韓芳芳

黃河水利委員會黃河中心醫(yī)院，河南省鄭州市 450000

胃癌是起源于胃壁黏膜上皮的惡性腫瘤，它的發(fā)病率處于消化道惡性腫瘤的首位[1]。大部分胃癌發(fā)現(xiàn)時(shí)癌變組織已經(jīng)彌散浸潤超過黏膜下層，屬于中晚期胃癌的范疇，此時(shí)患者已錯(cuò)過實(shí)施根治性手術(shù)的黃金時(shí)期[2]。且化療帶來的不良反應(yīng)嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量，不利改善預(yù)后。因此，尋找新型的治療方案來提高治療有效率以及患者的生存率是當(dāng)務(wù)之急。當(dāng)前，使用阻斷劑對腫瘤發(fā)生發(fā)展有緊密聯(lián)系的信號傳導(dǎo)通路進(jìn)行阻斷，繼而實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤增殖生長、侵襲及轉(zhuǎn)移是腫瘤治療的熱點(diǎn)之一。有研究表明，真核起始因子4A1(eIF4A1)表達(dá)特征與胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系[3]。也有研究顯示，eIF4A1能有效結(jié)合Silvestrol，繼而影響eIF4A1的活性，但是針對胃癌的此類報(bào)道甚少[4]?；诖?，本研究探討胃癌中eIF4A1表達(dá)特征及其在胃癌細(xì)胞增殖中的作用，具示如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選擇2016年10月—2019年10月我院收治的61例胃癌患者，收集其胃癌組織以及相對應(yīng)的癌旁正常組織制作標(biāo)本，直徑為0.5cm，用10%甲醛固定。胃癌及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本均經(jīng)過病理學(xué)診斷確診。患者均知情并簽署同意書，本研究經(jīng)過醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法 (1)材料準(zhǔn)備：準(zhǔn)備SGC-7901細(xì)胞、eIF4A1、SP免疫組化試劑盒、Silvestrol。(2)eIF4A1檢測：采取免疫組化法。將胃癌組織及癌旁正常組織均切成厚度4μm的切片，置于防脫玻片上，于67℃溫度下烤片2h。進(jìn)行脫蠟和水化，將切片放入裝有沸騰的抗原修復(fù)液的燒杯中，保鮮膜封閉燒杯口，將燒杯沸水浴15min 后取出自然冷卻至室溫，完成抗原修復(fù)。PBS清洗3遍后，使用3%過氧化氫浸泡10min；使用5%馬血清室溫封閉30min。滴入1∶300稀釋的一抗eIF4A1工作液，于37℃溫度下孵育2h，使用PBS緩沖液替換一抗做陰性對照，孵育2h。用PBS 緩沖液沖洗3次。滴入1∶500的生物素標(biāo)識二抗稀釋工作液孵育。加入DAB溶液后在顯色液顯微鏡下觀察，并使用蒸餾水清洗來結(jié)束反應(yīng)。使用蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來水浸泡藍(lán)化，然后脫水、封片。免疫組化評分方法[5]：染色強(qiáng)度與染色區(qū)域的乘積。染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)：陰性0分，弱陽性1分，中等陽性2分，強(qiáng)陽性3分；染色區(qū)域分?jǐn)?shù)：<5% 0分，5%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分。胃癌組織和相對應(yīng)癌旁正常組織評分結(jié)果：0～7 分是低表達(dá)，8～12分是高表達(dá)。(3)SGC-7901細(xì)胞增殖活性及活細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測：采用CCK-8法。從-80℃超低溫冰箱中取出SGC-7901細(xì)胞，放于37℃水浴箱中解凍。取出細(xì)胞凍存管，噴灑75%酒精后放入操作臺。打開內(nèi)含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，取出4ml放于15ml離心管中，打開凍存管用3ml一次性滴管將細(xì)胞移入含4ml培養(yǎng)基的離心管中，充分打勻。將內(nèi)含細(xì)胞懸濁液15ml離心管進(jìn)行離心處理，結(jié)束后除去上清液，加入含10%的培養(yǎng)基3ml反復(fù)輕柔吹打至混勻于培養(yǎng)液中，過火細(xì)胞培養(yǎng)瓶并打開蓋子，水平放置細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用滴管吸取含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基置入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，然后再加入離心管中的細(xì)胞混液，搖勻。酒精燈過火瓶口及瓶蓋后蓋好細(xì)胞培養(yǎng)瓶，然后將其放于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至對數(shù)生長期。將各組SGC-7901細(xì)胞放于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中長到90%，上述操作離心除去上清液后加入10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基3ml，混勻后將10μl該細(xì)胞混液移入含10μl染料的PCR管中，混勻后將10μl混滴液滴到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，用Countess Ⅱ FL細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定每組活細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，用細(xì)胞培養(yǎng)基將各組細(xì)胞濃度調(diào)整為4×104個(gè)/ml。96孔板，100μl/孔，3個(gè)復(fù)孔每板每組，設(shè)5個(gè)板。將含120μg/ml的Silvestrol(于DMSO溶劑溶解)100μl細(xì)胞培養(yǎng)液作為藥物組；將0.5%DMSO的100μl細(xì)胞培養(yǎng)液作為對照組。兩組孔板均放在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育作常規(guī)培養(yǎng)。2d后將孔中原培養(yǎng)液洗凈，加90μl無血清培養(yǎng)基，檢測前加入CCK-8溶液10μl/孔，置恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)1h后，檢測450nm波長處吸光度值(OD值)表示細(xì)胞增殖能力。

1.3 評價(jià)指標(biāo) (1)免疫組化評分比較：統(tǒng)計(jì)并比較胃癌組織、癌旁組織中免疫組化評分。(2)eIF4A1表達(dá)比較：檢測后，統(tǒng)計(jì)并比較胃癌組織、癌旁組織中出現(xiàn)高表達(dá)例數(shù)。(3)SGC-7901細(xì)胞增殖活性及活細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)比較：培養(yǎng)后，比較藥物組及對照組的OD值以及細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化評分比較 胃癌組織中免疫組化評分為(9.11±0.95)分，高于癌旁組織的(7.95±0.78)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.371，P=0.000)。

2.2 eIF4A1表達(dá)比較 檢測后，胃癌組織中eIF4A1高表達(dá)率為81.97%(50/61)，高于癌旁組織的14.75%(9/61)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=55.174，P=0.000)。

2.3 SGC-7901細(xì)胞增殖活性及活細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)比較 培養(yǎng)后，藥物組中SGC-7901細(xì)胞OD值及活細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

3 討論

良性腫瘤在發(fā)展為惡性的過程中，存在兩個(gè)必備條件：(1)基因突變，即解除人體對于癌細(xì)胞生長的控制，使其能夠無限繁殖；(2)腫瘤逃逸，即腫瘤細(xì)胞擺脫人體免疫系統(tǒng)的殺傷。但是人體系統(tǒng)具備識別異己的能力，腫瘤突變產(chǎn)生新的抗原會被免疫系統(tǒng)識別、殺傷。

表1 兩組SGC-7901細(xì)胞增殖活性及活細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)比較

患者在發(fā)現(xiàn)胃癌病灶時(shí)往往已發(fā)展到中晚期，此時(shí)化療是主要治療方法，但患者會因化療產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)且耐藥率居高不下[6]。當(dāng)前，對腫瘤細(xì)胞特定靶點(diǎn)具有抑制作用的小分子靶向藥物的應(yīng)用不良反應(yīng)較輕、耐藥率低等優(yōu)勢較為明顯，已經(jīng)成為中晚期胃癌治療的一種有效手段[7-8]。真核起始因子(eIF)是一個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，能夠?qū)⒑颂求w聚集到mRNA中，產(chǎn)生預(yù)起始復(fù)合體。其中的eIF4A1是一種RNA解旋酶，能夠?qū)ο噜彽膍RNA帽子周圍的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行重塑，加速帽子依賴的mRNA翻譯。但是在翻譯的過程中避免不了出現(xiàn)失控翻譯。有研究表明，eIF4A1的過分表達(dá)會造成基因翻譯圖譜出現(xiàn)改變，和癌癥的惡性表型有著密切的關(guān)系，影響患者癌癥的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移[9]。對癌細(xì)胞內(nèi)失控的翻譯進(jìn)行有效控制能夠有效抑制癌細(xì)胞的增殖。SGC-7901細(xì)胞是胃癌細(xì)胞中的一種，該細(xì)胞能夠成功移植在免疫抑制的動(dòng)物腹腔及皮下，是一種臨床應(yīng)用范圍較廣的細(xì)胞模型[10-11]。本研究結(jié)果顯示，檢測后胃癌組織中eIF4A1高表達(dá)率高于癌旁組織，表明胃癌細(xì)胞中eIF4A1表達(dá)量高于癌旁細(xì)胞。有研究表明，Silvestrol是一種從植物中提取的抑制劑藥物，能夠和eIF4A1進(jìn)行高效的結(jié)合，繼而對eIF4A1基因的活性產(chǎn)生抑制作用[12-13]。本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)后，藥物組中SGC-7901細(xì)胞OD值及活細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于對照組，表明eIF4A1能有效結(jié)合Silvestrol，繼而影響eIF4A1的活性以及增殖能力。分析原因可能是Silvestrol作為一種抑制劑類藥物能夠有效降低阻斷SGC-7901細(xì)胞的信號傳導(dǎo)通路，繼而降低eIF4A1的活性，實(shí)現(xiàn)對腫瘤增殖生長的有效抑制[14-15]。

綜上所述，胃癌細(xì)胞中eIF4A1表達(dá)量高于癌旁細(xì)胞，eIF4A1能有效結(jié)合Silvestrol，繼而影響eIF4A1的活性以及增殖能力。