孔靖瑋 李亞蘭 吳珺 葛東宇 劉紅雙 趙點 彭桂英

（北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029）

“肺與大腸相表里”理論源于“臟腑相合”理論，是藏象學(xué)說的關(guān)鍵組成部分，在中醫(yī)藥臨床工作中具有重要的指導(dǎo)意義［1］。《黃帝內(nèi)經(jīng)》最早提出“肺合大腸”理論，近年來，關(guān)于該理論的研究十分廣泛。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)“從腸治肺”方大承氣湯能有效改善哮喘小鼠的肺部炎癥［2‐3］。另有實驗指出哮喘等肺系疾病動物模型伴有不同程度的腸道功能障礙和病理損傷，同時引起腸道內(nèi)炎性介質(zhì)、神經(jīng)肽等物質(zhì)的變化［4‐7］。此外，Science曾報道在蠕蟲感染后，腸源性KLRG1+ILC2可遷移至肺部產(chǎn)生免疫應(yīng)答［8］，這些結(jié)果均表明肺與大腸之間存在一定的生物學(xué)聯(lián)系，然而免疫細(xì)胞從肺組織遷移至腸道的相關(guān)內(nèi)容尚未見報道。

免疫細(xì)胞再循環(huán)與歸巢是維持機(jī)體正常免疫狀態(tài)的關(guān)鍵因素，細(xì)胞可通過血管和淋巴管在器官和組織中循環(huán)或定植。聯(lián)體共生模型是目前檢測細(xì)胞是否具有遷移功能最直接、最有效的方法［9］。該模型將兩只實驗動物的相鄰皮膚進(jìn)行手術(shù)縫合，隨著縫合處血管重塑與血液互通，共生鼠可共用一套血液循環(huán)系統(tǒng)，通過特異性標(biāo)記可檢測組織中細(xì)胞的遷移能力。因此，本研究擬借助于同類系小鼠構(gòu)建聯(lián)體共生模型，對哮喘小鼠肺組織CD4+T細(xì)胞遷移至結(jié)腸的可能性進(jìn)行探討，同時探索聯(lián)體共生小鼠模型的構(gòu)建方法，為后續(xù)“臟腑相合”理論的深入研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物SPF級，6～8周齡C57BL/6雌性小鼠（基因型為CD45.2），體重18～20 g，購自北京斯貝福實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物合格證號：SCXK（京）2016‐0002。CD45.1小鼠由清華大學(xué)免疫研究所惠贈，繁殖飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。小鼠自由進(jìn)食飲水，12 h明暗周期，溫度（22±2）℃，相對濕度（50±10）%。

1.1.2 試劑木瓜蛋白酶（papain）、BSA購自Sig-ma；新霉素、多黏菌素‐B購自INALCO；酮咯酸氨丁三醇購自源葉生物；PBS、D‐Hank′s、紅細(xì)胞裂解液購自索萊寶；RPMI1640購自HyClone；膠原酶Ⅲ購自Worthington；Percoll分離液購自GE Healthcare；小鼠流式抗體：CD16/CD32、CD45‐Pacific BlueTMdye、CD3‐FITC、CD4‐AlexaFlourTM700、CD45.2‐Briliant Violet 510、CD11b‐PE‐Cy5、CD11c‐FITC、CD170（Si-glec‐F）‐PE、Ly6C‐APC/Cyanine7、Ly6G‐APC購自Bio-Legend；CD8a‐PE購自BD PharmingenTM；CD45.1‐PE‐Cyanine7購自eBioscienceTM。

1.1.3 儀器超分辨顯微組織成像顯微鏡（Lecia，Aperio Versa）；流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，Cyto-FLEX）。

1.2 方法

1.2.1 聯(lián)體共生小鼠模型的制備選擇周齡、體格、體重相近的CD45.1和CD45.2雌性小鼠各10只進(jìn)行配對，術(shù)前配對小鼠單獨合籠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。手術(shù)當(dāng)天，通過腹腔注射0.5%戊巴比妥溶液麻醉小鼠，剔除2只小鼠相對一側(cè)的毛發(fā)，碘伏消毒后行無菌手術(shù)，切開從肘部至膝蓋的皮膚，將距切口0.5 cm的皮膚與皮下筋膜剝離，接著將兩只小鼠切口行連續(xù)縫合術(shù)。術(shù)中皮下注射生理鹽水防止脫水并肌肉注射1 mg/ml酮咯酸氨丁三醇溶液鎮(zhèn)痛，術(shù)后每日進(jìn)行手術(shù)切口消毒，并給予酮咯酸氨丁三醇鎮(zhèn)痛，使用含抗生素（106U/L多黏菌素B+1.1 g/L新霉素）的飲用水2周以預(yù)防感染。2周后取小鼠尾尖血，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測血液循環(huán)構(gòu)建情況，術(shù)后4周進(jìn)行分組與造模，實驗過程見圖1。

1.2.2 實驗分組與造模成功構(gòu)建的聯(lián)體共生小鼠，隨機(jī)分成2組，對照組（Control）和模型組（Mod-el），每組各3對。模型組中CD45.1小鼠給予papain滴鼻誘發(fā)哮喘，哮喘的誘發(fā)方案如下，于第0、1、3、4、5天在小動物麻醉機(jī)作用下30μg/40μl papain滴鼻，每日1次；對照組中CD45.1小鼠給予無菌PBS溶液相同處理，兩組中的CD45.2小鼠均無處理。

1.2.3 肺泡灌洗液（BALF）提取與細(xì)胞的制備最后一次滴鼻24 h后，麻醉下處死小鼠。解剖分離氣管和主支氣管，左主支氣管行結(jié)扎后，以1 ml注射器插入右主支氣管，用0.8 ml無菌PBS溶液連續(xù)灌洗右肺3次，回收率為80%以上，回收灌洗液離心后收集細(xì)胞沉淀，重懸于含0.5%BSA的PBS溶液中計數(shù)，取1×106個細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)檢測中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量。

圖1 同類系小鼠構(gòu)建聯(lián)體共生模型的實驗方案Fig.1 Experimental protocol of parabiotic model by con-genic mice

1.2.4 肺組織和結(jié)腸組織單細(xì)胞懸液的制備提取小鼠右肺組織，用組織剪將其剪碎，置于含1 mg/ml膠原酶Ⅲ的RPMI1640溶液中37℃消化60 min后，消化液經(jīng)70μm的細(xì)胞篩過濾后，離心收集細(xì)胞沉淀，經(jīng)冷PBS洗滌2次后，重懸于40%Per-coll分離液中。

提取小鼠結(jié)腸組織，將組織剪成5 mm×5 mm×5 mm組織塊后用含5 mmol/L EDTA的D‐Hank's洗滌2次，每次20 min，接著置于1 mg/ml膠原酶Ⅲ的RPMI1640溶液中37℃消化60 min后，消化液經(jīng)70 μm的細(xì)胞篩過濾后，離心收集細(xì)胞沉淀，經(jīng)冷PBS洗滌2次后，重懸于40%Percoll分離液中。

將前兩步獲得的肺和結(jié)腸組織的40%Percoll細(xì)胞懸液進(jìn)行梯度離心，沉淀細(xì)胞用紅細(xì)胞裂解液裂解，冷PBS洗滌2次，重懸于含0.5%BSA的PBS溶液中計數(shù)，并取1×106個細(xì)胞用于后續(xù)流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.2.5 HE染色檢測肺組織和結(jié)腸組織病理學(xué)變化取左肺組織，用10%甲醛溶液固定24 h。提取結(jié)腸組織，將結(jié)腸按照Swiss‐roll方式翻卷成年輪狀后，用10%甲醛溶液固定24 h。梯度酒精脫水、透明，石蠟包埋，制備5～6μm組織切片用于HE染色，封片后超分辨顯微組織成像顯微鏡下拍照，觀察肺組織和結(jié)腸組織的病理學(xué)變化。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫細(xì)胞的表型前述制備的組織單細(xì)胞懸液，首先加入CD16/CD32抗體冰上孵育10 min；對于BALF中嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的檢測，加入熒光素標(biāo)記的anti‐mouse CD45、anti‐mouse CD11b、anti‐mouse CD11c、anti‐mouse Singlec‐F、anti‐mouse Ly6G以 及anti‐mouse Ly6C等抗體，冰上避光孵育30 min；對于肺腸組織的T細(xì) 胞 檢 測，加 入anti‐mouse CD3、anti‐mouse CD4、anti‐mouse CD8、anti‐mouse CD45、anti‐mouse CD45.1、anti‐mouse CD45.2等抗體冰上避光孵育；最后用含0.5%BSA的PBS洗滌2次后重懸，待上機(jī)檢測?？蜷T策略：①CD4+T細(xì)胞：CD45+CD3+CD4+；②CD8+T細(xì)胞：CD45+CD3+CD8+；③嗜酸性粒細(xì)胞（Eo-sinophil）：CD45+CD11b+CD11c‐Singlec‐F+；④中 性粒細(xì) 胞（Neutrophil）：CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Cinter；⑤CD45.1+CD4+T細(xì) 胞：CD45+CD45.1+CD3+CD4+；⑥CD45.2+CD4+T細(xì)胞：CD45+CD45.2+CD3+CD4+。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以±s表示，方差齊采用獨立樣本t檢驗，方差不齊采用近似t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 木瓜蛋白酶可誘發(fā)哮喘小鼠肺部炎癥對木瓜蛋白酶滴鼻誘發(fā)小鼠哮喘模型進(jìn)行分析。肺組織HE染色結(jié)果顯示PBS滴鼻小鼠肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，氣管周圍未見炎癥細(xì)胞浸潤，而給予小鼠papain滴鼻，其支氣管及血管周圍存在明顯炎癥細(xì)胞浸潤，部分肺泡結(jié)構(gòu)消失（圖2）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示小鼠經(jīng)papain滴鼻后BALF中嗜酸性粒細(xì)胞（P＜0.001）與嗜中性粒細(xì)胞（P＜0.01）數(shù)量均顯著升高（圖3），且肺組織CD4+細(xì)胞的比例也明顯升高（P＜0.001，圖4）。

2.2 木瓜蛋白酶誘發(fā)哮喘小鼠存在結(jié)腸組織炎癥細(xì)胞浸潤按照Swiss‐roll法將結(jié)腸卷成年輪狀，制備結(jié)腸全腸的病理切片，HE染色結(jié)果顯示PBS滴鼻小鼠結(jié)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜層、黏膜下層和肌層無炎癥細(xì)胞浸潤，但papain滴鼻小鼠結(jié)腸黏膜層多處可見炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜下層、肌層無明顯病理改變（圖5）。這說明哮喘小鼠存在結(jié)腸組織炎性病變，可能存在腸道功能的紊亂。

圖2 小鼠肺組織HE染色（×100）Fig.2 HE staining of lung tissues in mice（×100）

圖3 小鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量Fig.3 Counts of eosinophils and neutrophils in BALF of mice

2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠結(jié)腸CD4+T細(xì)胞比例在木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的哮喘小鼠結(jié)腸黏膜固有層中，CD4+T細(xì)胞比例明顯高于PBS滴鼻小鼠（圖6），說明在哮喘狀態(tài)下，CD4+T細(xì)胞比例在肺組織和結(jié)腸組織中發(fā)生了一致性的變化。

2.4 聯(lián)體共生模型的構(gòu)建及一般情況本研究采用的同類系小鼠CD45.1和CD45.2，除了在CD45分子的表達(dá)有差異外，遺傳背景完全相同。可借助于這種工具鼠進(jìn)行免疫細(xì)胞的來源與分化等研究。

本實驗共構(gòu)建了10對聯(lián)體共生小鼠，其中術(shù)后2對拖拽嚴(yán)重、動作不協(xié)調(diào)，1對傷口脫線，1對手術(shù)后體型出現(xiàn)明顯差異，手術(shù)成功率為60%，因此本研究擬對余下的6對小鼠進(jìn)一步造模研究。手術(shù)2周后流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠血液交換情況，結(jié)果顯示這6對聯(lián)體共生小鼠血液內(nèi)CD45.1+細(xì)胞和CD45.2+細(xì)胞的占比差異不顯著（P＞0.05），白細(xì)胞交換比例接近50∶50（圖7），表明此6對共生小鼠構(gòu)建成功，二者可共享血液循環(huán)系統(tǒng)。接著將這6對聯(lián)體共生小鼠隨機(jī)分成對照組和模型組，每組3對，按照前述方法造模。

圖4 小鼠肺組織CD4+T細(xì)胞的比例Fig.4 Proportion of CD4+T cells in lung tissues of mice

圖5 小鼠結(jié)腸組織HE染色（×100）Fig.5 HE staining of colon tissues in mice（×100）

圖6 小鼠結(jié)腸黏膜固有層CD4+T細(xì)胞的比例Fig.6 Proportion of CD4+T cells in colonic lamina pro-pria of mice

2.5 哮喘狀態(tài)下共生鼠結(jié)腸黏膜固有層CD4 5.1+CD4+T細(xì)胞的變化利用同類系CD45.1和CD45.2的標(biāo)記，將CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)來源于CD45.1小鼠的CD4+T細(xì)胞比例發(fā)生了變化。CD45.2小鼠結(jié)腸中CD45.1+CD4+T細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05，圖8）。推測模型組中CD45.2小鼠結(jié)腸內(nèi)增加的CD45.1+CD4+T細(xì)胞應(yīng)是CD45.1小鼠肺部受到木瓜蛋白酶刺激后，體內(nèi)CD4+T細(xì)胞擴(kuò)增遷移而來，這群擴(kuò)增遷移而來的CD4+T細(xì)胞具體亞群值得進(jìn)一步研究。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測聯(lián)體共生模型血液交換情況Fig.7 Flow cytometry analysis of blood exchange in para-biotic model

圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組共生小鼠結(jié)腸黏膜固有層CD45.1+CD4+T細(xì)胞的比例Fig.8 Flow cytometry analysis of proportion of CD45.1+CD4+T cells in colonic lamina propria of each mouse in parabiotic model

3 討論

“肺合大腸”理論首見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，《靈樞·本輸》曰：“肺合大腸，大腸者，傳道之府?！狈闻c大腸互為表里，在經(jīng)絡(luò)上相互聯(lián)系，在生理和病理上相互影響，雖然肺組織與腸道在解剖學(xué)結(jié)構(gòu)上存在一定的距離，但有大量實驗證明了腸道與肺之間的生物學(xué)聯(lián)系。如腸道菌群對肺部疾病發(fā)生與轉(zhuǎn)歸的影響，黏膜系統(tǒng)免疫應(yīng)答的相互調(diào)控，細(xì)胞因子的內(nèi)分泌作用等［10］。由此可見，中醫(yī)基礎(chǔ)理論“肺合大腸”的科學(xué)內(nèi)涵在不斷豐富。

哮喘是一種以支氣管痙攣和氣道炎癥為主要特征的常見肺系疾病，發(fā)病時有多種免疫細(xì)胞參與［11］。本研究以哮喘為疾病模型，借助于聯(lián)體共生模型探尋肺與大腸之間是否存在特異性免疫細(xì)胞的遷移。木瓜蛋白酶是一種自然界中常見的過敏原，研究表明papain誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道周圍存在白細(xì)胞浸潤、杯狀上皮化生、黏液增多、氣道狹窄等病理改變［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，papain滴鼻小鼠與PBS滴鼻小鼠相比，其BALF中嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯增多，同時肺組織CD4+T細(xì)胞比例顯著升高。這與文獻(xiàn)報道OVA誘發(fā)小鼠哮喘模型一致，提示papa-in滴鼻能成功構(gòu)建哮喘模型，促進(jìn)肺組織CD4+T細(xì)胞的增殖分化［13］。值得注意的是，papain滴鼻誘發(fā)的哮喘小鼠結(jié)腸黏膜層有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤以及CD4+T細(xì)胞比例的增加，提示哮喘發(fā)病可能影響腸道免疫狀態(tài)，造成一定程度的腸道組織損傷。有研究報道OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型可發(fā)生IFN‐γ介導(dǎo)的結(jié)腸炎癥病變，此外，煙草吸入可通過Th17細(xì)胞‐中性粒細(xì)胞軸誘發(fā)腸道炎癥［6‐7］。這與本研究結(jié)果初步一致，然而papain誘發(fā)的哮喘小鼠結(jié)腸組織炎癥病理是否和CD4+T細(xì)胞組織遷移的特異性有關(guān)尚不明確，因此，本研究進(jìn)一步采用聯(lián)體共生模型對CD4+T細(xì)胞在肺與大腸之間遷移的可能性進(jìn)行探討。

聯(lián)體共生鼠模型應(yīng)用于多類基礎(chǔ)研究，通過特異性標(biāo)記可檢測小鼠組織內(nèi)本體細(xì)胞與配體細(xì)胞（對側(cè)動物）的分布狀態(tài)，具有遷移特性的細(xì)胞會以同樣的概率分布于對側(cè)動物組織中，而組織駐留細(xì)胞則不隨血液循環(huán)遷移。聯(lián)體共生模型構(gòu)建周期較長，代價較大，成功建立模型是實驗最關(guān)鍵的步驟之一。在模型構(gòu)建過程中，課題組發(fā)現(xiàn)配對小鼠生理指標(biāo)和生活習(xí)性的一致性十分重要，若重量、體格差異較大，易導(dǎo)致拉扯、脫線，使傷口愈合較差影響血液交換，若配對小鼠生活習(xí)性不一致，易導(dǎo)致動作不協(xié)調(diào)，進(jìn)而出現(xiàn)進(jìn)水進(jìn)食困難、脫線等問題。解決上述問題后，配合熟練的手術(shù)操作可穩(wěn)定構(gòu)建共享循環(huán)的聯(lián)體共生鼠，用于從細(xì)胞的遷移性尋找臟腑之間關(guān)聯(lián)的研究。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在對照組中的CD45.2小鼠結(jié)腸黏膜固有層CD4+T細(xì)胞中，CD45.1+CD4+T細(xì)胞占比約為40%，表明部分CD4+T細(xì)胞在生理狀態(tài)下可遷移募集至腸道，但這種分布狀態(tài)在模型組中發(fā)生了顯著變化，CD4+T細(xì)胞中CD45.1+CD4+T細(xì)胞占比接近55%。在本實驗中僅對聯(lián)體共生鼠中的CD45.1小鼠進(jìn)行滴鼻，檢測CD45.2小鼠體內(nèi)CD45.1+細(xì)胞的分布可以更直接地觀察在哮喘疾病模型下免疫細(xì)胞的遷移。在CD45+CD3+CD4+框門下，CD45.1+細(xì)胞比例明顯高于對照組，說明未受刺激的CD45.2小鼠結(jié)腸內(nèi)增加的CD45.1+CD4+T細(xì)胞由CD45.1小鼠體內(nèi)遷移而來，考慮到木瓜蛋白酶能夠激活肺部CD4+T細(xì)胞增殖，其直接作用于CD45.1小鼠肺組織，推測哮喘狀態(tài)下肺內(nèi)增殖的CD45.1+CD4+T細(xì)胞遷移能力增強，經(jīng)循環(huán)可能募集至結(jié)腸黏膜固有層。CD4+T細(xì)胞亞型眾多，上述發(fā)生遷移的CD4+T細(xì)胞更可能是CD45.1小鼠體內(nèi)某個CD4+T細(xì)胞亞群。

綜上所述，研究結(jié)果表明木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的哮喘小鼠存在結(jié)腸組織炎癥病理改變，且體內(nèi)CD4+T細(xì)胞亞群可特異性遷移到結(jié)腸黏膜固有層，這豐富了“肺合大腸”的科學(xué)內(nèi)涵。然而，這群特異性遷移至腸道的CD4+T細(xì)胞到腸道發(fā)揮怎樣的作用，其具體表型如何，以及遷移歸巢方式，值得深入探討。