李正平 翟高杰（青海省第四人民醫(yī)院泌尿外科，西寧810000）

前列腺癌是中老年男性常見的惡性腫瘤，全球 范圍內(nèi)前列腺癌在中老年男性惡性腫瘤中發(fā)病率位居第二位，死亡率高居第五位。前列腺癌早期癥狀不明顯，患者多不知情，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)已產(chǎn)生骨轉(zhuǎn)移［1-3］。miRNA在細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用，是潛在的腫瘤標志物［4］。miR-299-5p在非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤中低表達，發(fā)揮抑癌基因作用，但其在前列腺癌中表達研究較少［5-7］。因此本研究通過探討miR-299-5p在前列腺癌中的表達情況并分析其對前列腺癌細胞生物學行為的影響，以期為前列腺癌靶向治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本與細胞 收集2016年8月至2018年10月期間本院泌尿外科手術后存檔的前列腺癌組織及對應的癌旁組織標本各42例，年齡48～75歲，平均年齡（64.5±5.8）歲。所有患者資料完整，且經(jīng)過病理證實，所選樣本立體后即刻放入液氮罐中保存，樣本采集均經(jīng)患者及直系家屬同意。其中預后良好51例，為治療后臨床癥狀緩解、病灶無進展的患者，預后不良25例，為治療后臨床癥狀為緩解或病灶有進展患者。人前列腺癌PC-3細胞（CL-0185）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑與儀器 10%胎牛血清、RP?MI1640培養(yǎng)基、胰酶購自美國Gibco公司；TRIzol抽提試劑、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA試劑盒購自BioRad公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（11668019）購自美國Invitrogen公司；miR-299-5p mimics、miR-299-5p NC購自南京銳真生物技術有限公司；CCK-8試劑盒（GK10001）購自美國GLPBIO公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（40302ES20）購自上海翊圣生物科技有限公司；Transwell相關試劑購自美國BD公司；鼠抗人一抗Ki67（14-5698-82）、Bax（MA5-13994）、Bcl-2（13-8800）、N-cadherin（33-3900）、E-cadherin（33-4000）、GAPDH（TAB1001）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠（31430）購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測前列腺癌組織及癌旁組織中miR-299-5p表達 樣本從液氮罐中取出，解凍后按照RNA提取試劑盒的操作說明術提取前列腺組織及其癌旁組織中總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1μg RNA樣本反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR儀檢測miR-299-5p表達水平。引物序列見表1。PCR反應條件為：95℃預熱5 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃20 s，循環(huán)40次，以U6為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCt法計算miR-299-5p相對表達量。

1.2.2 PC-3細胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出人前列腺癌PC-3細胞，在37℃水浴中快速溶解，溶解后在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，傳代3次后，收集對數(shù)期細胞用于實驗。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 選取1.2.2中對數(shù)生長期的PC-3細胞，按照2×105個/孔密度接種于24孔培養(yǎng)板中，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染，分別加入miR-299-5p NC（miR-299-5p NC組）和miR-299-5p mimics（miR-299-5p mimics組）與4μl Lipofectamin 2000試劑混合，靜置后加入培養(yǎng)孔，未經(jīng)處理的PC-3細胞為空白組。轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，提取總RNA及總蛋白供后續(xù)使用。

1.2.4 CCK-8法檢測PC-3細胞增殖 收集1.2.2中各組細胞，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每組設6個復孔，加入10μl CCK-8溶液，培養(yǎng)4 h后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光值，以只加培養(yǎng)基孔的OD值為空白對照調(diào)零，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=［1-（處理組OD值/未處理組OD值）］×100%。

1.2.5 流式細胞法檢測PC-3細胞凋亡 收集1.2.2中轉(zhuǎn)染細胞，經(jīng)預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，調(diào)整細胞密度為1×106個/ml，通過Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。

1.2.6 Transwell法檢測PC-3細胞侵襲遷移能力侵襲試驗：收集1.2.2中各組細胞，于上層小室平鋪100μl 1μg的Matrigel膠，37℃孵育4 h，計數(shù)，重懸。上室加入細胞懸液100μl，下室緩慢加入600μl含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，防止加入過程中產(chǎn)生大氣泡。37℃培養(yǎng)24 h。取出小室，用棉簽擦除上層小室內(nèi)的細胞和Matrigel膠，1%多聚甲醛混合固定后用0.1%結晶紫染色，用倒置顯微鏡隨機選取5個視野并拍照，進行統(tǒng)計分析。實驗重復3次，取平均值。遷移試驗除不加入Matrigel膠外，其余步驟與侵襲試驗完全相同。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.2.7 Western blot檢測PC-3細胞增殖、凋亡、侵襲相關蛋白表達 收集1.2.2中各組細胞，提取總蛋白，BCA蛋白試劑盒檢測細胞中總蛋白含量，10%SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。封閉完成后加入適宜濃度Ki67、Bax、Bcl-2、N-cadherin、E-cadherin鼠源一抗，4℃封閉過夜，24 h后吸取一抗，清洗PVDF膜，加入相應二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠）37℃封閉1 h，滴加ECL顯色液，用凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶圖片，用Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍照對蛋白質(zhì)表達量進行定量分析，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0進行數(shù)據(jù)分析，計量資料均以±s表示，多組間比較行方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用n表示，采用χ2檢驗；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-299-5p在前列腺癌及癌旁組織中表達情況 與癌旁組相比，前列腺癌組組織miR-299-5p相對表達量顯著降低（P＜0.05）。見表2。

2.2 miR-299-5p水平與前列腺癌臨床病理特征的關系 根據(jù)前列腺癌患者miR-299-5p表達水平的中位值0.46分為高表達組共25例，低表達組共51例。結果顯示miR-299-5p與患者年齡、術前PSA水平無關（P＞0.05），與患者淋巴結轉(zhuǎn)移、臨床分期、骨轉(zhuǎn)移相關、預后情況，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.3 轉(zhuǎn)染后各組PC-3細胞miR-299-5p表達 與空白組相比，陰性對照組PC-3細胞miR-299-5p相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），miR-299-5p mim?ics組PC-3細胞miR-299-5p相對表達量顯著升高（P＜0.05）；與陰性對照組相比，miR-299-5p mimics組PC-3細胞miR-299-5p相對表達量顯著升高（P＜0.05）。見表4。

2.4 miR-299-5p對PC-3細胞增殖的影響 CCK-8實驗顯示，與空白組相比，陰性對照組各時間點增殖抑制率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），miR-299-5p mimics組轉(zhuǎn)染后48 h、72 h增殖抑制率顯著升高（P＜0.05）；與陰性對照組相比，miR-299-5p mimics組轉(zhuǎn)染后48 h、72 h后增殖抑制率顯著升高（P＜0.05）。見表5。

表2 兩組組織間miR-299-5p表達情況對比（±s，n=76）Tab.2 Comparison of miR-299-5p expression in two group（±s，n=76）

表2 兩組組織間miR-299-5p表達情況對比（±s，n=76）Tab.2 Comparison of miR-299-5p expression in two group（±s，n=76）

Groups Paracancerous Prostate cancer t P miR-299-5p/U6 1.24±0.21 0.46±0.05 43.615 0.000

表3 miR-299-5p水平與前列腺癌臨床病理特征的關系Tab.3 Relationship between miR-299-5p level and clinico?pathological features of prostate cancer

表4 各組PC-3細胞miR-299-5p表達情況（±s，n=6）Tab.4 Expression of miR-299-5p in PC-3 cells of each group（±s，n=6）

表4 各組PC-3細胞miR-299-5p表達情況（±s，n=6）Tab.4 Expression of miR-299-5p in PC-3 cells of each group（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs Blank group；2）P＜0.05 vs Negativecontrol group.

Groups Blank Negative control miR-299-5p mimics F P miR-299-5p/U6 1.03±0.17 1.05±0.16 2.58±0.401）2）66.347 0.000

2.5 miR-299-5p對PC-3細胞凋亡的影響 與空白組相比，陰性對照組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），miR-299-5p mimics組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與陰性對照組相比，miR-299-5p mimics組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。見圖1、表6。

2.6 miR-299-5p對PC-3細胞侵襲遷移的影響 Tran?swell試驗顯示（圖2，表7），與空白組相比，陰性對照組PC-3細胞侵襲、遷移細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），miR-299-5p mimics組PC-3細胞侵襲遷移細胞數(shù)顯著下降（P＜0.05）；與陰性對照組相比，miR-299-5p mimics組PC-3細胞侵襲、遷移細胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）。

2.7 miR-299-5p對增殖、凋亡、侵襲遷移相關蛋白表達影響 與空白組相比，陰性對照組Ki67、Bax、Bcl-2、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），miR-299-5p mimics組Ki67、Bcl-2、N-cadherin蛋白表達顯著下降（P＜0.05），Bax、E-cad?herin蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與陰性對照組相比，miR-299-5p mimics組Ki67、Bcl-2、N-cadherin蛋白表達顯著下降（P＜0.05），Bax、E-cadherin蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。見圖3、表8。

表5 各組PC-3細胞增殖抑制率情況（±s，n=6，%）Tab.5 PC-3 cell proliferation inhibition rate in each group（±s，n=6，%）

表5 各組PC-3細胞增殖抑制率情況（±s，n=6，%）Tab.5 PC-3 cell proliferation inhibition rate in each group（±s，n=6，%）

Note：1）P＜0.05 vs Blank group；2）P＜0.05 vs Negativecontrol group.

Groups Blank Negative control miR-299-5p mimics F P 24 h 14.52±2.07 14.27±2.03 14.85±2.12 0.118 0.889 48 h 18.79±2.68 17.92±2.56 28.53±4.071）2）20.603 0.000 72 h 25.61±3.65 25.99±3.71 49.87±7.121）2）44.700 0.000

圖1 各組細胞凋亡情況Fig.1 Cell apoptosis in each group

表6 各組細胞凋亡率比較（±s，n=6，%）Tab.6 Comparison of apoptosis rate in each group（±s，n=6，%）

表6 各組細胞凋亡率比較（±s，n=6，%）Tab.6 Comparison of apoptosis rate in each group（±s，n=6，%）

Note：1）P＜0.05 vs Blank group；2）P＜0.05 vs Negativecontrol group.

Groups Blank Negative control miR-299-5p mimics F P Apoptosis rate 13.28±2.12 13.95±2.09 21.37±3.841）2）15.370 0.000

圖2 各組PC-3細胞侵襲、遷移能力（×200）Fig.2 Invasion and migration ability of PC-3 cells in each group（×200）

表7 各組PC-3細胞侵襲、遷移細胞數(shù)比較（±s，n=6）Tab.7 Comparison of PC-3 cell invasion and migration in each group（±s，n=6）

表7 各組PC-3細胞侵襲、遷移細胞數(shù)比較（±s，n=6）Tab.7 Comparison of PC-3 cell invasion and migration in each group（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs blank group；2）P＜0.05 vs Negative control group.

Groups Blank Negativecontrol miR-299-5p mimics F P Number of invasive cells 345.71±49.38 358.88±51.26 126.85±18.121）2）56.677 0.000 Number of migrating cells 476.54±68.07 482.97±68.99 205.79±29.391）2）43.924 0.000

圖3 各組PC-3細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移相關蛋白表達情況Fig.3 Expressionsof PC-3 cell proliferation，apoptosis，in?vasion and migration related proteinsin each group

表8 各組PC-3細胞增殖、凋亡、侵襲遷移相關蛋白表達比較（±s，n=6）Tab.8 Expression comparison of PC-3 cell proliferation，apoptosis，invasion and migration related proteins in each group（±s，n=6）

表8 各組PC-3細胞增殖、凋亡、侵襲遷移相關蛋白表達比較（±s，n=6）Tab.8 Expression comparison of PC-3 cell proliferation，apoptosis，invasion and migration related proteins in each group（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs Blank group；2）P＜0.05 vs Negative control group.

Groups Blank Negativecontrol miR-299-5p mimics F P Ki67 0.45±0.06 0.43±0.06 0.29±0.041）2）15.545 0.000 Bax 0.18±0.02 0.20±0.03 0.32±0.041）2）35.586 0.000 Bcl-2 0.53±0.07 0.54±0.08 0.43±0.061）2）4.470 0.030 N-cadherin 0.45±0.06 0.45±0.06 0.30±0.041）2）15.341 0.000 E-cadherin 0.37±0.05 0.38±0.05 0.52±0.071）2）12.788 0.001

3 討論

差異性基因表達對于預測腫瘤發(fā)生及治療疾病具有一定指導意義。miR-299-5p定位于14q32.31，具有重要調(diào)控功能。LIU等［8］研究顯示，子宮內(nèi)膜癌中miR-299表達下調(diào)，是患者不良預后的獨立風險因子。ZHENG等［9］研究表明miR-299在肺癌中低表達，且通過靶向ABCE 1促進對阿霉素的敏感性。PENG等［10］研究顯示，miR-299-5p通過MAPK/ERK信號通路抑制膠質(zhì)母腫瘤細胞增殖。相關研究顯示miR-299-5p在胃腺癌、結直腸癌、鼻咽癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌基因功能［11-13］。但其在前列腺癌中研究較少。本研究中，前列腺癌組織中miR-299-5p表達較癌旁組織低，與其他惡性腫瘤中表達趨勢一致，提示miR-299-5p表達與前列腺癌的發(fā)生有關，miR-299-5p可能在前列腺癌中也發(fā)揮抑癌基因作用。本研究還發(fā)現(xiàn)有淋巴結轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、臨床分期高、預后不良患者中miR-299-5p低表達者比例高于miR-299-5p高表達者，提示miR-299-5p表達與前列腺癌患者病理嚴重程度有關，miR-299-5p低表達可能促進前列腺癌惡性轉(zhuǎn)化過程。

腫瘤細胞通常具有增殖、凋亡能力異常，侵襲遷移能力增強等特征［14］。腫瘤的發(fā)生與癌基因及抑癌基因的失調(diào)密切相關［15］。為進一步檢測miR-299-5p對前列腺癌細胞生物學功能的影響，本研究將miR-299-5p mimics轉(zhuǎn)染至人前列腺癌PC-3細胞進行探討，結果發(fā)現(xiàn)miR-299-5p mimics組細胞增殖、侵襲遷移能力顯著低于空白組及陰性轉(zhuǎn)染組，而細胞凋亡比例顯著高于空白組及陰性轉(zhuǎn)染組。以上實驗結果提示miR-299-5p過表達可抑制PC-3細胞增殖，促進PC-3細胞凋亡，進一步提示miR-299-5p在前列腺癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用。Ki67是增殖細胞相關的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關，表達量越高，腫瘤生長速度越快，組織分化越差，是腫瘤細胞異常增殖的重要指標［16］。Bax、Bcl-2具有同源性，均屬于Bcl-2基因家族，Bax主要發(fā)揮促凋亡作用，Bcl-2發(fā)揮抑制凋亡作用［17］。腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的早期階段，EMT發(fā)生過程中，上皮細胞標志物E-cadherin表達下調(diào)，而間質(zhì)細胞標志物N-cadherin表達顯著上調(diào)，這些基因表達受多種遺傳學及表觀遺傳學因素調(diào)控［18-19］。王瑾等［20］研究顯示，miR-299-5p過表達可抑制舌鱗狀細胞癌EMT進展，抑制細胞侵襲遷移能力。本研究中miR-299-5p mimics組Ki67、Bcl-2、N-cadherin蛋白表達較空白組與陰性對照組降低，Bax、E-cad?herin蛋白表達則相反，進一步提示miR-299-5p過表達可抑制PC-3細胞增殖、侵襲、遷移相關蛋白表達，促進PC-3細胞凋亡相關蛋白表達，但其發(fā)揮作用的具體機制本研究未做探討。

綜上所述，miR-299-5p在前列腺癌組織中低表達，與淋巴結轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、臨床分期等臨床病理特征密切相關，miR-299-5p過表達可抑制PC-3增殖、侵襲與遷移，促進凋亡，可能成為治療前列腺癌潛在靶點。但本研究也存在一定不足，有關miR-299-5p在前列腺癌中的作用機制有待進一步探討。