陳艷平 廖海鋒王青 羅霞 鄧向亮 周聯(lián)（廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510006）

近年來(lái)，多糖的研究逐漸引起重視，其組成較為復(fù)雜，分子量可從幾千到幾十萬(wàn)［1］。目前研究認(rèn)為，多糖生理功效和生物活性與其分子量大小、聚合度、分支度及溶液中高級(jí)構(gòu)象等有關(guān)，多糖分子量太大或太小均會(huì)引起其活性下降［2］。多糖的相對(duì)分子量越大，體積越大，越不利于多糖跨越多重細(xì)胞膜進(jìn)入生物體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)活性，但分子量過(guò)低也無(wú)法形成產(chǎn)生活性的聚合結(jié)構(gòu)［3］。

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞（Lycium bar-barum L.）的干燥成熟果實(shí)，具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目的功效，是一種常見的藥食同源的中藥材?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharides，LBPs）是枸杞的主要活性成分，具有增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗肝損傷、降血糖等多種生物學(xué)活性或藥理作用［4‐7］。多項(xiàng)研究表明，LBPs可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞（dentritic cells，DCs）的分化和成熟，其活性可能與分子量大小有關(guān)［8‐10］。課題組前期試驗(yàn)采用膜分離技術(shù)從枸杞粗多糖中分離得到不同分子量的枸杞多糖組分（LBP2、LBP3、LBP4和LBP5）［11］。本文比較不同分子量的多糖組分促進(jìn)DCs成熟的差異，篩選出活性最強(qiáng)的組分，為枸杞多糖的進(jìn)一步研究和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品LBPs組分：不同分子量LBPs組分由廣州澤力生物技術(shù)有限公司通過(guò)膜透析技術(shù)分離純化所得。按照分子量的大小分別為L(zhǎng)BP2（分子量350～400 kD，糖66.88%，水12.8%）、LBP3（分子量40～350 kD，糖54.47%，水14.59%）、LBP4（分子量8～40 kD，糖56.53%，水14.88%）、LBP5（分子量3～8 kD，糖55.21%，水15.85%）。

1.1.2 試劑RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（Biological Industries公司）；Murine GM‐CSF和Murine IL‐4（PerproTech公 司）；PE/Cy7 anti‐mouse CD11c antibody、FITC anti‐mouse CD80 antibody、PE anti‐mouse MHCⅡ（I‐A）、PE/Cy5 anti‐mouse CD86 antibody（eBioscience公司）；脂多糖LPS（Sigma‐Al-drich公司）；Cytometric Bead Array（CBA）Mouse In-flammation Kit（BD公司）。

1.1.3 儀器SW‐CJ‐2FD型超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈安泰公司）；L535R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀（BD公司）；MCO‐20AIC型CO2培養(yǎng)箱（SANYO公司）；BDS 300型倒置生物顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）；Multiskan FC型酶標(biāo)儀（Thermo公司）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體重18～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（粵）2013‐0002。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓源DCs的原代培養(yǎng)參照《免疫學(xué)技術(shù)及其應(yīng)用》中的培養(yǎng)條件，即10～20 ng/ml GM‐CSF和1 ng/ml IL‐4，本研究初步比較原代細(xì)胞培養(yǎng)條件，通過(guò)檢測(cè)其特異性表型獲得純度最好的未成熟DCs［12］。具體操作過(guò)程如下：無(wú)菌取C57BL/6小鼠股骨和脛骨，RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞置于離心管中。將獲得的骨髓細(xì)胞通過(guò)400目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾后，離心（300 g，5 min，4℃），棄上清。加入2 ml紅細(xì)胞裂解液，混勻，1 min后離心（300 g，5 min，4℃），棄上清。再用RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌骨髓細(xì)胞2次。設(shè)置3個(gè)組別的培養(yǎng)條件，分別為A組（GM‐CSF 10 ng/ml，IL‐4 1 ng/ml）、B組（GM‐CSF 20 ng/ml，IL‐4 2 ng/ml）、C組（GM‐CSF 20 ng/ml，IL‐4 1 ng/ml）。將細(xì)胞因子溶解于RPMI1640完全培養(yǎng)基并達(dá)到設(shè)定濃度值，重懸細(xì)胞并調(diào)整濃度為1×106個(gè)/ml，以4 ml/孔接種于6孔培養(yǎng)板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3 d后進(jìn)行全量換液，補(bǔ)充含特定濃度細(xì)胞因子的RPMI1640完全培養(yǎng)基。在第5天到第7天期間，每1～2 d半量換液1次。第8天收集半懸浮細(xì)胞，加入CD11c PE/cy7 anti‐mouse抗體。渦旋，常溫下孵育20 min后，流式細(xì)胞儀收集1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)CD11c陽(yáng)性細(xì)胞的比例進(jìn)行純度鑒定。

1.2.2 Griess法觀察LBPs不同組分對(duì)DCs釋放NO的影響收集1.2.1中A組未成熟的DCs，以含10% FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/ml接種于96孔板，100μl/孔。分組如下：正常組（Control組）、LPS組（0.1μg/ml），枸杞多糖LBP2、LBP3、LBP4、LBP5組（各組分劑量分別為25、50、100、200μg/ml）。加藥后，將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后吸取細(xì)胞培養(yǎng)液上清，按NO試劑盒說(shuō)明書操作，酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm波長(zhǎng)下OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并換算實(shí)際的NO濃度值。

1.2.3 CBA法檢測(cè)LBPs不同組分對(duì)DCs分泌細(xì)胞因子的影響DCs在成熟過(guò)程中會(huì)分泌多種細(xì)胞因子，包括IL‐6、IL‐10、MCP‐1、IFN‐γ和TNF‐α等。為了研究LBP2、LBP3、LBP4、LBP5對(duì)DCs分泌細(xì)胞因子的影響，分別加入25μg/ml的LBPs各組分刺激DCs，24 h后收集培養(yǎng)液上清，另加入濃度為0.1μg/ml的LPS作為對(duì)照，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，CBA法檢測(cè)培養(yǎng)液上清IL‐6、IL‐10、MCP‐1、IFN‐γ和TNF‐α的濃度。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LBP3對(duì)DCs表面分子表達(dá)的影響DCs在成熟過(guò)程中，會(huì)伴隨MHCⅡ、CD40、CD80和CD86等表達(dá)升高。LBP3在LBPs幾個(gè)組分中表現(xiàn)出最強(qiáng)的誘導(dǎo)DCs成熟的活性。課題組既往研究表明，與其他組分相比，LBP3表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤及促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化作用［11，13］。故本部分對(duì)LBP3誘導(dǎo)DCs表型成熟的作用進(jìn)行驗(yàn)證。收集1.2.1中A組的未成熟DCs，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105個(gè)/ml，以0.5 ml/孔接種于24孔板。設(shè)置Con-trol組、LPS（0.1 μg/ml）組、LBP3（25、50、100、200μg/ml）組，共6個(gè)分組。加藥刺激24 h后，收集DCs至流式管并離心（300 g，5 min，4℃）。添加CD11c PE/cy7 anti‐mouse，MHCⅡPE anti‐mouse，CD80 FITC anti‐mouse，CD86 PE/cy5 anti‐mouse抗體，將抗體與細(xì)胞混合渦旋，常溫下孵育20 min。離心，棄上清，400μl PBS渦旋細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD11c+MHCⅡ+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+DCs的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠骨髓來(lái)源DCs的體外誘導(dǎo)及培養(yǎng)由表1可知，小鼠骨髓細(xì)胞在A（GM‐CSF 10 ng/ml，IL‐4 1 ng/ml）、B（GM‐CSF 20 ng/ml，IL‐4 2 ng/ml）、C（GM‐CSF 20 ng/ml，IL‐4 1 ng/ml）3種培養(yǎng)條件下均可被誘導(dǎo)為未成熟DCs，A組誘導(dǎo)條件下CD11c+DC的比例高于B組和C組，達(dá)到82.1%，故后續(xù)研究均采用10 ng/ml GM‐CSF，1 ng/ml IL‐4條件誘導(dǎo)培養(yǎng)未成熟DCs。

顯微鏡下觀察在A組誘導(dǎo)條件下的細(xì)胞形態(tài)如圖1，自第3天起，細(xì)胞開始變得不規(guī)則并貼附在培養(yǎng)板底部，細(xì)胞集落逐漸形成。至第8天，半懸浮細(xì)胞變得更為密集，且細(xì)胞較為飽滿，形態(tài)不規(guī)則，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的未成熟DC形態(tài)相符［13‐14］。

2.2 Griess法檢測(cè)LBPs各組分對(duì)DCs釋放NO的影響如圖2所示，除LBP2外，LBP3、LBP4、LBP5均可劑量依賴性地促進(jìn)未成熟DCs釋放NO。與其他3個(gè)LBPs組分相比，LBP3刺激DCs釋放NO的能力最強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 CBA法檢測(cè)枸杞多糖各組分對(duì)DCs釋放細(xì)胞因子的影響如圖3所示，LBP2的活性較低（P＞0.05）；LBP3和LBP5均可促進(jìn)DCs分泌IL‐6、IL‐10、MCP‐1、IFN‐γ和TNF‐α（P＜0.05或P＜0.01）；LBP4能促進(jìn)DCs分泌IL‐6、MCP‐1和TNF‐α（P＜0.01）。此外，對(duì)4種多糖組分刺激DCs分泌細(xì)胞因子進(jìn)行比較分析，除LBP3刺激DCs分泌的MCP‐1濃度低于LBP5外（P＜0.01），其他細(xì)胞因子濃度均高于另外3種多糖組分。

表1 不同培養(yǎng)條件對(duì)CD11+DCs比例的影響（±s，n=3）Tab.1 Proportion of CD11+DCs under different culture conditions（±s，n=3）

表1 不同培養(yǎng)條件對(duì)CD11+DCs比例的影響（±s，n=3）Tab.1 Proportion of CD11+DCs under different culture conditions（±s，n=3）

Note：Compared with control group，1）P＜0.001.

圖1 10 ng/ml GM‐CSF聯(lián)合1 ng/ml IL‐4誘導(dǎo)未 成熟DCs的細(xì)胞形態(tài)（×200）Fig.1 Morphology of immature DCs induced by 10 ng/ml GM‐CSF and 1 ng/ml IL‐4（×200）

圖2 LBPs不同分子組分對(duì)DCs分泌NO的影響Fig.2 Effects of different LBPs fractions on production of NO in culture supernatants of DCs

圖3 LBPs不同組分對(duì)DCs分泌的細(xì)胞因子的影響Fig.3 Effects of different LBPs fractions on production of cytokines in culture supernatants of DCs

圖4 LBP3對(duì)DCs表面分子表達(dá)的影響Fig.4 Effect of LBP3 on cell surface molecule expression on DCs

圖5 LBP3對(duì)DCs表面分子MFI的影響Fig.5 Effects of LBP3 on MFI of cell surface molecule in DCs

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LBP3對(duì)DCs表面分子表達(dá)的影響如圖4所示，LBP3的各劑量均可有效提高CD11c+DCs中MHCⅡ+、CD80+、CD86+表達(dá)水平（P＜0.01）；與空白組相比，LBP3刺激后的DC表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86的 平 均 熒 光 強(qiáng) 度（mean fluorescence intensity，MFI）均顯著增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01）。見圖5。表明LBP3具有良好的誘導(dǎo)DCs成熟的活性。

3 討論

研究證實(shí)，LBPs具有良好的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤功能［14‐15］。在課題組前期分離得到的5種不同分子量LBPs組分中，由于LBP1含糖量偏低，且不易溶于水，故本研究只對(duì)余下的4種水溶性多糖組分LBP2、LBP3、LBP4和LBP5進(jìn)行比較。

DCs是機(jī)體主要的抗原遞呈細(xì)胞之一，通過(guò)遞呈抗原激活T細(xì)胞，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。但DCs在體內(nèi)數(shù)量極少，從體內(nèi)分離DCs耗時(shí)較長(zhǎng)且細(xì)胞產(chǎn)量極低，不利于開展相關(guān)研究。利用小鼠骨髓中的前體細(xì)胞加外源性細(xì)胞因子組合定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，是目前體外獲得大量DCs的主要方法，在研究DC的生物學(xué)功能方面具有重要的意義［16］。目前體外誘導(dǎo)DCs的培養(yǎng)條件尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本研究結(jié)果顯示，10 ng/ml GM‐CSF聯(lián) 合1 ng/ml IL‐4是 誘 導(dǎo)CD11c+DCs的最佳條件。

DCs的成熟與否是發(fā)揮生理功能的先決條件［17］。未成熟的DCs表面低表達(dá)MHCⅡ類分子和共刺激分子，具有較強(qiáng)的抗原攝取和加工能力；成熟的DCs具有較強(qiáng)的抗原遞呈能力，可將抗原信息提呈給T細(xì)胞從而誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答［18］。有研究報(bào)道，在DCs被激活后由未成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒鞝顟B(tài)的過(guò)程中，伴隨著NO的釋放及IL‐1β、IL‐6、TNF‐α、IL‐12、IL‐10和MCP‐1等細(xì)胞因子的分泌增加［19‐20］。本研究中，經(jīng)過(guò)不同分子量的枸杞多糖組分刺激后，DCs釋放的NO及分泌的IL‐6、IL‐10、MCP‐1、IFN‐γ和TNF‐α含量顯著增加，尤以LBP3作用明顯，以上結(jié)果表明LBPs能誘導(dǎo)DCs成熟，且LBP3在這4種組分中活性最強(qiáng)。

成熟的DCs高表達(dá)MHCⅡ類分子和共刺激分子［21］。本研究中LBP3促進(jìn)DCs表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)LBP3可促進(jìn)DCs成熟。

以上研究表明LBPs可明顯促進(jìn)DCs成熟，且其作用活性與分子量密切相關(guān)，以分子量為40～350 kD的LBPs組分（LBP3）為佳，但相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。