韓慶賢 丁智斌李曉慧 宋麗娟王青 柴智 尉杰忠 馬存根

（山西中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點(diǎn)研究室/神經(jīng)生物學(xué)研究中心，太原 030024）

研究表明，氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）反應(yīng)參與神經(jīng)損傷過(guò)程，既是其發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵特征，也是重要的病理變化［1］。淫羊藿總黃酮（total flavo-noids of herba epimedii，TFE）是淫羊藿的主要黃酮醇類化合物，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌、提高免疫力、抗炎與抗氧化等作用［2］。TFE已被證實(shí)是一種有效的抗氧化劑［3］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）炎癥性脫髓鞘病是一種累及腦、脊髓和周圍神經(jīng)的自身免疫性疾病，主要包括多發(fā)性硬化癥（mul-tiple sclerosis，MS）、視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis op-tica，NMO）和急性播散性腦脊髓炎（acute dissemi-nated encephalomyelitis，ADEM）等，但病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明，臨床尚無(wú)有效治療方式［4］。目前研究認(rèn)為，OS是其主要發(fā)病機(jī)制之一［5］。OS可產(chǎn)生過(guò)多的氧自由基及其他代謝產(chǎn)物，引發(fā)細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白和線粒體損傷，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞死亡導(dǎo)致髓鞘脫失，從而導(dǎo)致脫髓鞘癥狀［6］。核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶‐1（nuclear factor erythroid‐2‐related fac-tor 2/heme oxygenase 1，Nrf2/HO‐1）信號(hào)通路可抵抗OS損傷，是機(jī)體重要的內(nèi)源性抗氧化體系之一［7］。

雙環(huán)己酮草酸二腙（cuprizone，CPZ）可選擇性損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocytes，OLs），在CNS多個(gè)區(qū)域誘導(dǎo)脫髓鞘，并伴隨小膠質(zhì)細(xì)胞活化。因此，CPZ脫髓鞘模型是研究和開發(fā)靶向髓鞘保護(hù)與再生藥物的理想動(dòng)物模型［8］。本研究通過(guò)體外與體內(nèi)研究探討TFE對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞OS的抑制作用，以及能否通過(guò)抑制OS緩解脫髓鞘，促進(jìn)髓鞘再生。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與動(dòng)物BV2細(xì)胞株傳自本實(shí)驗(yàn)室；18只成年C57BL/6雄性小鼠（10～12周齡）由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)開始前于山西中醫(yī)藥大學(xué)清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 試劑與儀器含0.2%CPZ的飼料（美國(guó)Sig-ma‐Aldrich公司）；DPPH（德國(guó)Sigma‐Aldrich公司）；各檢測(cè)試劑盒（南京建城生物工程公司）；anti‐Iba‐1、anti‐Nrf2、anti‐HO‐1（美國(guó)Abcam）；anti‐CNPs（德國(guó)Millipore）；激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯）。

1.2 方法

1.2.1 原代小膠質(zhì)細(xì)胞制備取新生C57BL/6小鼠（72 h內(nèi)），75%乙醇消毒，無(wú)菌條件下斷頭，剪開頭皮及顱骨，取腦組織，高糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（下置冰袋）培養(yǎng)；無(wú)菌剝離腦組織，除去小腦、海馬、大腦髓質(zhì)，分離大腦皮層，剝離腦膜及血管；剪成1～3 mm組織塊，10 000 r/min離心10 min，離心3次，將細(xì)胞鋪于75 cm2培養(yǎng)瓶，5% CO2、37℃培養(yǎng)14～16 d，搖床上輕搖6 h，脫離小膠質(zhì)細(xì)胞，1 500 r/min離心10 min，獲取原代小膠質(zhì)細(xì)胞，接種于24孔板，5%CO2、37℃培養(yǎng)。

1.2.2 骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（bone marrow‐derived macrophages，BMDMs）制備取成熟C57BL/6小鼠處死，75%乙醇消毒，超凈臺(tái)內(nèi)取其股骨骨髓內(nèi)細(xì)胞1 500 r/min離心7 min，紅細(xì)胞裂解液裂解，培養(yǎng)液重懸，均勻接種于10 cm培養(yǎng)皿，加入100 ng/ml M‐CSF誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞向單核巨噬細(xì)胞分化，5%CO2、37℃培養(yǎng)7 d。

1.2.3 分組與給藥BV2細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及BM-DMs隨機(jī)分為正常對(duì)照組、LPS組及LPS+TFE組。TFE（15 μg/ml）預(yù)處理2 h后給予LPS（1 μg/ml）刺激24 h。18只小鼠按平均體重隨機(jī)分為正常組、模型組及TFE治療組，每組6只。模型組和TFE治療組用含0.2%CPZ的飼料喂養(yǎng)6周誘導(dǎo)脫髓鞘模型，正常組給予正常飼料，每天記錄體重和食物消耗。造模第4周末（第28天）TFE治療組小鼠腹腔注射TFE 50 mg/（kg·d），200 μl/只，直到第6周末，正常組和模型組每天給予等量生理鹽水。

1.2.4 組織制備10%水合氯醛麻醉小鼠，生理鹽水經(jīng)心臟灌注，4%多聚甲醛固定，提取腦組織，脫水，OCT包埋，低溫切片機(jī)切片，用于免疫熒光染色。

1.2.5 DPPH、ABTS和FRAP法檢測(cè)自由基清除能力DPPH實(shí)驗(yàn)：通過(guò)光譜光度計(jì)對(duì)DPPH的紫色甲醇溶液進(jìn)行漂白，確定其抗氧化活性。將30μl不同濃度的TFE溶液加入到270 μl DPPH溶液中（乙醇中最終濃度為0.2 mmol/L），室溫孵育30 min，檢測(cè)515 nm處吸光度，計(jì)算DPPH清除效果（%）=（1-A抗氧化物質(zhì)與DPPH反應(yīng)/A溶劑DPPH）×100%。各樣品獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。ABTS實(shí)驗(yàn)：7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶于10 ml無(wú)水乙醇，室溫避光12 h，制備ABTS溶液。將30 μl不同濃度的TFE溶液加入至270 μl ABTS無(wú)水乙醇溶液中，室溫孵育30 min，檢測(cè)734 nm處吸光度，計(jì)算ABTS清除效應(yīng)（%）=（A溶劑ABTS-A抗氧化物質(zhì)與ABTS反應(yīng)）/A溶劑ABTS×100%，各樣品獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。FRAP實(shí)驗(yàn)：乙酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 3.6）、TPTZ（10 mmol/L）和三氯化鐵（20 mmol/L）制備FRAP試劑，室溫避光孵育8 min。將30 μl不同濃度的TFE溶液加入到270 μl FRAP溶液中，室溫孵育30 min，檢測(cè)593 nm處吸光度，計(jì)算FRAP清除效果（%）=（A溶劑FRAP-A抗氧化物質(zhì)與FRAP反應(yīng)）/A溶劑的FRAP×100%，各樣品獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.6 氧化和抗氧化指標(biāo)檢測(cè)3 000 r/min離心細(xì)胞懸液10 min，取上清。3 000 r/min離心組織勻漿10 min，BCA法定量提取蛋白。按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)抗氧化指標(biāo)［如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH‐Px）和過(guò)氧化氫酶（CAT）水平］及氧化中間產(chǎn)物［如丙二醛（MDA）、過(guò)氧化氫（H2O2）和一氧化氮（NO）水平］。

1.2.7 免疫熒光染色腦組織切片（10 μm）在室溫中用4%多聚甲醛固定30 min，加入anti‐Iba‐1、anti‐Nrf2、anti‐HO‐1、anti‐CNPs，4℃孵 育 過(guò) 夜，PBS洗滌，加入相應(yīng)二抗室溫1 h，50%甘油封片，激光共聚焦收集圖像，Image‐ProPlus6.0軟件分析結(jié)果。

1.2.8 Black GoldⅡ染色4%多聚甲醛固定切片15 min，烘干，ddH2O浸潤(rùn)2 min，置于泡沫板60℃水浴加熱，滴加提前預(yù)熱的Black GoldⅡ染液染色20 min，ddH2O沖洗2次，滴加預(yù)熱好的硫代硫酸鈉溶液，60℃水浴孵育10 min，ddH2O浸洗2次，滴加結(jié)晶紫室溫染色3 min，ddH2O浸洗。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析（ANOVA），兩兩比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TFE劑量依賴性清除自由基TFE的DPPH自由基清除活性從10.76%上升為76.45%，TFE濃度為1.56～100μg/ml，DPPH的IC50為24.01μg/ml。1.56～100 μg/ml TFE的FRAP自由基清除活性從11.12%上升為66.17%，F(xiàn)RAP的IC50為35.47μg/ml。ABTS自由基清除活性在16.24%～66.82%存在差異，TFE濃度變化范圍為1.56～100μg/ml，ABTS的IC50為30.08 μg/ml。TFE可 清 除DPPH、ABTS和FRAP自由基，且呈劑量依賴性（圖1）。

2.2 TFE對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞、原代小膠質(zhì)細(xì)胞、BMDMs OS的影響如圖2所示，與LPS刺激組相比，TFE顯著降低BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NO、H2O2水平（P＜0.05），顯著降低原代小膠質(zhì)細(xì)胞NO、H2O2和MDA水平（P＜0.05），上調(diào)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞、原代小膠質(zhì)細(xì)胞抗氧化酶SOD、CAT和GSH‐Px水平（P＜0.05），BMD-Ms結(jié)果與BV2細(xì)胞和原代小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)果相似。

圖1 TFE劑量依賴性地清除自由基Fig.1 TFE scavenged free radicals in a dose‐dependent manner

2.3 TFE抑制CPZ脫髓鞘模型OS與體外實(shí)驗(yàn)一致，同CPZ喂養(yǎng)的小鼠相比，TFE處理可顯著降低脫髓鞘小鼠腦蛋白中氧化產(chǎn)物NO、H2O2和MDA含量，上調(diào)SOD、CAT和GSH‐Px抗氧化產(chǎn)物含量（P＜0.05，圖3）。

2.4 TFE激活Nrf2/HO‐1抗氧化通路Nrf2是一種重要的內(nèi)源性抗氧化途徑，能增加下游抗氧化酶Ⅱ相酶中的HO‐1表達(dá)。Nrf2/HO‐1信號(hào)通路在CNS氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用［9］。為驗(yàn)證TFE的抗氧化作用是否與Nrf2/HO‐1信號(hào)通路有關(guān)，用免疫熒光法檢測(cè)體外小膠質(zhì)細(xì)胞與腦內(nèi)Nrf2/HO‐1表達(dá)，結(jié)果表明，與正常組相比，LPS模型組與CPZ模型組喂Nrf2和HO‐1表達(dá)（P＜0.01，圖4），而TFE治療后則顯著增加其表達(dá)（分別為P＜0.01，P＜0.001，圖4）。結(jié)果表明，TFE可能通過(guò)誘導(dǎo)Nrf2/HO‐1信號(hào)通路抑制OS。

圖2 TFE對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞、原代小膠質(zhì)細(xì)胞、BMDMs OS的影響Fig.2 Effect of TFE on OS of BV2 microglia cells，prima-ry microglia cells and BMDMs

圖3 TFE對(duì)CPZ脫髓鞘小鼠OS的影響Fig.3 Effect of TFE on OS in CPZ demyelinating mice

圖4 TFE激活Nrf2/HO‐1抗氧化通路Fig.4 TFE activates Nrf2/HO‐1 antioxidant pathways

圖5 TFE減少胼胝體髓鞘脫失Fig.5 TFE reduces myelin loss in corpus callosum

圖6 TFE促進(jìn)髓鞘再生Fig.6 TFE promotes myelin regeneration

2.5 TFE緩解胼胝體髓鞘脫失、促進(jìn)髓鞘再生Black GoldⅡ染色顯示，CPZ模型組小鼠胼胝體部位髓鞘脫失明顯（P＜0.01），TFE治療后，胼胝體部位髓鞘脫失明顯改善（P＜0.01，圖5）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與正常小鼠相比，CPZ模型組小鼠腦內(nèi)胼胝體區(qū)CNPase+細(xì)胞減少（P＜0.001），TFE干預(yù)組明顯增多（P＜0.001，圖6）。提示TFE治療可促進(jìn)CPZ脫髓鞘小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，促進(jìn)髓鞘形成與修復(fù)。

3 討論

Nrf‐2/HO‐1是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化通路，CNPase是髓鞘形成相關(guān)蛋白，可特異性表達(dá)OLs［9‐10］。研究表明，氧化損傷與CNS變性疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)［11］。LPS可誘導(dǎo)活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，導(dǎo)致氧化/抗氧化失衡和OS，從而導(dǎo)致細(xì)胞組織損傷［12］。CNPase+細(xì)胞減少提示OLs成熟或髓鞘再生障礙，而CNPase+細(xì)胞增多則提示OLs分化與髓鞘形成。本研究首先建立了體外DPPH、ABTS和FRAP測(cè)定TFE的氧化活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，TFE具有較強(qiáng)的清除DPPH、ABTS和FRAP自由基的能力，且在一定范圍內(nèi)與其濃度呈正相關(guān)。

氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在氧化條件下與抑制因子Kelch樣ECH聯(lián)合蛋白1分離，并與抗氧化反應(yīng)元件Pr結(jié)合被激活，啟動(dòng)下游抗氧化基因HO‐1轉(zhuǎn)錄［13］。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf‐2和HO‐1在CNS變性疾病中表達(dá)降低，而在治療后表達(dá)升高，并減輕局部OS［14‐16］。說(shuō)明Nrf2在OS相關(guān)的神經(jīng)變性疾病中起重要保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)體外LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中氧化標(biāo)記物NO、H2O2、MDA水平上升，而TFE干預(yù)組NO、H2O2、MDA表達(dá)降低，抗氧化酶SOD、CAT、GSH‐Px表達(dá)上升，并激活Nrf2，提高HO‐1表達(dá)，且在CPZ誘導(dǎo)的脫髓鞘小鼠模型中得到了驗(yàn)證。結(jié)果表明，TFE干預(yù)組中，Nrf2和HO‐1有顯著的調(diào)節(jié)作用，支持了TFE具有抗氧化作用的假設(shè)。

本研究表明，TFE可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的OS，減少髓鞘脫失，促進(jìn)髓鞘再生，可能通過(guò)激活抗氧化通路Nrf2/HO‐1發(fā)揮作用。