趙博 彭建軍 李廣平 任利輝（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100038）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一種嚴(yán)重的心臟疾病，分為ST抬高和非ST抬高M(jìn)I，但兩者治療方法相似［1］。老年AMI患者的相對(duì)比例不斷提高，給社會(huì)帶來沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2‐3］。由于老年AMI患者的特殊性和復(fù)雜性，尚無有效治療手段實(shí)現(xiàn)心臟康復(fù)［4］。心室重構(gòu)與AMI并發(fā)癥密切相關(guān)，是導(dǎo)致AMI患者預(yù)后不良的重要原因，因此尋找新的方案抑制心室重構(gòu)可能有助于AMI治療［5］。燈盞花素是從中草藥中分離得到的類黃酮糖苷混合物，可通過抑制炎癥反應(yīng)或抗氧化應(yīng)激發(fā)揮心肌保護(hù)作用［6］。臨床研究顯示，給予AMI患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后燈盞花素治療有助于改善其心肌功能［7］。此外，MI后，活化的轉(zhuǎn)化生長因子‐β1（transforming growth factor‐β1，TGF‐β1）可依賴Smads信號(hào)通路參與心室重構(gòu)［8］。本研究通過構(gòu)建AMI大鼠模型，初步研究燈盞花素對(duì)AMI的作用機(jī)理，以期為AMI治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)、雌性SD大鼠，8周齡，體重（220±10）g，購自上海劍鈍生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2019‐0027。實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵守3R保護(hù)原則。

1.1.2 藥品與試劑燈盞花素片購自廣東彼迪藥業(yè)有限公司；TGF‐β1通路激活劑（SRI‐011381 hy-drochloride）購自北京百奧萊博科技有限公司；阿司匹林腸溶片購自沈陽奧吉娜藥業(yè)有限公司；Masson三色染色（G1340）和HE染色（G1120）染色試劑盒購自北京Solarbio公司；TGF‐β1（ab215715）、Smad2（ab40855）、p‐Smad2（ab188334）、Smad3（ab40854）兔抗大鼠單抗、p‐Smad3（ab51177）、β‐actin（ab8227）兔抗大鼠多抗、山羊抗兔lgG（H+L）二抗（ab6721）購自Abcam公司。

1.1.3 主要儀器M50倒置熒光顯微鏡購自上海萬衡精密儀器有限公司；EVOS M5000細(xì)胞成像系統(tǒng)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；EK‐1000B型多普勒彩超儀購自江蘇億康電子科技有限公司；BioPac生理儀購自美國BIOPAC公司。

1.2 方法

1.2.1 建模參考文獻(xiàn)［9］建立AMI大鼠模型：采用1%戊巴比安腹腔麻醉大鼠，氣管插管接呼吸機(jī)（55次/min，潮氣量3 ml/100 g）和心電圖，對(duì)大鼠左側(cè)備皮消毒后，剪開左側(cè)4肋間皮膚，鈍性開胸以暴露心臟，于前肢下2 mm左右結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，觀察到左心室前壁心肌顏色變化和心電圖ST段弓背抬高0.3 mV以上后，迅速將心臟放回胸腔，縫合手術(shù)切口，每天腹腔注射青霉素，若大鼠術(shù)后24 h存活，則建模成功。

1.2.2 分組及處理大鼠開胸暴露心臟但不結(jié)扎作為假手術(shù)組（n=11）。AMI造模成功的大鼠分為5組：模型組（n=10）、燈盞花素Ⅰ組（n=11）、燈盞花素Ⅱ組（n=11）、TGF‐β1激活劑組（n=11）和陽性對(duì)照組（n=10）。假手術(shù)組和模型組每天灌胃給予等量生理鹽水，燈盞花素Ⅰ組、燈盞花素ⅠⅠ組、TGF‐β1激活劑組、陽性對(duì)照組每天分別灌胃給予50、200 mg/kg燈盞花素、10 mg/kg TGF‐β1激活劑+200 mg/kg燈盞花素、100 mg/kg阿司匹林腸溶片，建模成功次日開始給藥，1次/d，連續(xù)4周［10］。

1.2.3 心臟超聲檢測(cè)末次給藥4 h麻醉大鼠，固定大鼠四肢，采用多普勒心臟彩超檢測(cè)大鼠心臟左室以下指標(biāo)：舒張末徑（end‐diastolic dimension，EDd）、收縮末徑（end‐systolic dimension，ESd）、射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）、短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S），每組數(shù)據(jù)測(cè)量3次以上，取平均值［9］。

1.2.4 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)分離大鼠頸總動(dòng)脈，插入導(dǎo)管至左心室，采用生理檢測(cè)系統(tǒng)記錄左室壓上升最大速率（+dp/dtmax）和左室壓下降最大速率（-dp/dtmax），每組數(shù)據(jù)測(cè)量3次以上，取平均值。

1.2.5 HE染色頸椎脫臼處死大鼠，取出心臟，清洗后分離得左心室，分為2份，一份采用4%多聚甲醛固定，脫水、包埋后制成石蠟切塊；一份保存于-80℃液氮中備用。將保存的石蠟切塊制成4 μm左右切片，脫蠟、脫水，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行HE染色，封片，顯微鏡下觀察。

1.2.6 Masson測(cè)定實(shí)驗(yàn)取1.2.5石蠟切片，根據(jù)Masson染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，隨機(jī)選取5個(gè)視野，顯微鏡下觀察心肌組織纖維化程度。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)RIPA裂解液裂解各組大鼠心肌組織勻漿上清，BCA試劑盒定量總蛋白。取20 μg蛋白樣品，5% SDS‐PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%牛血清蛋白封膜，依次加入TGF‐β1、Smads2、Smads3、p‐Smads2、p‐Smads3、Smads7和β‐actin一抗（1∶1 000），4℃孵育12 h，TBST洗3次，10 min/次，加入二抗（1∶5 000），25℃孵育40 min，曝光顯影，Image J定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠超聲檢查結(jié)果與假手術(shù)組相比，模型組大鼠左心室EDd和ESd值顯著升高（P＜0.05），EF和FS值顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，燈盞花素Ⅰ組、燈盞花素Ⅱ組和陽性對(duì)照組大鼠左心室EDd和ESd值顯著降低（P＜0.05），EF和FS值顯著升高（P＜0.05）；與燈盞花素II組相比，TGF‐β1激活劑組大鼠左心室EDd和ESd值顯著升高（P＜0.05），EF和FS值顯著降低（P＜0.05），見表1。

2.2 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)與假手術(shù)組相比，模型組大鼠左心室+dp/dtmax和-dp/dtmax值顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，燈盞花素Ⅰ組、燈盞花素Ⅱ組和陽性對(duì)照組大鼠左心室+dp/dtmax和-dp/dtmax值顯著升高（P＜0.05）；與燈盞花素Ⅱ組相比，TGF‐β1激活劑組大鼠左心室+dp/dtmax和-dp/dtmax值顯著降低（P＜0.05），見表2。

2.3 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化假手術(shù)組大鼠心肌組織形態(tài)正常，心肌細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞空隙較?。荒Ｐ徒M大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙顯著擴(kuò)大；燈盞花素Ⅰ組、Ⅱ組和陽性對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列略不規(guī)則，細(xì)胞間隙明顯比模型組縮?。慌c燈盞花素Ⅱ組相比，TGF‐β1激活劑組大鼠心肌細(xì)胞排列更加不規(guī)則，細(xì)胞間隙變大，見圖1。

2.4 各組大鼠心肌纖維化情況假手術(shù)組大鼠幾乎無藍(lán)色膠原沉積變化；模型組大鼠可見明顯間質(zhì)膠原沉積；與模型組相比，燈盞花素Ⅰ組、Ⅱ組和陽性對(duì)照組大鼠心肌組織膠原密度明顯降低，膠原沉積得到顯著改善；與燈盞花素Ⅱ組相比，TGF‐β1激活劑組大鼠膠原沉積增多。

2.5 各組大鼠心肌組織TGF‐β1和Smads蛋白表達(dá)與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌組織TGF‐β 1、Smads2和Smads3蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Smads7蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，燈盞花素Ⅰ組、燈盞花素Ⅱ組和陽性對(duì)照組大鼠心肌組織TGF‐β1、Smads2和Smads3蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），Smads7蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與燈盞花素Ⅱ組相比，TGF‐β1激活劑組大鼠心肌組織中TGF‐β1、Smads2和Smads3蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Smads7蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖3。

表1 各組大鼠心臟超聲檢查結(jié)果比較（±s）Tab.1 Comparison of results of echocardiography in rats in each group（±s）

表1 各組大鼠心臟超聲檢查結(jié)果比較（±s）Tab.1 Comparison of results of echocardiography in rats in each group（±s）

Note：Compared with Sham group，1）P＜0.05；compared with Model group，2）P＜0.05；compared with Breviscapine I group，3）P＜0.05；compared with Breviscapin II group，4）P＜0.05.

圖1 HE染色觀察各組MI大鼠心肌組織病理學(xué)變化（×200）Fig.1 Histopathological changes of myocardium in ratswith MI in each group by HE staining（×200）

圖2 Masson染色觀察各組MI大鼠心肌纖維化變化（×200）Fig.2 Changes of myocardial fibrosis in rats with MI in each group by Masson staining（×200）

表2 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（±s，mmHg/ms）Tab.2 Comparison of hemodynamic indexes of rats in each group（±s，mmHg/ms）

表2 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（±s，mmHg/ms）Tab.2 Comparison of hemodynamic indexes of rats in each group（±s，mmHg/ms）

Note：Compared with Sham group，1）P＜0.05；compared with Model group，2）P＜0.05；compared with Breviscapine I group，3）P＜0.05；compared with Breviscapin II group，4）P＜0.05.

圖3 各 組 大 鼠 心 肌 組 織TGF‐β1、Smads2、Smads3和Smads7蛋白表達(dá)Fig.3 Expressions of TGF‐β1，Smads2，Smads3 and Sma‐ds7 proteins in myocardial tissue of rats in each group

3 討論

心室重構(gòu)可導(dǎo)致心臟功能下降，是AMI后發(fā)病率和死亡率的獨(dú)立決定因素，嚴(yán)重影響患者生命安全［11］。超聲心電圖監(jiān)測(cè)和血流動(dòng)力指標(biāo)可量化AMI局部和整體心室重構(gòu)和心臟功能，故可用于AMI大鼠模型心臟重塑評(píng)價(jià)［12‐13］。本研究顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠左心室EDd、ESd顯著升高，EF、FS、+dp/dtmax、-dp/dtmax顯著降低，表明AMI大鼠發(fā)生心室重構(gòu)和心臟功能障礙，提示建模成功。

燈盞花屬于菊科植物，首載于《滇南本草》，可活血化瘀、消炎止痛［14］。燈盞花素為燈盞花的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化和抗血管生成等作用［15］。WANG等［16］研究顯示，燈盞花素可用于防治和治療慢性完全閉塞患者血運(yùn)重建后的左心室重建，恢復(fù)患者心肌功能；趙天等［17］發(fā)現(xiàn)，燈盞花素可通過改善血流和血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)改善大鼠動(dòng)脈粥樣硬化。本研究發(fā)現(xiàn)，給予燈盞花素治療后，AMI大鼠心室重構(gòu)及心臟功能障礙顯著改善，提示燈盞花素可恢復(fù)AMI大鼠心臟功能，推測(cè)燈盞花素可能通過預(yù)防心室重構(gòu)延緩AMI發(fā)展，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

TGF‐β在病理和生理過程中起重要作用，其中TGF‐β1與AMI后心室重構(gòu)病理機(jī)制密切相關(guān)［18］。Smads蛋白是絲/蘇氨酸受體的下游信號(hào)分子，也是TGF‐β受體中胞內(nèi)激酶的唯一底物，具有轉(zhuǎn)錄激活作用［19］。Smads蛋白家族包括受體調(diào)節(jié)蛋白Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8、Smad19、共同介質(zhì)蛋白Smads4和抑制性蛋白Smad6、Smad7 3類，其中TGF‐β1可導(dǎo)致Smad2和Smad3磷酸化，抑制Smads7表達(dá)參與AMI進(jìn)展［8］。本研究顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙顯著擴(kuò)大，可見明顯的間質(zhì)膠原沉積等病變，TGF‐β1、磷酸化的Smads2和Smads3蛋白表達(dá)顯著升高，Smads7蛋白表達(dá)顯著降低，提示AMI大鼠心臟功能障礙可能與TGF‐β1/Smad2/Smad3/Smads7途徑相關(guān)。給予燈盞花素治療后，AMI大鼠心肌組織病變顯著改善，TGF‐β1/Smad2/Smad3信號(hào)通路受抑制，Smads7蛋白水平顯著上升，與臨床常用藥物阿司匹林腸溶片治療效果接近，推測(cè)燈盞花素可能通過抑制TGF‐β1/Smads信號(hào)通路延緩AMI心室重構(gòu)，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

LU等［20］發(fā)現(xiàn)，TGF‐β1/Smad2/Smad3信號(hào)途徑的激活加重了慢性心力衰竭大鼠心室重構(gòu)、心肌纖維化和膠原沉積等病理變化。本研究聯(lián)合采用燈盞花素和TGF‐β1激活劑治療發(fā)現(xiàn)，AMI大鼠心肌組織TGF‐β1蛋白表達(dá)、Smads2和Smads3磷酸化水平比單獨(dú)采用燈盞花素治療時(shí)顯著升高，Smads7蛋白表達(dá)顯著降低，大鼠心室重構(gòu)、心肌組織病變程度和心肌纖維化加重，提示TGF‐β1激活劑可逆轉(zhuǎn)燈盞花素對(duì)AMI大鼠心室重構(gòu)的抑制作用。另有研究證實(shí)，抑制TGF‐β1蛋白表達(dá)和Smad2蛋白磷酸化可上調(diào)AMI大鼠心肌組織Smad7蛋白表達(dá)，降低AMI大鼠心肌組織中膠原水平，改善心室重構(gòu)［21］。因此，推測(cè)TGF‐β1/Smads信號(hào)通路可能是燈盞花素治療AMI的關(guān)鍵靶點(diǎn)。