唐 琳 冒 靈 官 蘞 陳 靜 周 涯陳 超 郭萌萌 趙娟娟 張繼東 徐 林

（遵義醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室暨貴州省基因檢測與治療特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遵義563000）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）的一種常見類型，是胃腸道的常見炎癥疾?。?］。UC的臨床癥狀為黏液膿血便、腹痛、體重減輕、精神萎靡、四肢無力等，其長期發(fā)展將會增加結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［2-5］。UC典型的發(fā)病年齡在20至39歲之間［6］。研究表明，UC的發(fā)病率每年都在提高［7］。目前，UC的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，因此進(jìn)一步加強(qiáng)其發(fā)生機(jī)制的研究，對于認(rèn)識UC的發(fā)生機(jī)理及臨床治療新靶點(diǎn)的開發(fā)均具有重要意義。

絲裂原活化蛋白激酶4（mitogen-activated protein kinase 4，MAPK4）是非典型MAPK家族成員的分子之一，參與機(jī)體多種生理、病理過程，如免疫應(yīng)答、腫瘤生成等［8-10］。然而，MAPK4是否參與UC的發(fā)生發(fā)展仍未有研究報(bào)道。本文擬采用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）誘導(dǎo)的小鼠UC模型，觀察MAPK4敲除后對小鼠UC病理損傷的影響，為后續(xù)探討MAPK4在UC發(fā)生中的作用以及臨床治療新策略開發(fā)提供前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 7～9周齡C57BL/6的SPF級雄性WT和MAPK4 KO小鼠購自The Jackson Laboratory（027666）；光學(xué)顯微鏡（Olympus）；HE染色相關(guān)試劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；DSS（MW 36000-50000；MP Biologicals）；C1000 Thermal cycler熒光定量PCR儀、S1000 Thermal cycler PCR儀、10%SDSPAGE試劑盒、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）；RNAisoTMPlus、Prime Script RT Reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqⅡ（×2）（TaKaRa）；4%多聚甲醛、氯仿、異丙醇（重慶川東化工公司）；PCR引物（生工生物工程有限公司），序列見表1；兔抗鼠Gr-1一抗（Abcam）；DAB試劑盒、阿利新藍(lán)染色試劑盒、抗體稀釋液、甘氨酸、Tris、SDS（Solarbio）；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒（CUSABIO）；蛋白提取試劑盒（凱基生物技術(shù)股份有限公司）；3×loading buffer、DTT（Cell Signaling Technology公司）；封閉蛋白液（博士德生物工程有限公司）；PVDF膜、ECL超敏化學(xué)發(fā)光液（Merck Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立小鼠UC模型 以C57BL/6小鼠為對照組，MAPK4 KO小鼠為實(shí)驗(yàn)組，各取7～9周齡雄性小鼠（n=5），1～5 d喂養(yǎng)含有2%DSS的飲用水，6～8 d換成正常飲用水，每24 h稱重1次，記錄體重變化，觀察結(jié)腸炎癥情況，劑量參考文獻(xiàn)［11］。

1.2.2 小鼠結(jié)腸長度的測量、結(jié)腸病理組織切片染色（HE）構(gòu)建結(jié)腸炎模型后，在第8天斷頸處死兩組小鼠后取結(jié)腸組織，測量其長度并拍照用PBS緩沖溶液沖洗后放入4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)制備石蠟切片，將切片按步驟進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色后的切片。

1.2.3 小鼠結(jié)腸組織免疫熒光染色（immunofluorescence，IF）構(gòu)建結(jié)腸炎模型后，在第8天斷頸處死小鼠取結(jié)腸組織，用PBS緩沖溶液沖洗后放入4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)制備石蠟切片，封閉后，滴加免疫熒光抗體，孵育過夜，DAPI復(fù)染細(xì)胞核后脫水并封片，使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)腸組織中炎癥因子的mRNA水平 構(gòu)建結(jié)腸炎模型后，在第8天斷頸處死小鼠取結(jié)腸組織提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，Real-time PCR檢測相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況。mRNA的相對水平以對應(yīng)標(biāo)本的GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計(jì)算。引物序列見表1。

1.2.5 阿利新藍(lán)染色檢測模型小鼠結(jié)腸組織中酸性黏蛋白 石蠟切片脫蠟后，流水沖洗，加Alcian酸化液浸泡、Alcian染色液浸泡，核固紅染色液復(fù)染，脫水后，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察記錄。

1.2.6 ELISA檢測小鼠結(jié)腸組織炎癥因子的蛋白水平 取剪碎后結(jié)腸組織0.2 g加入0.2 ml PBS勻漿，離心取上清。按照試劑說明書，每孔加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，溫育甩干，加生物素標(biāo)記工作液，溫育后甩干，洗板，加HRP-標(biāo)記親和素工作液，溫育1 h洗板后加底物溶液，避光溫育加終止液后于450 nm處測吸光度值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得炎癥因子的濃度，然后分析每克腸組織中炎癥因子含量。

1.2.7 Western blot檢測小鼠結(jié)腸組織 構(gòu)建結(jié)腸炎模型后，在第8天處死小鼠取結(jié)腸組織，用PBS緩沖溶液沖洗后加入配好的Lysis Buffer，冰上裂解30 min，離心取上清至新的EP管中，BCA法檢測蛋白濃度，加入上樣緩沖液后，97℃變性10 min。經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜，洗滌，常溫孵育二抗，洗滌，將膜放入配置好的ECL發(fā)光液中，于凝膠成像系統(tǒng)曝光。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 UC模型下小鼠MAPK4表達(dá)變化 與正常小鼠相比，模型小鼠結(jié)腸組織中MAPK4表達(dá)水平明顯增加（圖1，P＜0.05）。

2.2 UC模型下小鼠體重變化 與WT小鼠相比，在造模前3天，MAPK4 KO小鼠體重變化差異不明顯，從第4天開始，MAPK4 KO小鼠體重下降明顯減輕（圖2，P＜0.05）。

2.3 UC模型下小鼠結(jié)腸長度變化 進(jìn)一步分析結(jié)腸長度變化情況，如圖3所示，MAPK4 KO模型小鼠結(jié)腸明顯長于WTUC模型小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 UC模型小鼠結(jié)腸組織病理性變化 如圖4A，HE染色結(jié)果顯示，相對于WT UC模型小鼠，MAPK4 KO模型小鼠結(jié)腸黏膜下層水腫較輕，黏膜下炎癥細(xì)胞浸潤較少。阿利新藍(lán)染色結(jié)果顯示，相對于WT UC模型小鼠，MAPK4 KO模型小鼠結(jié)腸組織中酸性黏蛋白較多（圖4B），表明MAPK4 KO模型小鼠的黏液層較厚，疾病癥狀較輕。

圖1 UC模型小鼠結(jié)腸組織中MAPK 4的表達(dá)Fig.1 Change of MAPK4 expression in colon tissue from UC mice

圖2 MAPK4敲除UC模型小鼠體重變化Fig.2 Weight change of MAPK 4 KO UC model mice

2.5 UC模型下小鼠結(jié)腸組織中性粒細(xì)胞浸潤變化 研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞參與了UC的病理過程，本研究也檢測結(jié)直腸組織中性粒細(xì)胞浸潤的情況，發(fā)現(xiàn)相對于WT UC模型小鼠，MAPK4 KO模型小鼠結(jié)腸中性粒細(xì)胞較少，見圖5。

圖3 MAPK 4敲除UC模型小鼠結(jié)腸長度變化Fig.3 Changes of colon length from MAPK 4 KO UC model mice

圖4 MAPK4敲除UC模型小鼠結(jié)腸組織病理性變化Fig.4 Pathological changes of colon tissue in MAPK 4 KO UC model mice

圖5 MAPK 4 KO模型小鼠腸組織中性粒細(xì)胞浸潤變化（×400）Fig.5 Infiltration of neutrophil in MAPK4 KO UC model mice（×400）

圖6 MAPK4敲除模型小鼠結(jié)腸組織炎癥因子表達(dá)變化Fig.6 Changes of inflammatory factors in MAPK 4 KO UC model mice

2.6 UC模型下小鼠結(jié)腸組織炎癥因子變化 與WTUC模型小鼠相比，MAPK4 KO模型小鼠的促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平明顯降低（P＜0.05），見圖6A～C；ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6D～F所示，與WT UC模型小鼠相比，MAPK4 KO模型小鼠的促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。

3 討論

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族，是一組能被多種細(xì)胞外物質(zhì)刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，參與機(jī)體多種生理病理過程［12-15］。MAPK4是非典型MAPK家族成員的分子之一，定位于18號染色體上，又稱ERK4。MAPK4參與機(jī)體多種生理、病理過程［16-18］。FENG等［19］報(bào)道在多發(fā)性骨髓瘤中，MAPK4可調(diào)控骨髓瘤發(fā)展進(jìn)程。此外，MAPK4過表達(dá)可通過非典型AKT/mTOR信號通路的激活促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［20］。然而，MAPK4在胃腸道疾病的作用及發(fā)病機(jī)制尚未有研究報(bào)道。本研究首次利用DSS誘導(dǎo)的UC模型觀察發(fā)現(xiàn)，與WT正常小鼠相比，UC模型小鼠腸組織中MAPK4表達(dá)增高；與WT UC模型小鼠相比，MAPK4 KO模型小鼠體重下降明顯減輕，結(jié)腸較長；并且，MAPK4 KO模型小鼠結(jié)腸黏膜下層水腫較輕，黏膜下炎癥細(xì)胞浸潤較少；阿利新藍(lán)染色結(jié)果進(jìn)一步顯示，MAPK4 KO模型小鼠結(jié)腸酸性黏蛋白分泌較多，表明MAPK4 KO模型小鼠的黏液層較厚，疾病癥狀較輕。類似的也有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸酸性黏蛋白分泌較多，疾病癥狀較輕，這與我們的發(fā)現(xiàn)是一致的［21-22］。

大量研究顯示包括中性粒細(xì)胞在內(nèi)的炎癥細(xì)胞和一些炎癥因子參與了UC的發(fā)生過程［23-29］。如在腸道炎癥中，IL-1β水平顯著提高，且IL-1β的水平與黏膜炎癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［30］。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MAPK4 KO模型小鼠的結(jié)腸組織中性粒細(xì)胞浸潤明顯減少；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)MAPK4 KO模型小鼠結(jié)腸組織中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)降低。PARK等［31］報(bào)道MAPK4可通過對炎癥小體NLRP3表達(dá)相關(guān)的NF-κB p65的激活影響神經(jīng)元細(xì)胞損傷和炎癥疾病的發(fā)生。此外，TOUMPANAKIS等［32］發(fā)現(xiàn)吸氣阻力呼吸（IRB）后肺中ERK1/2被激活，ERK1/2抑制劑的使用阻止了IRB中IL-1β的增加，改善了IRB 6 h后肺泡灌洗液細(xì)胞的增加，并使?jié)穹沃亓炕謴?fù)到控制值，抑制了IRB引起的肺炎癥損傷。這些結(jié)果提示MAPK4敲除減輕模型小鼠結(jié)腸炎癥，可能與炎癥細(xì)胞浸潤和炎癥因子分泌改變有關(guān)。然而，MAPK4參與UC發(fā)生的具體分子或細(xì)胞學(xué)機(jī)制仍有待后續(xù)進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)MAKP4敲除后可顯著減輕小鼠UC模型的炎癥損傷，為后續(xù)深入研究MAPK4在腸道炎癥疾病發(fā)生發(fā)展中的作用以及臨床治療新策略開發(fā)提供了重要的前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。