楊 青 周陳紅 黎 瑤 杜 飛（四川大學(xué)華西醫(yī)院金堂醫(yī)院內(nèi)分泌消化科，成都610400）

隨著我國居民生活水平的提高以及膳食結(jié)構(gòu)的改變，非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率及檢出率不斷升高［1］。NAFLD致病因素復(fù)雜，以肝細(xì)胞脂肪變性及炎癥反應(yīng)為特征［2］，可進(jìn)展為不可逆的肝損傷，嚴(yán)重者可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌［3］，對(duì)人群健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前，該病發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，研究表明氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及脂質(zhì)過氧化在NAFLD病情進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［4］。有研究指出，高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）具有膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化、抗炎等功能，載脂蛋白A-Ⅰ（apolipoprotein A-Ⅰ，apoA-Ⅰ）作為HDL中含量最多的蛋白，在HDL各項(xiàng)功能中發(fā)揮關(guān)鍵性作用［5］。apoA-Ⅰ模擬肽是一種人工合成的左旋apoA-Ⅰ模擬肽，可模擬apoA-Ⅰ功能，在感染、炎癥、心血管、代謝性等疾病中發(fā)揮保護(hù)作用［6］。但目前，apoA-Ⅰ模擬肽是否對(duì)NAFLD具有保護(hù)作用，鮮有報(bào)道。本研究通過構(gòu)建大鼠NAFLD模型，觀察其對(duì)NAFLD大鼠糖、脂質(zhì)代謝的影響及其可能的機(jī)制，以期為NAFLD的臨床治療提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠50只，6周齡，體重（200±20）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005］，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室：室溫（22±1）℃，相對(duì)濕度（55±5）%，光照12 h。自由飲水?dāng)z食。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，利用數(shù)字表隨機(jī)選取13只作為空白組，其余37只作為造模組。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 apoA-Ⅰ模擬肽由深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司合成。阿托伐他汀購自輝瑞制藥有限公司（批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20051408，片劑，規(guī)格：20 mg）。高脂飼料（在普通飼料基礎(chǔ)上，添加膽固醇2%、膽酸鈉0.5%、豬板油15%和蔗糖5%）和普通飼料購自上海帆泊生物技術(shù)有限公司。HE染色試劑購自北京中山生物技術(shù)有限公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。IL-1β、IL-6和TNF-α檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。7020型全自動(dòng)生化分析儀購自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠NAFLD模型建立及分組干預(yù) 空白組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠則給予高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)喂養(yǎng)12周，各組大鼠均未出現(xiàn)死亡。造模成功標(biāo)志［7］：各組隨機(jī)取1只大鼠，麻醉處死，肉眼觀察造模組大鼠肝臟較空白組顯著腫大且呈黃色狀（圖1），行HE染色顯示肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性，肝索紊亂，可見點(diǎn)狀壞死及炎癥細(xì)胞浸潤（圖2）。造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性藥物組和apoA-Ⅰ模擬肽組，每組12只。造模成功后，apoA-Ⅰ模擬肽組大鼠以20 mg/kg的劑量腹腔注射apoA-Ⅰ模擬肽，陽性藥物組以同樣的劑量腹腔注射阿托伐他汀，模型組和空白組腹腔注射等量的生理鹽水，1次/d，連續(xù)8周。

1.2.2 各組大鼠肝功能、血糖和血脂水平檢測(cè)于末次給藥后次日，空腹12 h，各組大鼠麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈留取血液標(biāo)本，利用全自動(dòng)生化分析儀分析血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL-C）和高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL-C）水平。

圖1 空白組和造模組大鼠肝臟大體標(biāo)本Fig.1 Liver specimens of rat in blank group and building model group

圖2 HE染色觀察空白組和造模組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化（×200）Fig.2 HE staining was used to observe histopathological changes of liver in blank group and building model group（×200）

1.2.3 HE染色觀察各組大鼠肝臟組織形態(tài) 各組隨機(jī)取6只大鼠，麻醉處死，留取肝臟組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（厚度約4μm），行HE染色，鏡下觀察。

1.2.4 ELISA檢測(cè)肝臟組織中SOD、GSH-Px、MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α的水平 各組剩余的6只大鼠，麻醉處死，留取肝臟組織，按1∶9比例加入預(yù)冷生理鹽水，勻漿，離心，留取上清液，按照ELISA法檢測(cè)肝臟組織中SOD、GSH-Px、MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α水平，檢測(cè)過程均在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室按試劑盒說明完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠肝功能、血糖和血脂水平 與空白組比較，模型組、陽性藥物組和apoA-Ⅰ模擬肽組大鼠血清ALT、AST、FBG、TC、TG和LDL-C水平升高，而HDL-C水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組和apoA-Ⅰ模擬肽組大鼠血清ALT、AST、FBG、TC、TG和LDL-C水平降低，而HDL-C水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 4組大鼠肝臟組織形態(tài) HE染色結(jié)果顯示，空白組大鼠肝組織內(nèi)肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞排列整齊，未見壞死及脂肪變性；模型組大鼠肝組織內(nèi)肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝細(xì)胞排列混亂、腫脹，可見大小不一的脂肪空泡，少量肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死及炎癥細(xì)胞浸潤；與模型組比較，陽性藥物組和apoA-Ⅰ模擬肽組大鼠肝組織內(nèi)肝小葉結(jié)構(gòu)趨于正常，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡減少，腫脹減輕，炎癥細(xì)胞減少，見圖3。

2.3 4組大鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px、MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α的水平 與空白組比較，模型組、陽性藥物組和apoA-Ⅰ模擬肽組大鼠肝臟組織中SOD和GSH-Px水平降低，而MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥物組和apoA-Ⅰ模擬肽組大鼠肝臟組織中SOD和GSH-Px水平升高，而MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 4組大鼠血清肝功能、血糖和血脂水平比較（±s，n=12）Tab.1 Comparison on liver function，blood glucose and blood lipid levels of rats among 4 groups（±s，n=12）

表1 4組大鼠血清肝功能、血糖和血脂水平比較（±s，n=12）Tab.1 Comparison on liver function，blood glucose and blood lipid levels of rats among 4 groups（±s，n=12）

Note：Compared with blank group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；compared with model group，3）P＜0.01.

HDL-C（mmol/L）2.74±0.30 0.75±0.122）1.90±0.172）3）1.71±0.232）3）176.061＜0.001 Groups Bank group Model group Positivedruggroup apoA-Ⅰmimetic peptidegroup F P ALT（U/L）20.23±4.28 86.78±7.012）48.14±12.352）3）53.12±7.062）3）132.536＜0.001 AST（U/L）66.20±8.42 124.76±15.062）82.34±10.332）3）91.00±19.742）3）36.864＜0.001 FBG（mmol/L）4.03±0.84 6.89±1.012）5.39±1.162）3）5.15±0.942）3）16.749＜0.001 TC（mmol/L）1.34±0.19 2.20±0.252）1.55±0.121）3）1.61±0.172）3）45.897＜0.001 TG（mmol/L）0.62±0.25 1.38±0.262）0.83±0.261）3）0.87±0.181）3）21.621＜0.001 LDL-C（mmol/L）0.33±0.06 0.77±0.142）0.44±0.061）3）0.49±0.142）3）35.481＜0.001

表2 4組大鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px、MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison on levels of SOD，GSH-Px，MDA，IL-1β，IL-6 and TNF-αin liver tissue of rats among 4 groups（±s，n=6）

表2 4組大鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px、MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison on levels of SOD，GSH-Px，MDA，IL-1β，IL-6 and TNF-αin liver tissue of rats among 4 groups（±s，n=6）

Note：Compared with blank group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；compared with model group，3）P＜0.01.

TNF-α（ng/L）18.11±3.60 76.16±5.372）45.04±6.092）49.54±5.592）3）123.125＜0.001 Groups Blank group Model group Positivedruggroup apoA-I mimetic peptide group F P SOD（U/ml）183.02±14.07 129.45±9.842）161.75±15.122）3）154.59±8.472）3）19.691＜0.001 GSH-Px（mmol/L）10.73±2.02 3.28±1.04 6.96±1.75 7.16±1.47 21.365＜0.001 MDA（mmol/ml）5.10±2.01 17.59±2.382）8.67±2.741）3）10.82±1.612）3）33.446＜0.001 IL-1β（ng/L）10.19±2.22 28.23±3.052）16.56±2.782）18.49±2.172）3）50.146＜0.001 IL-6（ng/L）22.86±6.01 93.33±11.522）66.69±4.962）70.79±5.392）3）93.612＜0.001

圖3 HE染色觀察4組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化（×200）Fig.3 HE staining was used to observe pathological changes of liver in 4 groups（×200）

3 討論

NAFLD是一種與過量飲酒、藥物或其他明確肝損傷因素?zé)o關(guān)，單純由于脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)過多沉積而導(dǎo)致的臨床綜合征，隨病程進(jìn)展可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化和肝癌，最終可導(dǎo)致患者死亡［8］。目前，在我國該病患病率已超過病毒性肝病而成為威脅人群健康的第一大肝病，因此，積極研發(fā)治療NAFLD的有效藥物已成為臨床研究熱點(diǎn)。

研究表明，脂質(zhì)代謝異常、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)在NAFLD發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［9-10］。本研究通過喂養(yǎng)高脂飼料建立大鼠NAFLD模型，結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組、陽性藥物組和apoA-Ⅰ模擬肽組大鼠血清ALT、AST、FBG、TC、TG和LDL-C水平升高，而HDL-C水平降低，說明NAFLD大鼠出現(xiàn)了肝功能異常及血糖、血脂代謝異常。SOD和GSH-Px作為抗氧化劑，在防御活性氧、清除自由基中發(fā)揮重要作用［11］，MDA作為一種脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物，可用來反映機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)［12］。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組、陽性藥物組和apoA-Ⅰ模擬肽組大鼠肝臟組織中SOD和GSH-Px水平降低，而MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高，說明NAFLD大鼠肝臟組織出現(xiàn)了氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，提示氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可能參與了NAFLD大鼠肝臟損傷過程。

研究發(fā)現(xiàn)，apoA-Ⅰ模擬肽作為HDL主要蛋白成分在調(diào)控機(jī)體內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、抗炎、抗氧化中發(fā)揮重要作用［13］。有研究指出，apoA-Ⅰ模擬肽可降低肥胖大鼠體質(zhì)量，減輕胰島素抵抗及炎癥反應(yīng)，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而抑制心肌重構(gòu)，改善肥胖大鼠心功能［14］。亦有研究指出，apoA-Ⅰ模擬肽可減輕H2O2誘導(dǎo)的小鼠骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷［15］。熊晨君等［16］指出，apoA-Ⅰ模擬肽可抑制NFκB通路，減少小鼠肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞因子表達(dá)，從而減輕肺組織損傷。WHITE等［17］指出，apoA-Ⅰ模擬肽可更大程度增強(qiáng)膽固醇外排。本研究結(jié)果顯示，NAFLD模型大鼠在給予apoA-Ⅰ模擬肽干預(yù)后，肝功能指標(biāo)和血糖、血脂指標(biāo)均有所改善，同時(shí)，與模型組比較，肝組織內(nèi)肝小葉結(jié)構(gòu)趨于正常，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡減少，腫脹減輕，炎癥細(xì)胞減少，這些均說明apoA-Ⅰ模擬肽可有效減少NAFLD模型大鼠肝組織損傷。與模型組比較，apoA-Ⅰ模擬肽組大鼠肝臟組織中SOD和GSH-Px水平升高，而MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低，說明apoA-Ⅰ模擬肽可減輕NAFLD模型大鼠肝臟組織的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)大鼠肝臟功能。

綜上所述，apoA-Ⅰ模擬肽可減輕NAFLD模型大鼠肝損傷，改善糖脂代謝，其機(jī)制可能與減輕肝臟氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)，但其中具體的分子機(jī)制或路徑尚待進(jìn)一步研究明確。