李正平 翟高杰（青海省第四人民醫(yī)院泌尿外科，西寧810000）

前列腺癌是中老年男性常見的惡性腫瘤，全球 范圍內(nèi)前列腺癌在中老年男性惡性腫瘤中發(fā)病率位居第二位，死亡率高居第五位。前列腺癌早期癥狀不明顯，患者多不知情，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)已產(chǎn)生骨轉(zhuǎn)移［1-3］。miRNA在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用，是潛在的腫瘤標(biāo)志物［4］。miR-299-5p在非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤中低表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因作用，但其在前列腺癌中表達(dá)研究較少［5-7］。因此本研究通過探討miR-299-5p在前列腺癌中的表達(dá)情況并分析其對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以期為前列腺癌靶向治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本與細(xì)胞 收集2016年8月至2018年10月期間本院泌尿外科手術(shù)后存檔的前列腺癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本各42例，年齡48～75歲，平均年齡（64.5±5.8）歲。所有患者資料完整，且經(jīng)過病理證實(shí)，所選樣本立體后即刻放入液氮罐中保存，樣本采集均經(jīng)患者及直系家屬同意。其中預(yù)后良好51例，為治療后臨床癥狀緩解、病灶無進(jìn)展的患者，預(yù)后不良25例，為治療后臨床癥狀為緩解或病灶有進(jìn)展患者。人前列腺癌PC-3細(xì)胞（CL-0185）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 10%胎牛血清、RP?MI1640培養(yǎng)基、胰酶購自美國(guó)Gibco公司；TRIzol抽提試劑、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA試劑盒購自BioRad公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（11668019）購自美國(guó)Invitrogen公司；miR-299-5p mimics、miR-299-5p NC購自南京銳真生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒（GK10001）購自美國(guó)GLPBIO公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（40302ES20）購自上海翊圣生物科技有限公司；Transwell相關(guān)試劑購自美國(guó)BD公司；鼠抗人一抗Ki67（14-5698-82）、Bax（MA5-13994）、Bcl-2（13-8800）、N-cadherin（33-3900）、E-cadherin（33-4000）、GAPDH（TAB1001）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠（31430）購自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測(cè)前列腺癌組織及癌旁組織中miR-299-5p表達(dá) 樣本從液氮罐中取出，解凍后按照RNA提取試劑盒的操作說明術(shù)提取前列腺組織及其癌旁組織中總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1μg RNA樣本反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR儀檢測(cè)miR-299-5p表達(dá)水平。引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)熱5 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃20 s，循環(huán)40次，以U6為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCt法計(jì)算miR-299-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 PC-3細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出人前列腺癌PC-3細(xì)胞，在37℃水浴中快速溶解，溶解后在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，傳代3次后，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選取1.2.2中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3細(xì)胞，按照2×105個(gè)/孔密度接種于24孔培養(yǎng)板中，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別加入miR-299-5p NC（miR-299-5p NC組）和miR-299-5p mimics（miR-299-5p mimics組）與4μl Lipofectamin 2000試劑混合，靜置后加入培養(yǎng)孔，未經(jīng)處理的PC-3細(xì)胞為空白組。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，提取總RNA及總蛋白供后續(xù)使用。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)PC-3細(xì)胞增殖 收集1.2.2中各組細(xì)胞，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，加入10μl CCK-8溶液，培養(yǎng)4 h后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光值，以只加培養(yǎng)基孔的OD值為空白對(duì)照調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=［1-（處理組OD值/未處理組OD值）］×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞法檢測(cè)PC-3細(xì)胞凋亡 收集1.2.2中轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，通過Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Transwell法檢測(cè)PC-3細(xì)胞侵襲遷移能力侵襲試驗(yàn)：收集1.2.2中各組細(xì)胞，于上層小室平鋪100μl 1μg的Matrigel膠，37℃孵育4 h，計(jì)數(shù)，重懸。上室加入細(xì)胞懸液100μl，下室緩慢加入600μl含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，防止加入過程中產(chǎn)生大氣泡。37℃培養(yǎng)24 h。取出小室，用棉簽擦除上層小室內(nèi)的細(xì)胞和Matrigel膠，1%多聚甲醛混合固定后用0.1%結(jié)晶紫染色，用倒置顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野并拍照，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。遷移試驗(yàn)除不加入Matrigel膠外，其余步驟與侵襲試驗(yàn)完全相同。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.2.7 Western blot檢測(cè)PC-3細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá) 收集1.2.2中各組細(xì)胞，提取總蛋白，BCA蛋白試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中總蛋白含量，10%SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。封閉完成后加入適宜濃度Ki67、Bax、Bcl-2、N-cadherin、E-cadherin鼠源一抗，4℃封閉過夜，24 h后吸取一抗，清洗PVDF膜，加入相應(yīng)二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠）37℃封閉1 h，滴加ECL顯色液，用凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶圖片，用Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍照對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行定量分析，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料均以±s表示，多組間比較行方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用n表示，采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-299-5p在前列腺癌及癌旁組織中表達(dá)情況 與癌旁組相比，前列腺癌組組織miR-299-5p相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。見表2。

2.2 miR-299-5p水平與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)前列腺癌患者miR-299-5p表達(dá)水平的中位值0.46分為高表達(dá)組共25例，低表達(dá)組共51例。結(jié)果顯示miR-299-5p與患者年齡、術(shù)前PSA水平無關(guān)（P＞0.05），與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、骨轉(zhuǎn)移相關(guān)、預(yù)后情況，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.3 轉(zhuǎn)染后各組PC-3細(xì)胞miR-299-5p表達(dá) 與空白組相比，陰性對(duì)照組PC-3細(xì)胞miR-299-5p相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），miR-299-5p mim?ics組PC-3細(xì)胞miR-299-5p相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與陰性對(duì)照組相比，miR-299-5p mimics組PC-3細(xì)胞miR-299-5p相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。見表4。

2.4 miR-299-5p對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，與空白組相比，陰性對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)增殖抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），miR-299-5p mimics組轉(zhuǎn)染后48 h、72 h增殖抑制率顯著升高（P＜0.05）；與陰性對(duì)照組相比，miR-299-5p mimics組轉(zhuǎn)染后48 h、72 h后增殖抑制率顯著升高（P＜0.05）。見表5。

表2 兩組組織間miR-299-5p表達(dá)情況對(duì)比（±s，n=76）Tab.2 Comparison of miR-299-5p expression in two group（±s，n=76）

表2 兩組組織間miR-299-5p表達(dá)情況對(duì)比（±s，n=76）Tab.2 Comparison of miR-299-5p expression in two group（±s，n=76）

Groups Paracancerous Prostate cancer t P miR-299-5p/U6 1.24±0.21 0.46±0.05 43.615 0.000

表3 miR-299-5p水平與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.3 Relationship between miR-299-5p level and clinico?pathological features of prostate cancer

表4 各組PC-3細(xì)胞miR-299-5p表達(dá)情況（±s，n=6）Tab.4 Expression of miR-299-5p in PC-3 cells of each group（±s，n=6）

表4 各組PC-3細(xì)胞miR-299-5p表達(dá)情況（±s，n=6）Tab.4 Expression of miR-299-5p in PC-3 cells of each group（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs Blank group；2）P＜0.05 vs Negativecontrol group.

Groups Blank Negative control miR-299-5p mimics F P miR-299-5p/U6 1.03±0.17 1.05±0.16 2.58±0.401）2）66.347 0.000

2.5 miR-299-5p對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響 與空白組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），miR-299-5p mimics組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與陰性對(duì)照組相比，miR-299-5p mimics組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。見圖1、表6。

2.6 miR-299-5p對(duì)PC-3細(xì)胞侵襲遷移的影響 Tran?swell試驗(yàn)顯示（圖2，表7），與空白組相比，陰性對(duì)照組PC-3細(xì)胞侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），miR-299-5p mimics組PC-3細(xì)胞侵襲遷移細(xì)胞數(shù)顯著下降（P＜0.05）；與陰性對(duì)照組相比，miR-299-5p mimics組PC-3細(xì)胞侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）。

2.7 miR-299-5p對(duì)增殖、凋亡、侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)影響 與空白組相比，陰性對(duì)照組Ki67、Bax、Bcl-2、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），miR-299-5p mimics組Ki67、Bcl-2、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05），Bax、E-cad?herin蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與陰性對(duì)照組相比，miR-299-5p mimics組Ki67、Bcl-2、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05），Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。見圖3、表8。

表5 各組PC-3細(xì)胞增殖抑制率情況（±s，n=6，%）Tab.5 PC-3 cell proliferation inhibition rate in each group（±s，n=6，%）

表5 各組PC-3細(xì)胞增殖抑制率情況（±s，n=6，%）Tab.5 PC-3 cell proliferation inhibition rate in each group（±s，n=6，%）

Note：1）P＜0.05 vs Blank group；2）P＜0.05 vs Negativecontrol group.

Groups Blank Negative control miR-299-5p mimics F P 24 h 14.52±2.07 14.27±2.03 14.85±2.12 0.118 0.889 48 h 18.79±2.68 17.92±2.56 28.53±4.071）2）20.603 0.000 72 h 25.61±3.65 25.99±3.71 49.87±7.121）2）44.700 0.000

圖1 各組細(xì)胞凋亡情況Fig.1 Cell apoptosis in each group

表6 各組細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=6，%）Tab.6 Comparison of apoptosis rate in each group（±s，n=6，%）

表6 各組細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=6，%）Tab.6 Comparison of apoptosis rate in each group（±s，n=6，%）

Note：1）P＜0.05 vs Blank group；2）P＜0.05 vs Negativecontrol group.

Groups Blank Negative control miR-299-5p mimics F P Apoptosis rate 13.28±2.12 13.95±2.09 21.37±3.841）2）15.370 0.000

圖2 各組PC-3細(xì)胞侵襲、遷移能力（×200）Fig.2 Invasion and migration ability of PC-3 cells in each group（×200）

表7 各組PC-3細(xì)胞侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)比較（±s，n=6）Tab.7 Comparison of PC-3 cell invasion and migration in each group（±s，n=6）

表7 各組PC-3細(xì)胞侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)比較（±s，n=6）Tab.7 Comparison of PC-3 cell invasion and migration in each group（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs blank group；2）P＜0.05 vs Negative control group.

Groups Blank Negativecontrol miR-299-5p mimics F P Number of invasive cells 345.71±49.38 358.88±51.26 126.85±18.121）2）56.677 0.000 Number of migrating cells 476.54±68.07 482.97±68.99 205.79±29.391）2）43.924 0.000

圖3 各組PC-3細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.3 Expressionsof PC-3 cell proliferation，apoptosis，in?vasion and migration related proteinsin each group

表8 各組PC-3細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.8 Expression comparison of PC-3 cell proliferation，apoptosis，invasion and migration related proteins in each group（±s，n=6）

表8 各組PC-3細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）Tab.8 Expression comparison of PC-3 cell proliferation，apoptosis，invasion and migration related proteins in each group（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs Blank group；2）P＜0.05 vs Negative control group.

Groups Blank Negativecontrol miR-299-5p mimics F P Ki67 0.45±0.06 0.43±0.06 0.29±0.041）2）15.545 0.000 Bax 0.18±0.02 0.20±0.03 0.32±0.041）2）35.586 0.000 Bcl-2 0.53±0.07 0.54±0.08 0.43±0.061）2）4.470 0.030 N-cadherin 0.45±0.06 0.45±0.06 0.30±0.041）2）15.341 0.000 E-cadherin 0.37±0.05 0.38±0.05 0.52±0.071）2）12.788 0.001

3 討論

差異性基因表達(dá)對(duì)于預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)生及治療疾病具有一定指導(dǎo)意義。miR-299-5p定位于14q32.31，具有重要調(diào)控功能。LIU等［8］研究顯示，子宮內(nèi)膜癌中miR-299表達(dá)下調(diào)，是患者不良預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。ZHENG等［9］研究表明miR-299在肺癌中低表達(dá)，且通過靶向ABCE 1促進(jìn)對(duì)阿霉素的敏感性。PENG等［10］研究顯示，miR-299-5p通過MAPK/ERK信號(hào)通路抑制膠質(zhì)母腫瘤細(xì)胞增殖。相關(guān)研究顯示miR-299-5p在胃腺癌、結(jié)直腸癌、鼻咽癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌基因功能［11-13］。但其在前列腺癌中研究較少。本研究中，前列腺癌組織中miR-299-5p表達(dá)較癌旁組織低，與其他惡性腫瘤中表達(dá)趨勢(shì)一致，提示miR-299-5p表達(dá)與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)，miR-299-5p可能在前列腺癌中也發(fā)揮抑癌基因作用。本研究還發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、臨床分期高、預(yù)后不良患者中miR-299-5p低表達(dá)者比例高于miR-299-5p高表達(dá)者，提示miR-299-5p表達(dá)與前列腺癌患者病理嚴(yán)重程度有關(guān)，miR-299-5p低表達(dá)可能促進(jìn)前列腺癌惡性轉(zhuǎn)化過程。

腫瘤細(xì)胞通常具有增殖、凋亡能力異常，侵襲遷移能力增強(qiáng)等特征［14］。腫瘤的發(fā)生與癌基因及抑癌基因的失調(diào)密切相關(guān)［15］。為進(jìn)一步檢測(cè)miR-299-5p對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，本研究將miR-299-5p mimics轉(zhuǎn)染至人前列腺癌PC-3細(xì)胞進(jìn)行探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-299-5p mimics組細(xì)胞增殖、侵襲遷移能力顯著低于空白組及陰性轉(zhuǎn)染組，而細(xì)胞凋亡比例顯著高于空白組及陰性轉(zhuǎn)染組。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-299-5p過表達(dá)可抑制PC-3細(xì)胞增殖，促進(jìn)PC-3細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步提示miR-299-5p在前列腺癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用。Ki67是增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，表達(dá)量越高，腫瘤生長(zhǎng)速度越快，組織分化越差，是腫瘤細(xì)胞異常增殖的重要指標(biāo)［16］。Bax、Bcl-2具有同源性，均屬于Bcl-2基因家族，Bax主要發(fā)揮促凋亡作用，Bcl-2發(fā)揮抑制凋亡作用［17］。腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的早期階段，EMT發(fā)生過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)顯著上調(diào)，這些基因表達(dá)受多種遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)因素調(diào)控［18-19］。王瑾等［20］研究顯示，miR-299-5p過表達(dá)可抑制舌鱗狀細(xì)胞癌EMT進(jìn)展，抑制細(xì)胞侵襲遷移能力。本研究中miR-299-5p mimics組Ki67、Bcl-2、N-cadherin蛋白表達(dá)較空白組與陰性對(duì)照組降低，Bax、E-cad?herin蛋白表達(dá)則相反，進(jìn)一步提示miR-299-5p過表達(dá)可抑制PC-3細(xì)胞增殖、侵襲、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)PC-3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制本研究未做探討。

綜上所述，miR-299-5p在前列腺癌組織中低表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、臨床分期等臨床病理特征密切相關(guān)，miR-299-5p過表達(dá)可抑制PC-3增殖、侵襲與遷移，促進(jìn)凋亡，可能成為治療前列腺癌潛在靶點(diǎn)。但本研究也存在一定不足，有關(guān)miR-299-5p在前列腺癌中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。