路明 陳哲

胃癌（Gastric cancer,GC）是消化道最常見的惡性腫瘤[1]，盡管在過去幾十年中，GC 的診斷和治療水平已有顯著提高，但仍缺乏早期診斷策略和有效的治療手段[2]。miRNA（miR）是一組保守的非編碼RNA，通常由20～22 個核苷酸組成，miR 與信使目標RNA（mRNA）的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）結(jié)合，導(dǎo)致mRNA 裂解，隨后降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯。miR 在細胞分化、增殖、凋亡及腫瘤發(fā)展和代謝中起著重要作用，可作為生物標志物[3]。因此，發(fā)現(xiàn)新的候選miR 極其重要，可能有助于降低死亡率和改善預(yù)后。越來越多的研究表明，miR 的異常表達與人類腫瘤增殖和遷移有關(guān)，miR-124-3p 在幾種人類腫瘤組織中呈低表達，而提高其表達水平能夠抑制癌細胞的增殖和侵襲[4，5]，但miR-124-3p 在GC 進展中如何特異性發(fā)揮作用目前尚不清楚。本研究旨在探討miR-124-3p 是否通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）對人胃癌細胞SGC-7901 的遷移和增殖產(chǎn)生影響，為尋找GC 治療靶點提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑人胃上皮細胞（GES-1）和人胃癌細胞（SGC-7901、MGC-803、BGC-823）購自中國科學(xué)院（上海細胞研究所）；DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone 公司；胎牛血清（FBS）購自浙江天杭生物科技股份有限公司；轉(zhuǎn)染所用試劑盒均購自上海吉瑪基因有限公司；RNA 提取試劑盒、TB Green （TM） Primix Ex Taq（TM）試劑盒、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Lipofectamin2000 購自Thermo Scientific有限公司；EMT 相關(guān)蛋白vimentin、β-actin 及兔/鼠二抗均購自武漢三鷹有限責任公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組SGC-7901 細胞中加入含15%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染對象為處于對數(shù)生長期的細胞，要求轉(zhuǎn)染時細胞融合程度達到50%。將SGC-7901 細胞分為上調(diào)組和下調(diào)組，上調(diào)組分為Control 組（Lip2000 處理SGC-7901 細胞）、mimic-NC 組（Lip2000+miR-124-3p 擬似物mimic 轉(zhuǎn)染SGC-7901 細胞）、mimic-miR-124-3p 組（Lip2000+mimic-miR-124-3p共轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞）；下調(diào)組分為Control 組（Lip2000 處理SGC-7901細胞）、inhibitor-NC 組（Lip2000+miR-124-3p擬似物inhibitor轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞）、si-miR-124-3p組（Lip2000+inhibitor-miR-124-3p共轉(zhuǎn)染SGC-7901 細胞）。轉(zhuǎn)染步驟嚴格按照說明書操作。

1.3 RNA 提取及RT-PCR 檢測取處于對數(shù)生長期的貼壁GES-1 和人胃癌（SGC-7901、MGC-803、BGC-823）細胞，用Trizol 法提取細胞總RNA。將提取的總RNA 按 RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，合成的cDNA 使用TB Green（TM） Primix Ex Taq（TM）試劑盒通過PCR 儀進行擴增檢測，以GAPDH 作為內(nèi)參檢測miR-124-3p 相對表達量，引物序列見表1。分別檢測SGC-7901 細胞上調(diào)miR-124-3p 后Control 組、mimic-NC 組、mimic-miR-124-3p 組和SGC-7901 細胞下調(diào)miR-124-3p 后Control組、inhibitor-NC 組、si-miR-124-3p 組miR-124-3p相對表達量，所有實驗均重復(fù)3 次。

1.4 MTT 法測定細胞增殖能力取上調(diào)組和下調(diào)組中各組轉(zhuǎn)染24h 的SGC-7901 細胞，以每孔細胞數(shù)1×104個接種于96 孔板，于24h 時每孔加入15μl MTT 溶液。放入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h，每孔加入150μl DMSO，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育30min，待甲臜完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm 波長處測吸光度值（A490）。實驗獨立重復(fù)3 次。

表1 PCR 擴增引物序列

1.5 Transwell 檢測細胞遷移能力取上調(diào)組和下調(diào)組中各組SGC-7901 細胞，使用無血清培養(yǎng)基將細胞以每孔1×104個重懸于小室中，37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)24h；取出小室，PBS 清洗2 次，4%多聚甲醛固定20min，結(jié)晶紫染液室溫下染色10min；PBS 清洗至溶液澄清，在200×視野下計算跨膜細胞數(shù)。實驗獨立重復(fù)3 次。

1.6 Western blot 檢測vimentin 蛋白表達分別將上調(diào)組和下調(diào)組中各組細胞裂解提取后，使用BCA 法檢測各組vimentin 蛋白表達，SDS-PAGE 上取等量蛋白樣品進行電泳，將蛋白遷移至PVDF 膜上，牛奶封閉液封閉15min，vimentin、β-actin 按1∶1 000 稀釋，4℃條件下孵育過夜。TBST 緩沖液清洗3 次，每次洗10min，二抗按1∶5 000 稀釋，室溫下孵育2h，TBST 緩沖液清洗3 次，曝光顯影。實驗獨立重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 miR-124-3p在GES-1和SGC-7901、MGC-803、BGC-823 細胞中的表達RT-PCR 實驗結(jié)果顯示，GES-1、SGC-7901、MGC-803、BGC-823 細胞miR-124-3p 相對表達量分為1.01±0.01、0.64±0.03、0.76±0.04 及0.93±0.04。與GES-1 細胞相比，胃癌細胞SGC-7901 及MGC-803 細胞中的miR-124-3p 相對表達量降低，且SGC-7901 細胞中miR-124-3p 相對表達量最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而BGC-823 細胞中miR-124-3p 相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 上調(diào)miR-124-3p 對SGC-7901 細胞遷移能力的影響Control 組、mimic-NC 組、mimic-miR-124-3p組miR-124-3p 相對表達量分為1.00±0.03、0.96±0.04、1.52±0.08。與Control 組相比，mimic-miR-124-3p 組miR-124-3p 相對表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），mimic-NC 組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。采用Transwell 檢測細胞遷移能力，mimicmiR-124-3p 組跨膜細胞數(shù)少于Control 組和mimic-NC 組，見圖1。Control 組、mimic-NC 組、mimic-miR-124-3p 組vimentin 表達量分別為1.82±0.16、1.75±0.12、0.52±0.06；與Control 組相比，mimic-miR-124-3p 組vimentin 表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），mimic-NC 組則無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見圖2。

2.3 上調(diào)miR-124-3p 對SGC-7901 細胞增殖能力的影響采用MTT 法檢測細胞存活率，Control 組、mimic-NC 組、mimic-miR-124-3p 組細胞存活率分別為（100.0±2.0）%、（100.0±2.5）%、（66.0±3.5）%。與Control 組相比，mimic-miR-124-3p 組細胞增殖能力下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），mimic-NC 組則無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

圖1 Transwell 檢測上調(diào)組細胞遷移能力

圖2 vimentin 在上調(diào)組不同組中的表達

2.4 下調(diào)miR-124-3p 對SGC-7901 細胞遷移能力的影響Control 組、inhibitor-NC 組、si-miR-124-3p 組miR-124-3p 相對表達量分為1.00±0.02、0.99±0.02、0.18±0.03。與Control 組相比，si-miR-124-3p 組miR-124-3p 相對表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），inhibitor-NC 組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。采用Transwell 檢測細胞遷移能力，si-miR-124-3p 組跨膜細胞數(shù)大于Control 組和inhibitor-NC 組，見圖3。Control 組、inhibitor-NC組、si-miR-124-3p 組vimentin 表達量分別為0.43±0.03、0.44±0.02、0.81±0.05；與Control 組相比，simiR-124-3p 組vimentin 表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），inhibitor-NC 組則無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見圖4。

圖3 Transwell 檢測下調(diào)組細胞遷移能力

圖4 vimentin 在下調(diào)組不同組中的表達

2.5 下調(diào)miR-124-3p 對SGC-7901 細胞增殖能力的影響采用MTT 法檢測細胞存活率，Control 組、inhibitor-NC 組、si-miR-124-3p 組細胞存活率分別為（100.0±1.0）%、（99.5±2.4）%、（138.4±16.8）%。與Control 組相比，si-miR-124-3p 組細胞增殖能力增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），inhibitor-NC 組則無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

3 討論

GC 是發(fā)病率較高的惡性腫瘤，據(jù)報道，僅2018年全球GC 新發(fā)病例高達103 萬例[6]，由于飲食結(jié)構(gòu)和習慣的不同，我國GC 發(fā)病率為東歐國家的2 倍[7]。我國GC 早期篩查體系尚不成熟，對于GC 的早期介入率并不高，致使5年生存率不足50%[8]。近年來，由于miR 具有較強的穩(wěn)定性和特異性，已成為GC早期診斷和預(yù)測預(yù)后的研究熱點[9]。miR 是小的非編碼RNA，會導(dǎo)致目標mRNA 的變化，并且還顯示出針對特定生物學(xué)疾?。ㄈ缥赴┑姆制诨蚪M織學(xué)類型）的差異表達。miR 作為GC 發(fā)生和轉(zhuǎn)移的調(diào)控因子和潛在生物標志物的重要性已經(jīng)得到認可[10，11]。研究中還發(fā)現(xiàn)miR 失調(diào)與GC 臨床進展密切相關(guān)，與此同時，miR 的表達譜還顯示，與正常組織相比，GC 組織中有超過100 種的miR 表達異常，越來越多的GC 相關(guān)miR（包括miR-101-3p、miR-20a、miR-10b-5p 和miR-143-5p 等）被認為是潛在的GC 生物標志物[12～14]。

miR-124-3p 與多種腫瘤相關(guān)，已有研究證實，miR-124-3p 的異常低表達與肺癌的預(yù)后相關(guān)，因此miR-124-3p 可以發(fā)揮其潛在的生物標志物作用，用于進一步風險分析[15]。另一項研究表明，miR-124-3p 的過表達抑制了乳腺癌細胞的增殖和遷移[16]。研究證實，STAT3 為miR-124-3p 下游靶基因，并且miR-124-3p 可通過負調(diào)控抑制STAT3/CCND2/MMP2 信號通路，從而抑制鼻咽癌細胞遷移和侵襲能力[17]。在GC 中miR-124-3p 的甲基化可能有助于其下調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)其調(diào)控的一些信號傳導(dǎo)途徑參與了細胞遷移和侵襲[18]。

miR-124-3p 在GC 中作用的相關(guān)研究較少，為證實miR-124-3p 對GC 細胞的影響，本研究首先應(yīng)用RT-PCR 法檢測人胃上皮細胞和3 種人胃癌細胞中miR-124-3p 的表達差異，結(jié)果顯示，miR-124-3p 在SGC-7901、MGC-803 細胞中表達水平顯著下降，其中SGC-7901 細胞中表達水平最低，因此后續(xù)實驗采用SGC-7901 細胞進行，同時推測miR-124-3p 低表達可能為GC 發(fā)展快、易轉(zhuǎn)移的重要因素。為證實這一推測，應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別上調(diào)和下調(diào)SGC-7901 細胞中miR-124-3p 表達，并采用MTT 法及Transwell 檢測SGC-7901 細胞的增殖和遷移能力。結(jié)果顯示，上調(diào)miR-124-3p 表達后SGC-7901 細胞增殖能力下降，同時遷移能力隨之降低；而下調(diào)miR-124-3p 后SGC-7901 細胞增殖能力增強，遷移能力亦隨之增強，說明miR-124-3p 與GC 細胞增殖和遷移能力有關(guān)，miR-124-3p有望成為抑制GC 進展及降低復(fù)發(fā)率的治療靶點。

目前已公認腫瘤細胞轉(zhuǎn)移是GC 患者癌癥相關(guān)死亡的主要原因[19]，EMT 是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的第一步，其在腫瘤遷移的早期階段起著重要作用[20]。研究表明，腫瘤發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移，EMT 是否被過早激活是關(guān)鍵，其特征是細胞間粘附力的喪失以及遷移的獲得，EMT 異常激活可促進肉瘤樣GC 的侵襲性發(fā)展[21]。vimentin 是維持細胞完整性的中間絲，在腫瘤組織中過表達，可驅(qū)動EMT 的發(fā)生，促進腫瘤細胞遷移、侵襲和粘附，是腫瘤細胞EMT 支架標記物之一[22，23]。為探討miR-124-3p 上調(diào)與下調(diào)對SGC-7901 細胞EMT 的影響，我們采用Western blot對vimentin 進行檢測，結(jié)果顯示上調(diào)miR-124-3p 后SGC-7901 細胞中EMT 相關(guān)蛋白vimentin 表達下降，而下調(diào)miR-124-3p 后SGC-7901 細胞中vimentin表達增加。說明miR-124-3p 在SGC-7901 細胞中低表達可能與腫瘤細胞發(fā)生EMT 相關(guān)，為促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移的原因之一，與MTT、Transwell 實驗結(jié)果相一致。

綜上所述，在胃癌細胞中miR-124-3p 的低表達可促進腫瘤細胞EMT 的發(fā)生，可能是促使腫瘤細胞增殖和發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要因素，有望成為預(yù)測GC 患者預(yù)后的腫瘤標記物之一。上調(diào)miR-124-3p 可抑制SGC-7901 細胞的增殖和遷移能力，有可能成為未來對GC 患者進行基因治療的新方向。