鄭 丹 趙笑蕓 申達(dá)月 張曦瀾 李元平 廖 暉

（山西醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部，太原030012）

紅花具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛的功效，羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）是紅花的主要活性成分，在抗炎、抗腫瘤、抗氧化等方面發(fā)揮重要的藥理作用［1-2］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，含有HSYA的紅花提取物能夠抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮（nitric oxide，NO）及IL-1β［3］。

巨噬細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮防御、監(jiān)視、調(diào)節(jié)、提呈抗原及清除病原體和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用。巨噬細(xì)胞在不同情況下可以轉(zhuǎn)化為M1、M2等不同表型，在炎癥反應(yīng)中分別發(fā)揮損傷及保護(hù)的不同作用［4］。在LPS、高糖等的誘導(dǎo)下，巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化增加，IL-1β、TNF-α等炎癥因子大量產(chǎn)生，同時(shí)M2型減少［5］。

本研究利用高糖作用于巨噬細(xì)胞［6］，觀察M1型極化的標(biāo)志物TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）及M2型極化標(biāo)志物CD206、精氨酸酶-1（arginase-1，Arg-1）蛋白表達(dá)的變化，探究HSYA對(duì)高糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及NO、IL-1β等炎癥因子的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7為Absin生物技術(shù)公司（中國(guó)上海）提供。RPMI1640培養(yǎng)基、雙抗（Gibco）；胎牛血清（FBS）、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液5×（變性）、Western blot膜再生液、兔抗Arg-1、兔抗iNOS、兔抗CD206、兔抗TNF-α購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；HSYA購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；二甲基亞砜（DMSO）、LPS、葡萄糖（D-glucose）、RIPA組織細(xì)胞裂解液、ECL Plus超敏發(fā)光液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)于北京索萊寶公司；GAPDH，山羊抗兔二抗，山羊抗鼠二抗均購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7培養(yǎng)于含有10%FBS、100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)到80%～90%時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代分瓶培養(yǎng)。

1.2.2 確定誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型轉(zhuǎn)化的高糖濃度以11.1、25.0、33.3、44.4 mmol/L葡萄糖分別培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，其中11.1 mmol/L組為正常葡萄糖對(duì)照組，其余3組為高糖模型組，0.5μg/ml LPS（溶于DMSO溶液）作為模型對(duì)照［3］。各組培養(yǎng)時(shí)間分別為12 h、24 h。收集各組上清液，Griess法測(cè)定上清液中NO的代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽（NO2-）含量，篩選出可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化的高糖濃度。

1.2.3 確定HSYA在高糖中的安全作用濃度 將RAW264.7細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種于96孔板。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，重新加入200μl含有不同濃度HSYA的培養(yǎng)基（含33.3 mmol/L葡萄糖），濃度分別為50、100、200、400μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)18 h，棄上清，加入200μl新鮮培養(yǎng)基，再加入20μl CCK-8試劑，37℃孵育后，于酶標(biāo)儀450 nm條件下測(cè)定吸光度（OD）值。根據(jù)以下公式計(jì)算：RAW264.7細(xì)胞生存率（%）＝1-（A溶劑對(duì)照-A各樣品）/A溶劑對(duì)照×100%，篩選出HSYA的安全作用濃度。

1.2.4 Western blot檢 測(cè)TNF-α、iNOS、CD206、Arg-1的蛋白表達(dá) 生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，將實(shí)驗(yàn)分為4組，HSYA（100、200μmol/L）加入RAW264.7細(xì)胞作用2 h，再加入葡萄糖，使終濃度為33.3 mmol/L。同時(shí)設(shè)33.3 mmol/L高糖模型組及11.1 mmol/L正常對(duì)照組，24 h后分別收集細(xì)胞及上清液。提取所收取的細(xì)胞蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。取50μg待測(cè)蛋白樣品，10%SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜并封閉后，加入TNF-α、iNOS、CD206、Arg-1、GAPDH一抗，4℃孵育過(guò)夜，洗膜，加入二抗于37℃孵育2 h，洗膜，加入ECL顯色液，置于凝膠成像儀中觀察并分析結(jié)果，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.5 細(xì)胞上清液IL-1β及NO2-含量的測(cè)定 收集1.2.4中各組細(xì)胞上清液，ELISA試劑盒測(cè)定IL-1β，Griess法測(cè)定NO2-含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)。數(shù)值資料以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 確定誘導(dǎo)M1型極化的高糖濃度 與DMSO溶劑對(duì)照組相比，LPS作用于巨噬細(xì)胞12 h及24 h后，NO2-含量均顯著升高［（5.9±0.4）μmol/L vs（38.2±1.7）μmol/L，P＜0.05，及（6.0±0.6）μmol/L vs（45.0±1.1）μmol/L，P＜0.05］。25.0 mmol/L高糖作用于巨噬細(xì)胞12 h與24 h后，NO2-含量與11.1 mmol/L葡萄糖對(duì)照組相比，均未顯著增加。33.3 mmol/L高糖及44.4 mmol/L高糖作用24 h的NO2-含量均顯著高于12 h［33.3 mmol/L：（40.7±2.8）μmol/L vs（17.2±0.9）μmol/L，P＜0.05，及44.4 mmol/L：（41.2±3.4）μmol/L vs（23.8±1.0）μmol/L，P＜0.05］。33.3 mmol/L高 糖 與44.4 mmol/L高糖作用24 h的NO2-含量無(wú)顯著性差異，因此，最終選擇33.3 mmol/L高糖濃度作用24 h作為誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向M1型極化模型建立的最佳條件（表1）。

2.2 HSYA對(duì)RAW264.7細(xì)胞生存率的影響 與對(duì)照組相比，HSYA濃度在50、100、200、400μmol/L時(shí)的細(xì)胞存活率分別為97.6%、97.8%、98.0%、86.6%，結(jié)果見(jiàn)圖1。HSYA濃度在50～200μmol/L時(shí)，對(duì)RAW264.7細(xì)胞的致死率均小于5%，可認(rèn)為以上濃度不會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[7]。

表1 葡萄糖濃度對(duì)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響（±s，n=6）Tab.1 Effect of glucose concentration on NO production in RAW264.7 cells（±s，n=6）

表1 葡萄糖濃度對(duì)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響（±s，n=6）Tab.1 Effect of glucose concentration on NO production in RAW264.7 cells（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05，LPSmodel group vs DMSOcontrol group at 12 h；2）P＜0.05，LPS model group vs DMSO control group at 24 h；3）P＜0.05，33.3 mmol/L and 44.4 mmol/L high glucose group vs 11.1 mmol/Lcontrol group at 12 h；4）P＜0.05，33.3 mmol/L and 44.4 mmol/Lhigh glucosegroup vs11.1 mmol/L control group at 24 h；5）P＜0.05，33.3 mmol/Lhigh glucosegroup at 24h vs12h；6）P＜0.05，44.4mmol/Lhighglucosegroup at24hvs12h.

Groups DMSOsolvent control LPSmodel control 11.1 mmol/L glucose control 25.0 mmol/L glucose 33.3 mmol/L glucose 44.4 mmol/L glucose-（μmol/L）12 h 5.9±0.4 38.2±1.71）6.1±1.2 6.7±1.7 17.2±0.93）23.8±1.03）NO2 24 h 6.0±0.6 45.0±1.12）5.9±1.1 6.5±1.0 40.7±2.84）5）41.2±3.44）6）

圖1 HSYA對(duì)RAW264.7細(xì)胞生存率的影響Fig.1 Effect of HSYA on survival rate of RAW264.7 cells

2.3 HSYA對(duì)高糖誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞M1型/M2型分型的影響作用 如圖2所示，與11.1 mmol/L對(duì)照組相比，33.3 mmol/L高糖模型組的TNF-α、iNOS蛋白表達(dá)增加，Arg-1、CD206表達(dá)減少，其中以TNF-α、iNOS及Arg-1的蛋白表達(dá)差異顯著（P＜0.05）。與33.3 mmol/L高糖模型組相比，100、200μmol/L的HSYA均可顯著上調(diào)Arg-1蛋白表達(dá)而下調(diào)TNF-α、iNOS蛋白表達(dá)（P＜0.05），同時(shí)HSYA增加Arg-1的作用在200μmol/L時(shí)顯著優(yōu)于100μmol/L時(shí)（P＜0.05）。

圖2 HSYA對(duì)高糖誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞M1/M 2極化的影響作用Fig.2 Effect of HSYA on M 1/M 2 polarization induced by high glucose in RAW264.7 cells

表2 HSYA對(duì)高糖誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞NO和IL-1β的影響（±s，n=6）Tab.2 Effect of HSYA on production of NO and iIL-1βin RAW 264.7 cells induced by high glucose（±s，n=6）

表2 HSYA對(duì)高糖誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞NO和IL-1β的影響（±s，n=6）Tab.2 Effect of HSYA on production of NO and iIL-1βin RAW 264.7 cells induced by high glucose（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05，content of nitrite NO2-at 33.3 mmol/L high glucose model group vs 11.1 mmol/L control group；2）P＜0.05，content of NO2-at 100 and 200μmol/L HSYA group vs 33.3 mmol/L high glucose model group；3）P＜0.05，content of IL-1βat 33.3 mmol/L high glucose model group vs 11.1 mmol/L control group；4）P＜0.05，content of IL-1βat 100 and 200μmol/L HSYA group vs 33.3 mmol/L high glucose model group；5）P＜0.05，content of IL-1βat 200μmol/L HSYA group vs 100μmol/LHSYA group.

-Groups NO2 NOinhibition rate（%）IL-1βinhibition rate（%）11.1 mmol/Lglucosecontrol 33.3 mmol/L glucose model 33.3 mmol/L glucose+100μmol/L HSYA 33.3 mmol/L glucose+200μmol/L HSYA（μmol/L）5.9±1.1 40.7±2.81）28.4±2.52）25.2±1.62）- -- -IL-1β（pg/ml）14.7±0.2 69.4±4.63）35.3±2.94）25.9±1.94）5）61.8±8.6 79.2±3.9 35.4±6.3 44.0±8.9

2.4 HSYA對(duì)HG誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO及IL-1β的影響作用 由表2可知，與11.1 mmol/L組相比，33.3 mmol/L高糖組的NO2-含量由（5.9±1.1）μmol/L增加至（40.7±2.8）μmol/L，IL-1β的含量由（14.7±0.2）pg/ml增加至（69.4±4.6）pg/ml，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與33.3 mmol/L高糖組相比，HSYA在100、200μmol/L時(shí)，均可顯著抑制NO2-及IL-1β產(chǎn)生（P＜0.05）。200μmol/L HS-YA抑制NO2-的作用與100μmol/L相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對(duì)IL-1β的抑制作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是心腦血管疾病、腎臟疾病等多種慢性病的主要危險(xiǎn)因素。中國(guó)研究者者近期發(fā)表在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》和《美國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)雜志》上的研究顯示，我國(guó)成年人DM和DM前期的患病率近年呈不斷攀升趨勢(shì)，DM已成為影響我國(guó)居民健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一［8］。中藥在DM的治療中發(fā)揮重要作用，基于755首中藥處方治療DM用藥規(guī)律研究顯示，在DM的治療中，有3大類中藥發(fā)揮重要作用：補(bǔ)虛藥如黃芪，清熱藥如黃連，活血化瘀藥如紅花等［9］。動(dòng)物試驗(yàn)顯示，以四尿嘧啶制作DM模型，口服紅花提取物后，與格列本脲治療組無(wú)著差異，提示紅花在DM治療中具有潛力［10-11］。目前，紅花中的主要藥效物質(zhì)HSYA在治療DM及其并發(fā)癥的研究中取得了一定進(jìn)展，研究認(rèn)為，HSYA治療DM的作用與其抗炎作用相關(guān)［12-13］。

巨噬細(xì)胞參與的體內(nèi)慢性炎癥是Ⅱ型DM、動(dòng)脈粥樣硬化等代謝性疾病的共同機(jī)制［14］。研究顯示，巨噬細(xì)胞受外界微環(huán)境變化影響，可在疾病的發(fā)生發(fā)展中分別發(fā)揮促炎及抗炎作用。巨噬細(xì)胞功能上的改變與巨噬細(xì)胞極化至不同亞型相關(guān)：極化至M1型參與炎癥反應(yīng)，而極化至M2型參與抗炎過(guò)程?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，巨噬細(xì)胞M1/M2型極化失調(diào)是DM等疾病的核心發(fā)病機(jī)制［15］。進(jìn)一步研究HSYA對(duì)高糖誘導(dǎo)的M1/M2型極化失調(diào)的作用，對(duì)HSYA治療DM具有一定的臨床指導(dǎo)意義。

課題組的前期研究顯示，以0.5μg/ml LPS作用于巨噬細(xì)胞后，NO的大量產(chǎn)生與巨噬細(xì)胞極化至M1型相關(guān)［3］。本研究以LPS為模型對(duì)照，比較巨噬細(xì)胞在25.0、33.3、44.4 mmol/L等不同葡萄糖濃度時(shí)NO代謝產(chǎn)物NO2-的含量。研究結(jié)果顯示，以33.3 mmol/L高糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞，在NO2-含量顯著增加的同時(shí)，M1型極化標(biāo)志物TNF-α、iNOS的蛋白表達(dá)顯著增加，M2型極化標(biāo)志物CD206、Arg-1的蛋白表達(dá)均減少。研究同時(shí)顯示，HSYA具有體外調(diào)整高糖狀態(tài)時(shí)M1/M2型極化失調(diào)的作用，即上調(diào)保護(hù)型的M2型，并下調(diào)損傷型的M1型。

高血糖可刺激DM模型大鼠的氧自由基大量產(chǎn)生，引起細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控紊亂，DM發(fā)病過(guò)程中iNOS及TNF-α表達(dá)增加，NO產(chǎn)生增多，導(dǎo)致胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞（IMECs）受損；IMECs的損傷也是高血糖條件下促炎細(xì)胞因子IL-1β的來(lái)源［16］。課題組進(jìn)一步的研究顯示，HSYA具有體外減少高糖誘導(dǎo)的NO及IL-1β產(chǎn)生的作用。

綜上，HSYA具有調(diào)整高糖狀態(tài)時(shí)巨噬細(xì)胞M1/M2型極化失調(diào)、減少NO、IL-1β等炎癥因子生成的作用。有研究顯示，HSYA抑制炎癥反應(yīng)的作用與體內(nèi)的NF-κB信號(hào)通路相關(guān)［17］。課題組將從高糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分型，進(jìn)而影響NF-κB信號(hào)通路開展HSYA的相關(guān)體內(nèi)研究。