王 維，王 林

1.陜西省西安市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710003；2.陜西省西安市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710002

腸桿菌科細(xì)菌是兒童?？漆t(yī)院引起臨床感染的重要病原菌之一，有研究統(tǒng)計(jì)顯示，兒童60%的感染由革蘭陰性菌引起[1-2]。耐碳青霉烯類抗菌藥物因其抗菌譜廣且作用強(qiáng)，經(jīng)常作為強(qiáng)效β-內(nèi)酰胺類抗感染藥物治療腸桿菌感染[3]。伴隨碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用，全球耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)菌株也逐年升高，耐藥菌株對(duì)抗菌譜較窄的兒童感染的控制和治療造成諸多困難，已成為緊迫的公共衛(wèi)生問(wèn)題[4-6]。腸桿菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機(jī)制大體相同，但耐藥基因具體流行分布情況在不同種屬間仍存在差異。因此,CRE耐藥基因的鑒定及分子機(jī)制的深入研究，對(duì)臨床治療及預(yù)防耐藥菌傳播意義重大。GeneXpert分子診斷平臺(tái)是核酸提取擴(kuò)增檢測(cè)一體化系統(tǒng)，半巢式實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可快速檢測(cè)感染性疾病病原及耐藥性基因，此方法較傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)及普通 PCR 具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等特點(diǎn)。GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)現(xiàn)已應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)及CRE等耐藥基因的檢測(cè)[7]。本文采用GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)快速鑒定分析CRE的耐藥基因表型，為臨床合理用藥及科學(xué)預(yù)防控制CRE的流行提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株、儀器及試劑 選取西安市兒童醫(yī)院2017年10月至2019年10月各類標(biāo)本分離的CRE，剔除同一患者的重復(fù)菌株，共收集109株?；|(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(德國(guó)布魯克公司)；藥敏板卡AST-GN13(法國(guó)梅里埃生物制品有限公司)；瓊脂培養(yǎng)基(中國(guó)鄭州安圖生物工程股份有限公司)；GeneXpert儀器試劑(美國(guó)賽佩公司)；Vitek 2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國(guó)梅里埃生物制品有限公司)；細(xì)菌培養(yǎng)箱(日本索尼公司)。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 將收集保存于-80 ℃冰箱的菌株復(fù)蘇培養(yǎng)18～24 h后用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定；同時(shí)采用Vitek 2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果判斷參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)2019年標(biāo)準(zhǔn)，ATCC25922為質(zhì)控菌株。

1.2.2GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因 挑取單個(gè)菌落配制濃度0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海?0 μL加至GeneXpert試劑標(biāo)本處理液中，漩渦震蕩混勻，吸取1.7 mL 混合液沿管壁加入試劑盒內(nèi)，掃碼上機(jī)啟動(dòng)檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Whonet5.6軟件分析藥敏試驗(yàn)結(jié)果，其他數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CRE、標(biāo)本及科室分布情況 109株CRE以肺炎克雷伯菌最多，為57株(52.29%)，其余依次為大腸埃希菌[20株(18.35%)]、產(chǎn)酸克雷伯菌[8株(7.34%)]、奇異變形桿菌[6株(5.50%)]、陰溝腸桿菌[5株(4.59%)]、其他菌株[13株(11.93%)]。CRE標(biāo)本來(lái)源以尿液為主[39 株(35.78%)]，其次為下呼吸道標(biāo)本[32株(29.36%)]及膿液[18株(16.51%)]，以上3種標(biāo)本占所有檢出標(biāo)本的81.65%，具體標(biāo)本來(lái)源分類見(jiàn)表1。CRE在新生兒重癥醫(yī)學(xué)科及兒童重癥醫(yī)學(xué)科分離得最多,共34株，占31.19%，其他分離較多的科室依次為康復(fù)科[18株(16.51%)]、血液科[15株(13.76%)]、呼吸科[13株(11.93%)]、腎臟科[10株(9.17%)]、普外科[8株(7.34%)]。

表1 109株CRE標(biāo)本來(lái)源及構(gòu)成比

續(xù)表1 109株CRE標(biāo)本來(lái)源及構(gòu)成比

2.2CRE藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，CRE對(duì)頭孢類藥物呈高度耐藥，耐藥率>80.0%，對(duì)阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星及左氧氟沙星有相對(duì)較好的敏感性，耐藥率均<30.0%，其中阿米卡星敏感性最好，耐藥率僅為7.1%，未分離到多黏菌素耐藥的菌株，具體耐藥情況見(jiàn)表2。

表2 CRE對(duì)18種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果(%)

2.3CRE耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)共檢測(cè)了KPC、NDM、IPM-1、VIM、OXA-48等5種耐藥基因，攜帶碳青霉烯酶菌株共90株，耐藥基因檢出率分別為KPC(52.29%)、NDM(47.70%)、IMP-1(7.30%)，未發(fā)現(xiàn)VIM和OXA-48耐藥基因。僅攜帶 KPC 酶 33株(30.28%)，僅攜帶NDM 酶 31 株(28.44%)，僅攜帶 IMP-1 酶 2株(1.83%)，同時(shí)攜帶 KPC 和 NDM 酶 18 株(16.51%)，同時(shí)攜帶 KPC和 IMP-1 酶3株(2.75%)，同時(shí)攜帶IMP-1、KPC和NDM酶3株(2.75%)，未檢出VIM及OXA-48，19株菌株未檢出任何耐藥基因，總體耐藥基因檢出率為82.57%。質(zhì)控菌株ATCC25922未檢出耐藥基因。

2.4耐藥基因檢出數(shù)量與患兒預(yù)后情況分析 臨床分離耐碳青霉烯類菌株中未檢出耐藥基因，檢出1種耐藥基因及兩種及以上耐藥基因?qū)純侯A(yù)后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.235,P=0.327)，見(jiàn)表3。

表3 CRE耐藥基因檢出情況與患者預(yù)后分析(n)

3 討 論

作為社區(qū)和院內(nèi)感染的重要病原之一，CRE可引起人體多部位感染。碳青霉烯類抗菌藥物因其穩(wěn)定性高、通透性好、抗菌譜廣，在臨床應(yīng)用較多，甚至有過(guò)度治療的情況,該類藥物的不合理使用，致使CRE檢出率逐年升高[8]。本研究結(jié)果顯示，2017年10月至2019年10月西安市兒童醫(yī)院共分離出耐碳青霉烯類CRE 109株，分析不同菌種CRE構(gòu)成比，肺炎克雷伯菌最多，占52.29%，這與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致。分析西安市兒童醫(yī)院CRE標(biāo)本來(lái)源發(fā)現(xiàn)，前3位標(biāo)本類型為尿液、下呼吸道標(biāo)本及膿液。有文獻(xiàn)指出，兒童泌尿系感染較多且抗感染治療時(shí)間長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致耐藥菌株大量出現(xiàn)，此現(xiàn)象與西安市兒童醫(yī)院CRE標(biāo)本來(lái)源一致，同時(shí)呼吸道標(biāo)本及膿液送檢量多也與此兩種標(biāo)本CRE檢出率高有關(guān)[10]。

本研究結(jié)果顯示，西安市兒童醫(yī)院CRE對(duì)常用抗菌藥物呈高度耐藥(耐藥率>80.0%)，但不同于成人，兒童對(duì)左氧氟沙星、慶大霉素、阿米卡星等耐藥率較低(耐藥率<30.0%)，主要與此類藥物對(duì)兒童不良反應(yīng)大，或臨床治療較少應(yīng)用有關(guān)。分析結(jié)果提示，當(dāng)藥物缺乏或病情相對(duì)較輕時(shí)，可考慮阿米卡星等藥物經(jīng)驗(yàn)性治療。CRE對(duì)第4代頭孢菌素(頭孢吡肟)的耐藥率低于亞胺培南和美羅培南，此結(jié)果與文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道一致。此外，已對(duì)頭孢吡肟敏感菌株各試驗(yàn)環(huán)節(jié)進(jìn)行復(fù)核確認(rèn)，均未發(fā)現(xiàn)異常情況。對(duì)于此耐藥模式可能原因如下：首先，儀器檢測(cè)方法學(xué)限制，VITEK藥敏不是真正意義上的濃度梯度稀釋法，而是通過(guò)監(jiān)測(cè) 4～6個(gè)抑菌濃度點(diǎn)，由公式換算得出最小抑菌濃度(MIC)值，可能與真實(shí)MIC值不完全一致；其次，某些CRE 是各種復(fù)雜耐藥機(jī)制相互作用、制約、拮抗導(dǎo)致的結(jié)果，對(duì)體外抗菌藥物敏感并不代表臨床治療有效；最后，此耐藥模式還可能與菌株數(shù)量、本地區(qū)兒科用藥習(xí)慣、區(qū)域流行菌株不同等有一定關(guān)系。多黏菌素被認(rèn)為是治療CRE最后的“殺手锏”，西安市兒童醫(yī)院尚未分離出多黏菌素耐藥菌株。文獻(xiàn)[13]指出，聯(lián)合用藥(多黏菌素類或阿米卡星聯(lián)合碳青霉烯類抗菌藥物)對(duì)于CRE的治療效果更佳。

CRE的主要耐藥機(jī)制是攜帶產(chǎn)碳青霉烯酶基因，按β-內(nèi)酰胺酶家族Ambler分類分為A、B、D三類，A 類中最具臨床意義的酶型是 KPC,B類包括NDM、IMP-1、VIM等，D類主要為OXA-48，其中NDM基因被認(rèn)為是兒童產(chǎn)生耐碳青霉烯酶細(xì)菌的關(guān)鍵基因[5，14]。本研究借助GeneXpert檢測(cè)平臺(tái)對(duì)KPC、NDM、KPC、IPM、VIM、OXA-48等5種常見(jiàn)耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，109株CRE中耐藥基因檢出率為82.57%,其中KPC型57株、NDM型52株、IMP-1型8株，未檢出VIM和OXA-48型，KPC+NDM檢出率為16.51%，由此提示西安市兒童醫(yī)院兒童分離CRE的主要耐藥基因?yàn)镵PC和NDM，此結(jié)果與文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道一致，與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的NDM為主型存在差異。西安市兒童醫(yī)院肺炎克雷伯菌檢出率高且以KPC和NDM型為主，可能與產(chǎn)KPC-2的肺炎克雷伯菌可以克隆傳播有關(guān)，其編碼基因通過(guò)插入序列、質(zhì)粒及整合子等基因元件進(jìn)行水平傳播。文獻(xiàn)[17]報(bào)道，亞洲國(guó)家發(fā)現(xiàn)在不同大小和不相容類型的質(zhì)粒中存在的耐藥基因NDM-1基因，其可通過(guò)接合轉(zhuǎn)移在細(xì)菌間傳播，這些原因都導(dǎo)致了耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的廣泛傳播。臨床回訪發(fā)現(xiàn)，是否檢出耐藥基因及檢出耐藥基因數(shù)量與患者病情轉(zhuǎn)歸差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

CRE耐藥機(jī)制復(fù)雜，常表現(xiàn)為多重耐藥，導(dǎo)致其感染后較難治愈。本研究針對(duì)兒童臨床使用碳青霉烯類藥物抗感染較多，采用GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)快速、 準(zhǔn)確分析兒童耐碳青霉烯類CRE的基因分型及耐藥特征，以了解醫(yī)院CRE耐藥情況及耐藥機(jī)制，指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，同時(shí)注意醫(yī)院感染的預(yù)防和控制，以降低兒童耐藥菌株的傳播流行。