張曉亮 汪雷 柏新樂

隨著我國社會的老齡化日益加劇，衰老及其相關(guān)疾病成為危害人類健康的重要疾病之一。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，中國成年人糖尿病的患病率隨著年齡增加而同步升高，同時，高齡孕婦是妊娠期糖尿病的高危人群，表明衰老是糖尿病發(fā)病的危險因素[1]。胰島β細(xì)胞增殖是出生后維持胰島β細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)態(tài)的主要來源，胰島β細(xì)胞數(shù)量的絕對或相對缺乏是糖尿病的基礎(chǔ)病因[2-3]。研究顯示，小鼠及人類胰島β細(xì)胞的增殖率在出生一段時間后逐漸降低，人類胰島β細(xì)胞數(shù)量在成年后迅速下降，直到60歲以后下降幅度逐漸減小[4-6]。不僅如此，胰島β細(xì)胞在外界刺激作用下可代償性增殖，而衰老胰島β細(xì)胞雖然存在增殖潛能，但誘導(dǎo)增殖率很低[7]。因此，闡明年齡影響胰島β細(xì)胞增殖的機(jī)制、研究如何提高衰老胰島β細(xì)胞增殖能力，對衰老引起的糖尿病具有重要意義。哺乳動物肝臟中的肌醇依賴酶1α(IRE1α)作為細(xì)胞感應(yīng)機(jī)體營養(yǎng)變化的感應(yīng)分子，能激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)及Caspase-12介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡[8]。有研究結(jié)果顯示，抑制IRE1α通路可減少胰島細(xì)胞凋亡，但其在衰老影響胰島β細(xì)胞增殖中的調(diào)控作用目前尚不明確[9]。本研究通過檢測不同周齡小鼠中IRE1α/JNK信號通路的活性及胰島細(xì)胞的增殖水平，旨在探究IRE1α表達(dá)在衰老影響胰島β細(xì)胞凋亡中的作用。

材料與方法

1.材料：雄性野生型C57BL/6小鼠購自上海斯萊克實驗動物中心；IRE1α flox/flox小鼠和胰島β細(xì)胞特異性表達(dá)(RIP cre)的小鼠均由南京模式動物中心構(gòu)建；小鼠30天斷奶后均一直飼養(yǎng)在SPF級動物房中，可任意進(jìn)食及飲水；動物房保持溫度(22±2)℃，濕度(35±4)%，12小時晝夜周期(早晨7時亮燈)；動物證號：SCXK(滬)2018-002，倫理審查受理號：2018101023。胰島素試劑盒購自millipore公司(美國，貨號EZRMI-13k)；血糖儀和血糖試紙購自雅培(美國)；蛋白酶抑制劑購自Sigma-Aldrich公司(美國，貨號s193-2)。磷酸化肌醇依賴酶1α(p-IRE1α)抗體(貨號10255-1)、IRE1α抗體(貨號10124-s)、天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)抗體(貨號65432-1)、細(xì)胞周期素D2(cyclin D2)抗體(貨號23532-1)、微管蛋白(Tubulin)抗體(貨號112334-1-AP)均購自Proteintech公司(美國)。胰腺十二指腸同源盒-1(PDX-1)抗體(貨號3456-S)、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(chop)抗體(貨號2452-s)購自Cell Signaling Technology公司(美國)。

2.方法

(1)分組與模型建立：取雄性野生型C57BL/6小鼠50只；另將IRE1α flox/flox和RIP cre這兩種c57背景的小鼠交配篩選出胰島β細(xì)胞特異性敲除IRE1α的小鼠作為實驗組(IRE1α-IKO)，IRE1α flox/flox小鼠(RIP cre陰性)作為對照組(IRE1α-WT)，每組各20只。小鼠均飼養(yǎng)至8周齡開始實驗，分別飼養(yǎng)6周(14周齡)、12周(20周齡)、24周(32周齡)、36周(44周齡)、48周(56周齡)，建立不同周齡小鼠衰老模型。C57BL/6小鼠于14周齡、20周齡、32周齡、44周齡、56周齡檢測血糖、血清胰島素后處死取胰腺組織塊，于液氮中短暫保存，之后置入-80 ℃冰箱貯存用于蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測；實驗組、對照組小鼠于14周齡、20周齡、32周齡、44周齡檢測血糖、血清胰島素；56周齡時，一半進(jìn)行葡萄糖及胰島素耐量試驗，一半處死取胰腺組織塊，于液氮中短暫保存后置入-80 ℃冰箱貯存用于Western blot檢測。

(2)小鼠血糖檢測：小鼠饑餓4 h后，采用血糖儀檢測小鼠的尾尖血糖，將血滴滴在試紙上然后讀取血糖值，最后用紗布或棉球?qū)κ笪矇浩戎寡?/p>

(3)小鼠血清胰島素檢測：采用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，心臟取血后于4 ℃、以3 000 r/min離心10 min獲得血清。采用小鼠胰島素試劑盒(貨號EZRMI-13k，檢測范圍為0.2～10.0 ng/ml)通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測其血清中胰島素含量，操作如下：小鼠血清按1∶10比例稀釋，每個樣品檢測3個復(fù)孔，使用酶標(biāo)儀讀取吸光度，使用胰島素標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)品吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算血清中胰島素含量。

(4)葡萄糖及胰島素耐量試驗：小鼠饑餓16 h后進(jìn)行葡萄糖及胰島素耐量試驗，操作如下：將葡萄糖溶解于生理鹽水中，按1.5 g/kg小鼠體重的劑量進(jìn)行腹腔注射(每個周齡組6只)；將胰島素稀釋于生理鹽水中，按1 U/kg小鼠體重的劑量進(jìn)行腹腔注射(每個周齡組6只)。注射前及注射后30 min、60 min、120 min使用血糖儀測量尾靜脈血糖值。操作時保持小鼠安靜狀態(tài)，每只小鼠操作間隔保持一致。

(5)Western blot檢測p-IRE1α、IRE1α、Caspase-3、PDX-1、cyclin D2、Tubulin、chop蛋白：采用RIPA裂解液裂解胰島組織后，進(jìn)行蛋白濃度測定，再用6×上樣緩沖液制樣，上樣電泳、濾紙-凝膠-聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜-濾紙夾心轉(zhuǎn)膜。然后用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉PVDF膜1 h。封閉結(jié)束后，孵育抗體，最后加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)結(jié)合底物反應(yīng)、曝光顯影。

結(jié) 果

1.不同周齡野生型C57BL/6小鼠隨機(jī)血糖水平變化：野生型C57BL/6小鼠隨機(jī)血糖水平在32周開始明顯升高，32周齡[(8.7±0.9) mmol/L]、44周齡[(10.1±1.1) mmol/L]、56周齡[(11.7±1.8) mmol/L]與14周齡[(6.3±1.1) mmol/L]小鼠比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，20周齡[(6.4±1.2)mmol/L]與14周齡小鼠比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.不同周齡野生型C57BL/6小鼠胰島增殖/凋亡相關(guān)分子的表達(dá)水平：從32周開始，野生型C57BL/6小鼠的IRE1α磷酸化水平及Caspase-3水平均明顯高于14周齡小鼠，PDX-1和cyclin D2的表達(dá)水平明顯低于14周齡小鼠(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 不同周齡野生型C57BL/6小鼠胰島增殖/凋亡相關(guān)分子的表達(dá)水平比較

表1 不同周齡野生型C57BL/6小鼠胰島增殖/凋亡相關(guān)分子表達(dá)水平比較

3.不同周齡實驗組和對照組小鼠隨機(jī)血糖和胰島素水平比較：實驗組小鼠隨機(jī)血糖水平從32周開始明顯低于對照組(P<0.05)；實驗組小鼠血清胰島素水平從20周開始明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同周齡實驗組和對照組小鼠隨機(jī)血糖和胰島素水平比較

4.實驗組和對照組高齡小鼠糖耐量和胰島素耐量比較：選取56周齡的兩組高齡小鼠檢測糖耐量和胰島素耐量，結(jié)果顯示，實驗組小鼠在腹腔注射葡萄糖溶液的30 min、60 min、120 min后糖耐量明顯低于對照組，實驗組小鼠在腹腔注射胰島素溶液的30 min、60 min、120 min后胰島素耐量明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 實驗組和對照組高齡小鼠糖耐量和胰島素耐量比較

5.實驗組和對照組高齡小鼠胰島中增殖和凋亡相關(guān)分子表達(dá)比較：選取56周齡的兩組小鼠，檢測其胰島中cyclin D2和IRE1α信號通路下游凋亡相關(guān)分子chop的表達(dá)結(jié)果顯示，高齡實驗組小鼠cyclin D2的表達(dá)水平(1.0±0.2比2.7±0.4)較對照組明顯增加，而IRE1α信號通路下游凋亡相關(guān)分子chop表達(dá)水平(0.9±0.3比0.3±0.1)較對照組明顯降低(P<0.001)。見圖2。

圖2 實驗組和對照組高齡小鼠胰島中增殖和凋亡相關(guān)分子表達(dá)水平比較

討 論

胰島β細(xì)胞的增殖率在青少年期迅速減少，在成年期下降速度變慢，其降低幅度對老年人胰島細(xì)胞的增殖尤為重要[10]。研究表明，嚙齒動物、人類胰島β細(xì)胞的增殖速率在出生后迅速下降，而β細(xì)胞增殖速率的降低與粘附分子E-鈣粘素(E-cadherin)水平有關(guān)[11-12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，IRE1α的沉默或高表達(dá)可影響E-cadherin水平[13]。本研究通過檢測IRE1α信號分子在不同周齡小鼠胰島中的表達(dá)，并通過IRE1α胰島敲除小鼠探究相關(guān)的分子機(jī)制，結(jié)果顯示，IRE1α基因敲除小鼠胰島素水平較野生型小鼠增加，同時胰島素耐量和葡萄糖耐量改善，提示敲除IRE1α的高齡小鼠胰島β細(xì)胞功能或數(shù)量高于對照組，同時表明IRE1α信號通路可能參與調(diào)控年齡相關(guān)的胰島細(xì)胞功能或數(shù)量，抑制IRE1α功能可提高衰老β細(xì)胞應(yīng)對外界增殖刺激的增殖反應(yīng)，促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖以滿足機(jī)體對胰島素的需求。

隨著年齡增長，胰島對外部增殖信號的應(yīng)答反應(yīng)下降，即胰島細(xì)胞表現(xiàn)為年齡相關(guān)的增殖能力下降[11]。但隨著年齡增加，胰島素受體、催乳素受體及胰島β細(xì)胞增殖的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子如Foxo-1水平變化較小，表明細(xì)胞凋亡是參與調(diào)控小鼠及人的年齡相關(guān)的胰島β細(xì)胞數(shù)量的主要機(jī)制[14]。有研究結(jié)果顯示，IRE1α/JNK通路中JNK磷酸化具有促進(jìn)P21泛素化降解的作用，間接抑制P21介導(dǎo)的cyclins/cdks復(fù)合物的核轉(zhuǎn)位，導(dǎo)致cyclin D2翻譯及轉(zhuǎn)錄因子E2F激活降低，增殖減少[15]。另有研究表明，chop促發(fā)細(xì)胞凋亡的作用與其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能相關(guān)，其可誘導(dǎo)一些促凋亡蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，同時還會降低抗凋亡基因BCL2的表達(dá)，并且通過招募TRAF2激活細(xì)胞質(zhì)中的Caspase-12，觸發(fā)啟動細(xì)胞的凋亡程序[16]。

本研究結(jié)果顯示，隨著小鼠周齡增加，胰島β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷增加，IRE1α信號通路激活，提示IRE1α信號通路激活可能參與了調(diào)控胰島β細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)因子表達(dá)。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，高齡胰島β細(xì)胞IRE1α敲除小鼠(IRE1α-IKO)較野生型小鼠的血糖代謝有所改善，其PDX-1和cyclin D2表達(dá)均較野生型增多，凋亡相關(guān)因子chop表達(dá)降低。鑒于PDX-1和cyclin D2作為年齡相關(guān)胰島β細(xì)胞增殖的主要調(diào)控因子調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞細(xì)胞周期的進(jìn)程，提示IRE1α可能為β細(xì)胞年齡相關(guān)增殖下降的因子之一，IRE1α信號通路在年齡介導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

綜上所述，IRE1α信號通路激活可能參與了衰老增加胰島β細(xì)胞凋亡率的過程，即老年糖尿病的發(fā)生可能與IRE1α信號通路激活有關(guān)，而敲除IRE1α可促進(jìn)高齡小鼠胰島中增殖相關(guān)因子表達(dá)，并降低凋亡相關(guān)因子表達(dá)，改善小鼠血糖代謝，這可能為治療老年糖尿病提供新思路。