胞外刺激時(shí)，可使PYD結(jié)構(gòu)域與ASC相結(jié)合并募集pro‐Caspase‐1，NLRP3炎癥小體形成后，加速pro‐Caspase‐1剪切為活化的Caspase‐1，進(jìn)而將IL‐1β、IL‐18前 體 切 割 為IL‐1β、IL‐18釋 放 到 體外［19］。NLRP3在炎癥反應(yīng)中起重要作用，NLRP3炎癥小體的激活與炎癥誘導(dǎo)的癌癥有關(guān)。然而，NL-RP3炎癥小體在IBD和CAC中的作用存在爭議。CHEN等［20］研究證明炎癥小體活性可通過調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)和抗微生物免疫促進(jìn)炎癥性疾病和CAC發(fā)生。BAUER等［21］也指出NLRP3的激活顯著提高IBD風(fēng)險(xiǎn)。然而，與之形成鮮明對(duì)比的是，其他研究表明NLRP3炎癥小體對(duì)結(jié)腸炎具有保護(hù)作用［22］。AL-LEN等［23］指出，在AOM/DSS處理的NLRP3、Cas-pase‐1和ASC缺失小鼠中，結(jié)腸腫瘤的大小大于同樣處理的野生型小鼠。ZAKI等［22］發(fā)現(xiàn)NLRP3的激活抑制AOM/DSS誘導(dǎo)的CAC，支持了NLRP3炎癥小體在阻止CAC發(fā)生方面的作用。與這些發(fā)現(xiàn)一致，本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)IOP處理可明顯增加SW620細(xì)胞裂解液和小鼠結(jié)腸組織中NLRP3炎癥小體表達(dá)。說明IOP通過激活NLRP3炎癥小體保護(hù)小鼠免受AOM/DSS誘導(dǎo)的CAC的侵害。

NF‐κB是細(xì)胞中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞生存等多種生命過程［24］。NF‐κB復(fù)合物作為p50和p65亞基的二聚體存在于細(xì)胞質(zhì)，p65亞基的磷酸化增強(qiáng)NF‐κB的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而調(diào)控炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)［25］。NF‐κB是炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的主要調(diào)控因子，其對(duì)NLRP3炎癥小體的激活也很重要。既往研究表明NLRP3炎癥小體的激活受NF‐κB調(diào)控［26］。有研究表明，NLRP3表達(dá)增強(qiáng)可通過激活NF‐κB實(shí)現(xiàn)，表明NF‐κB與NLRP3炎癥小體表達(dá)呈正相關(guān)［27］。本研究發(fā)現(xiàn)IOP可增加p‐p65表達(dá)，說明IOP可激活CAC中NF‐κB信號(hào)通路表達(dá)。

IL‐6是一種多向性炎癥細(xì)胞因子，不僅在免疫和炎癥反應(yīng)中起重要作用，而且是惡性腫瘤的重要生長因子。TNF‐α是TNF/TNFR細(xì)胞因子超家族的成員，參與促進(jìn)和發(fā)展實(shí)驗(yàn)性腫瘤和人類癌癥高源。等［28］發(fā)現(xiàn)，IL‐6可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，經(jīng)漢黃芩素處理后可進(jìn)一步抑制IL‐6誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)IOP可減少IL‐6和TNF‐α產(chǎn)生。也就是說，即在基因水平上p‐p65作為轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄的IL‐6和TNF‐α表達(dá)降低，說明IOP可能對(duì)p‐p65引起的IL‐6轉(zhuǎn)錄具有抑制作用。以上研究結(jié)果僅是對(duì)IOP抑制細(xì)胞因子（IL‐6和TNF‐α）表達(dá)的初步研究，其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，IOP改善AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠CAC，其主要機(jī)制可能是通過激活NF‐κB和NLRP3信號(hào)通路和調(diào)控細(xì)胞因子的表達(dá)抑制CAC的發(fā)生。IOP發(fā)揮出較強(qiáng)的抗腫瘤作用，為中藥在治療腫瘤方面奠定理論基礎(chǔ)。