郭長春，朱 鵬，李鳳艷，曾啟昂△

廣東省深圳市坪山區(qū)人民醫(yī)院：1.麻醉科；2.中心實驗室,廣東深圳 518118

環(huán)狀RNAs(circRNAs)是一種內(nèi)源性非編碼RNA，不含蛋白質(zhì)編碼基因，在體內(nèi)同時調(diào)節(jié)多個基因，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、高序列保守性、豐度和特異性表達等特點[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs與癌癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和炎性感染等疾病有關(guān)[2]。circRNAs能夠抑制miRNA的表達，從而起到miRNA海綿的作用，以此來減弱miRNA調(diào)控mRNA的功能[3]。ZHAO等[4]研究發(fā)現(xiàn)，circFADS2通過調(diào)節(jié)miR-498的表達促進肺癌的發(fā)展，而circFADS2的高表達與非小細胞肺癌(NSCLC)的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化差、總生存期短有關(guān)。最近有報道顯示，circRNAs還調(diào)節(jié)或降解RNA結(jié)合蛋白，并影響RNA表達的翻譯[5]，如ZHANG等[6]發(fā)現(xiàn)，ankyrin重復(fù)結(jié)構(gòu)域52在細胞核中豐富源于基因內(nèi)含子，能積極調(diào)節(jié)RNA聚合酶Ⅱ。因此，circRNAs參與了生物的發(fā)生、發(fā)展和疾病過程，有望成為一類新的臨床生物標志物。原發(fā)性肝癌(PLC)是最常見的五大癌癥之一，全球每年大約有841 000例新發(fā)病例和782 000例死亡病例，其中大約一半發(fā)生在中國[7-8]。PLC的發(fā)展和形成機制非常復(fù)雜，早期臨床癥狀不明顯，大多數(shù)患者就診時已為中晚期，失去了最佳治療時機。有研究顯示，circRNAs可作為肝癌早期診斷和預(yù)后評估的新型生物標志物[9-10]，PLC患者外周血中circRNAs的分布如何改變，以及它們是否可用于PLC的診斷或預(yù)后評估尚不清楚。因此，本研究通過微陣列芯片技術(shù)鑒定PLC患者外周血中circRNAs表達譜的差異，結(jié)合生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其可作為PLC診斷或預(yù)后評估的潛在生物標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取深圳市某三甲醫(yī)院4例PLC患者(PLC組)和4例健康對照者(對照組)外周血。本研究經(jīng)本院倫理委員會審查批準，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 總RNA提取試劑TRIzol和用于去除線性RNA的Rnase R，以及circRNAs芯片的選擇、探針設(shè)計及數(shù)據(jù)分析等均由上海康成生物公司提供。

1.3方法 總RNA提?。悍謩e將PLC組和對照組4例受試者外周血標本混合(每份標本0.5 mL)，應(yīng)用抽提試劑TRIzol按照試劑說明分別從兩組標本中提取總RNA。使用NanoDrop ND-1000進行RNA純度和濃度測定，同時應(yīng)用標準變性凝膠電泳對RNA完整性和純度進行評估；RNA標記：使用Rnase R試劑處理RNA，富集circRNAs，然后采用Arraystar Super RNA Labeling轉(zhuǎn)錄和擴增circRNAs成熒光標記的circRNAs；芯片雜交：將上述所得circRNAs純化后在circRNAs芯片上雜交，并在Agilent雜交爐上以65 ℃孵育17 h；芯片掃描：雜交后的芯片進行洗片，最后用Agilent ScannerG2505C進行掃描。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 將芯片掃描得到的微陣列圖片導(dǎo)入Agilent Feature Extraction軟件提取原始數(shù)據(jù)，應(yīng)用R軟件包對原始數(shù)據(jù)進行歸一化處理，兩組標本間差異表達的circRNAs通過差異表達(fold change)值進行篩選。

2 結(jié) 果

2.1差異表達的circRNAs 相對于對照組，PLC組共有26種circRNAs具有fold change，其絕對值≥4.0，其中14種表達上調(diào)，12種表達下調(diào)，見表1。

表1 表達差異log值≥2.0的circRNAs

2.2生物信息學(xué)分析

2.2.1circRNAs的基因本體(GO)分析 PLC組fold change的26種circRNAs中上調(diào)的14種circRNAs的親本基因包括：NFATC3、UBQLN1、SKA3、OAT、DENND4A、MGEA5、N4BP2L2、MKLN1、RANBP9、PICALM、SPECC1；下調(diào)的12種circRNAs的親本基因包括：LRP5、FAM64A、RPS8、FLI1、PCNXL2、RPL13、LINC00340、KIF26B、WBSCR17、NUP214、GPI、GRB10。將分析得到的明顯fold change的circRNAs的親本基因從細胞組件、分子功能和生物學(xué)進程3個方面進行GO功能注釋。選擇富集程度較明顯的前10位，較為明顯的生物過程為有絲分裂紡錘體組織、核仁輸出核糖體小亞單位及細胞質(zhì)分裂的調(diào)節(jié)，較為明顯的細胞功能為核質(zhì)，較為明顯的分子功能為組蛋白絲氨酸激酶活性和轉(zhuǎn)錄因子活性。見圖1。

圖1 fold change的circRNAs GO富集分析

2.2.2基因功能(KEGG)pathway分析 進一步對有明顯差異的circRNAs的親本基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進行pathway注釋，得到差異基因參與的富集pathway term，較為明顯的離子通路為RNA轉(zhuǎn)運及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的加工，特別是在大腸癌和胰腺癌中，見圖2。

續(xù)表1 表達差異log值≥2.0的circRNA

圖2 fold change的circRNAs KEGG pathway 分析

3 討 論

PLC的惡性程度高，目前血液檢測項目血清甲胎蛋白的靈敏度不高，仍有早期肝癌漏診病例，迫切需要新的生物學(xué)診斷標志物，以提高PLC的診斷效率。有研究顯示，相對于蛋白類標志物，circRNAs在腫瘤的發(fā)展中較先出現(xiàn)，并且能夠在血清中穩(wěn)定表達，具有很好的臨床應(yīng)用前景[11]。近年來，由于生物信息學(xué)的快速發(fā)展，眾多circRNAs及其功能逐漸被發(fā)現(xiàn)，如circRNAs調(diào)節(jié)其親本基因的表達、circRNAs翻譯蛋白等[12]。

目前，對PLC發(fā)生機制的了解尚不足，以往的研究大多局限在單個基因?qū)δ[瘤的影響，事實上在肝癌的發(fā)展過程中會不斷出現(xiàn)多個基因突變和表觀遺傳學(xué)改變，并且基因之間存在相互作用，并通過調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用[13]。陳林波等[14]用R語言從肝癌芯片表達譜中篩選出fold change基因，對其進行功能注釋及通路分析，并構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，篩選出TOP2A、CENPF、ASPM等10個關(guān)鍵基因，顯示與腫瘤細胞碳代謝等通路有關(guān)，證明生物信息學(xué)能有效篩選和分析肝癌相關(guān)fold change基因。2017年白文萱等[15]應(yīng)用JMP等軟件對另一組肝癌芯片數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，除磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)在肝癌中表達上調(diào)外，MBL2、sDs、sLCOlB3、 TD02、sAA4、sPP2在肝癌中均表達下調(diào)。表明GPC3有望成為肝癌特異性的免疫治療靶點。因此，從多基因水平及它們的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析腫瘤基因表達譜，有助于更好地探索發(fā)病機制，基因芯片作為新一代高通量檢測技術(shù)，可以同時檢測上萬個基因的表達水平，是一種研究基因組和基因間相互作用的強有力的工具。

本研究將PLC患者與對照者進行比較，發(fā)現(xiàn)兩組人群中出現(xiàn)了fold change的circRNAs，同時用生物信息學(xué)技術(shù)對親本基因進行富集分析，結(jié)果顯示，fold change的circRNAs的GO term富集主要涉及轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合、RNA轉(zhuǎn)運RT等功能，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、cGMP-PKG信號通路等參與肝癌的疾病進展，其中fold change較為明顯的為NFATC3、FLI1、UBQLN1、SPECC1等親本基因。由此可見，PLC的發(fā)生和發(fā)展與基因的調(diào)控有一定關(guān)聯(lián)，可能存在新的路徑或通路。同時也從一定程度上驗證了與全基因組測序相同的結(jié)論，PLC的發(fā)病與基因調(diào)控存在一定的關(guān)聯(lián)性。迄今為止已發(fā)現(xiàn)多種基因與PLC相關(guān)，本研究也發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，PLC組Fli1呈明顯fold change。F1i1屬于Ets家族中的一個轉(zhuǎn)錄因子，參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1i1表達失衡可參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[16-17]。Fli1可能在腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因的作用，這是因為高表達的Fli1可激活Rho GTPase信號通路，最終導(dǎo)致腫瘤細胞的侵襲和遷移。王慧玲[18]應(yīng)用Western blot和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測肝癌組織和肝癌細胞株中Fli1的表達，分析其與肝癌患者臨床病理的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)li1過表達組的肝癌細胞克隆、遷移和侵襲能力均明顯增強，F(xiàn)li1敲減組情況相反，大部分細胞內(nèi)調(diào)控信號隨著肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移也發(fā)生了改變，如PI3K-AKT、Integrin及Wnt等信號通路。信號的改變說明它們在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了作用，并且Fli1在肝癌中發(fā)揮了癌基因的功能。SPECC1L蛋白是一種細胞骨架蛋白，具有3個螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域和一個鈣調(diào)蛋白結(jié)構(gòu)域，能夠同時與細胞微管蛋白及肌動微絲蛋白相互作用，具有穩(wěn)定細胞微管蛋白、參與紡錘體形成的功能，對細胞黏附發(fā)揮重要調(diào)控作用，并參與Integrin信號、PI3K-AKT及Wnt信號通路的調(diào)節(jié)。2018年中南大學(xué)湘雅醫(yī)院發(fā)明了專利 CN201810051721.3，明確了SPECC1L在治療肝癌或術(shù)后預(yù)防肝癌復(fù)發(fā)藥物中的應(yīng)用。

綜上所述，從多基因水平及它們的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析腫瘤基因表達譜有助于更好地探索PLC的發(fā)病機制，從而發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。目前缺乏對肝癌早期診斷和預(yù)后評估的新型生物標志物，因此，還需要進一步對PLC基因進行新位點鑒定，對新發(fā)現(xiàn)的相關(guān)基因及相關(guān)蛋白進行深入研究。本研究以微陣列芯片表達譜為基礎(chǔ)，通過生物信息學(xué)技術(shù)分析PLC患者外周血中fold change的circRNAs及它們的親本基因，發(fā)現(xiàn)了明顯改變的基因，但具體發(fā)病機制及親本基因參與的通路還需深入研究。