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        miR-299-5p在前列腺癌中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞生物行為學(xué)的影響

        2021-05-25 10:25:14李正平翟高杰青海省第四人民醫(yī)院泌尿外科西寧810000
        中國(guó)免疫學(xué)雜志 2021年9期
        關(guān)鍵詞:癌基因抑制率前列腺癌

        李正平 翟高杰(青海省第四人民醫(yī)院泌尿外科,西寧810000)

        前列腺癌是中老年男性常見的惡性腫瘤,全球 范圍內(nèi)前列腺癌在中老年男性惡性腫瘤中發(fā)病率位居第二位,死亡率高居第五位。前列腺癌早期癥狀不明顯,患者多不知情,一經(jīng)發(fā)現(xiàn),多數(shù)已產(chǎn)生骨轉(zhuǎn)移[1-3]。miRNA在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用,是潛在的腫瘤標(biāo)志物[4]。miR-299-5p在非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤中低表達(dá),發(fā)揮抑癌基因作用,但其在前列腺癌中表達(dá)研究較少[5-7]。因此本研究通過探討miR-299-5p在前列腺癌中的表達(dá)情況并分析其對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,以期為前列腺癌靶向治療提供新的依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 組織標(biāo)本與細(xì)胞 收集2016年8月至2018年10月期間本院泌尿外科手術(shù)后存檔的前列腺癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本各42例,年齡48~75歲,平均年齡(64.5±5.8)歲。所有患者資料完整,且經(jīng)過病理證實(shí),所選樣本立體后即刻放入液氮罐中保存,樣本采集均經(jīng)患者及直系家屬同意。其中預(yù)后良好51例,為治療后臨床癥狀緩解、病灶無進(jìn)展的患者,預(yù)后不良25例,為治療后臨床癥狀為緩解或病灶有進(jìn)展患者。人前列腺癌PC-3細(xì)胞(CL-0185)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

        1.1.2 主要試劑與儀器 10%胎牛血清、RP?MI1640培養(yǎng)基、胰酶購自美國(guó)Gibco公司;TRIzol抽提試劑、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA試劑盒購自BioRad公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(11668019)購自美國(guó)Invitrogen公司;miR-299-5p mimics、miR-299-5p NC購自南京銳真生物技術(shù)有限公司;CCK-8試劑盒(GK10001)購自美國(guó)GLPBIO公司;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(40302ES20)購自上海翊圣生物科技有限公司;Transwell相關(guān)試劑購自美國(guó)BD公司;鼠抗人一抗Ki67(14-5698-82)、Bax(MA5-13994)、Bcl-2(13-8800)、N-cadherin(33-3900)、E-cadherin(33-4000)、GAPDH(TAB1001)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠(31430)購自美國(guó)Invitrogen公司。

        1.2 方法

        1.2.1 qRT-PCR檢測(cè)前列腺癌組織及癌旁組織中miR-299-5p表達(dá) 樣本從液氮罐中取出,解凍后按照RNA提取試劑盒的操作說明術(shù)提取前列腺組織及其癌旁組織中總RNA,通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1μg RNA樣本反轉(zhuǎn)錄為cDNA,qRT-PCR儀檢測(cè)miR-299-5p表達(dá)水平。引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)熱5 min,95℃30 s,55℃30 s,72℃20 s,循環(huán)40次,以U6為內(nèi)參基因,通過2-ΔΔCt法計(jì)算miR-299-5p相對(duì)表達(dá)量。

        1.2.2 PC-3細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出人前列腺癌PC-3細(xì)胞,在37℃水浴中快速溶解,溶解后在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),傳代3次后,收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

        1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選取1.2.2中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3細(xì)胞,按照2×105個(gè)/孔密度接種于24孔培養(yǎng)板中,按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分別加入miR-299-5p NC(miR-299-5p NC組)和miR-299-5p mimics(miR-299-5p mimics組)與4μl Lipofectamin 2000試劑混合,靜置后加入培養(yǎng)孔,未經(jīng)處理的PC-3細(xì)胞為空白組。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞,提取總RNA及總蛋白供后續(xù)使用。

        1.2.4 CCK-8法檢測(cè)PC-3細(xì)胞增殖 收集1.2.2中各組細(xì)胞,分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,加入10μl CCK-8溶液,培養(yǎng)4 h后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光值,以只加培養(yǎng)基孔的OD值為空白對(duì)照調(diào)零,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(處理組OD值/未處理組OD值)]×100%。

        1.2.5 流式細(xì)胞法檢測(cè)PC-3細(xì)胞凋亡 收集1.2.2中轉(zhuǎn)染細(xì)胞,經(jīng)預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml,通過Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

        1.2.6 Transwell法檢測(cè)PC-3細(xì)胞侵襲遷移能力侵襲試驗(yàn):收集1.2.2中各組細(xì)胞,于上層小室平鋪100μl 1μg的Matrigel膠,37℃孵育4 h,計(jì)數(shù),重懸。上室加入細(xì)胞懸液100μl,下室緩慢加入600μl含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基,防止加入過程中產(chǎn)生大氣泡。37℃培養(yǎng)24 h。取出小室,用棉簽擦除上層小室內(nèi)的細(xì)胞和Matrigel膠,1%多聚甲醛混合固定后用0.1%結(jié)晶紫染色,用倒置顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野并拍照,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。遷移試驗(yàn)除不加入Matrigel膠外,其余步驟與侵襲試驗(yàn)完全相同。

        表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

        1.2.7 Western blot檢測(cè)PC-3細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá) 收集1.2.2中各組細(xì)胞,提取總蛋白,BCA蛋白試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中總蛋白含量,10%SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。封閉完成后加入適宜濃度Ki67、Bax、Bcl-2、N-cadherin、E-cadherin鼠源一抗,4℃封閉過夜,24 h后吸取一抗,清洗PVDF膜,加入相應(yīng)二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠)37℃封閉1 h,滴加ECL顯色液,用凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶圖片,用Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍照對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行定量分析,以GAPDH為內(nèi)參。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料均以±s表示,多組間比較行方差分析,兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用n表示,采用χ2檢驗(yàn);P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 miR-299-5p在前列腺癌及癌旁組織中表達(dá)情況 與癌旁組相比,前列腺癌組組織miR-299-5p相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表2。

        2.2 miR-299-5p水平與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)前列腺癌患者miR-299-5p表達(dá)水平的中位值0.46分為高表達(dá)組共25例,低表達(dá)組共51例。結(jié)果顯示miR-299-5p與患者年齡、術(shù)前PSA水平無關(guān)(P>0.05),與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、骨轉(zhuǎn)移相關(guān)、預(yù)后情況,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

        2.3 轉(zhuǎn)染后各組PC-3細(xì)胞miR-299-5p表達(dá) 與空白組相比,陰性對(duì)照組PC-3細(xì)胞miR-299-5p相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-299-5p mim?ics組PC-3細(xì)胞miR-299-5p相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與陰性對(duì)照組相比,miR-299-5p mimics組PC-3細(xì)胞miR-299-5p相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見表4。

        2.4 miR-299-5p對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示,與空白組相比,陰性對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)增殖抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-299-5p mimics組轉(zhuǎn)染后48 h、72 h增殖抑制率顯著升高(P<0.05);與陰性對(duì)照組相比,miR-299-5p mimics組轉(zhuǎn)染后48 h、72 h后增殖抑制率顯著升高(P<0.05)。見表5。

        表2 兩組組織間miR-299-5p表達(dá)情況對(duì)比(±s,n=76)Tab.2 Comparison of miR-299-5p expression in two group(±s,n=76)

        表2 兩組組織間miR-299-5p表達(dá)情況對(duì)比(±s,n=76)Tab.2 Comparison of miR-299-5p expression in two group(±s,n=76)

        Groups Paracancerous Prostate cancer t P miR-299-5p/U6 1.24±0.21 0.46±0.05 43.615 0.000

        表3 miR-299-5p水平與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.3 Relationship between miR-299-5p level and clinico?pathological features of prostate cancer

        表4 各組PC-3細(xì)胞miR-299-5p表達(dá)情況(±s,n=6)Tab.4 Expression of miR-299-5p in PC-3 cells of each group(±s,n=6)

        表4 各組PC-3細(xì)胞miR-299-5p表達(dá)情況(±s,n=6)Tab.4 Expression of miR-299-5p in PC-3 cells of each group(±s,n=6)

        Note:1)P<0.05 vs Blank group;2)P<0.05 vs Negativecontrol group.

        Groups Blank Negative control miR-299-5p mimics F P miR-299-5p/U6 1.03±0.17 1.05±0.16 2.58±0.401)2)66.347 0.000

        2.5 miR-299-5p對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡的影響 與空白組相比,陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-299-5p mimics組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與陰性對(duì)照組相比,miR-299-5p mimics組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖1、表6。

        2.6 miR-299-5p對(duì)PC-3細(xì)胞侵襲遷移的影響 Tran?swell試驗(yàn)顯示(圖2,表7),與空白組相比,陰性對(duì)照組PC-3細(xì)胞侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-299-5p mimics組PC-3細(xì)胞侵襲遷移細(xì)胞數(shù)顯著下降(P<0.05);與陰性對(duì)照組相比,miR-299-5p mimics組PC-3細(xì)胞侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)。

        2.7 miR-299-5p對(duì)增殖、凋亡、侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)影響 與空白組相比,陰性對(duì)照組Ki67、Bax、Bcl-2、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-299-5p mimics組Ki67、Bcl-2、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05),Bax、E-cad?herin蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與陰性對(duì)照組相比,miR-299-5p mimics組Ki67、Bcl-2、N-cadherin蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05),Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖3、表8。

        表5 各組PC-3細(xì)胞增殖抑制率情況(±s,n=6,%)Tab.5 PC-3 cell proliferation inhibition rate in each group(±s,n=6,%)

        表5 各組PC-3細(xì)胞增殖抑制率情況(±s,n=6,%)Tab.5 PC-3 cell proliferation inhibition rate in each group(±s,n=6,%)

        Note:1)P<0.05 vs Blank group;2)P<0.05 vs Negativecontrol group.

        Groups Blank Negative control miR-299-5p mimics F P 24 h 14.52±2.07 14.27±2.03 14.85±2.12 0.118 0.889 48 h 18.79±2.68 17.92±2.56 28.53±4.071)2)20.603 0.000 72 h 25.61±3.65 25.99±3.71 49.87±7.121)2)44.700 0.000

        圖1 各組細(xì)胞凋亡情況Fig.1 Cell apoptosis in each group

        表6 各組細(xì)胞凋亡率比較(±s,n=6,%)Tab.6 Comparison of apoptosis rate in each group(±s,n=6,%)

        表6 各組細(xì)胞凋亡率比較(±s,n=6,%)Tab.6 Comparison of apoptosis rate in each group(±s,n=6,%)

        Note:1)P<0.05 vs Blank group;2)P<0.05 vs Negativecontrol group.

        Groups Blank Negative control miR-299-5p mimics F P Apoptosis rate 13.28±2.12 13.95±2.09 21.37±3.841)2)15.370 0.000

        圖2 各組PC-3細(xì)胞侵襲、遷移能力(×200)Fig.2 Invasion and migration ability of PC-3 cells in each group(×200)

        表7 各組PC-3細(xì)胞侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)比較(±s,n=6)Tab.7 Comparison of PC-3 cell invasion and migration in each group(±s,n=6)

        表7 各組PC-3細(xì)胞侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)比較(±s,n=6)Tab.7 Comparison of PC-3 cell invasion and migration in each group(±s,n=6)

        Note:1)P<0.05 vs blank group;2)P<0.05 vs Negative control group.

        Groups Blank Negativecontrol miR-299-5p mimics F P Number of invasive cells 345.71±49.38 358.88±51.26 126.85±18.121)2)56.677 0.000 Number of migrating cells 476.54±68.07 482.97±68.99 205.79±29.391)2)43.924 0.000

        圖3 各組PC-3細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.3 Expressionsof PC-3 cell proliferation,apoptosis,in?vasion and migration related proteinsin each group

        表8 各組PC-3細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)比較(±s,n=6)Tab.8 Expression comparison of PC-3 cell proliferation,apoptosis,invasion and migration related proteins in each group(±s,n=6)

        表8 各組PC-3細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲遷移相關(guān)蛋白表達(dá)比較(±s,n=6)Tab.8 Expression comparison of PC-3 cell proliferation,apoptosis,invasion and migration related proteins in each group(±s,n=6)

        Note:1)P<0.05 vs Blank group;2)P<0.05 vs Negative control group.

        Groups Blank Negativecontrol miR-299-5p mimics F P Ki67 0.45±0.06 0.43±0.06 0.29±0.041)2)15.545 0.000 Bax 0.18±0.02 0.20±0.03 0.32±0.041)2)35.586 0.000 Bcl-2 0.53±0.07 0.54±0.08 0.43±0.061)2)4.470 0.030 N-cadherin 0.45±0.06 0.45±0.06 0.30±0.041)2)15.341 0.000 E-cadherin 0.37±0.05 0.38±0.05 0.52±0.071)2)12.788 0.001

        3 討論

        差異性基因表達(dá)對(duì)于預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)生及治療疾病具有一定指導(dǎo)意義。miR-299-5p定位于14q32.31,具有重要調(diào)控功能。LIU等[8]研究顯示,子宮內(nèi)膜癌中miR-299表達(dá)下調(diào),是患者不良預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。ZHENG等[9]研究表明miR-299在肺癌中低表達(dá),且通過靶向ABCE 1促進(jìn)對(duì)阿霉素的敏感性。PENG等[10]研究顯示,miR-299-5p通過MAPK/ERK信號(hào)通路抑制膠質(zhì)母腫瘤細(xì)胞增殖。相關(guān)研究顯示miR-299-5p在胃腺癌、結(jié)直腸癌、鼻咽癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌基因功能[11-13]。但其在前列腺癌中研究較少。本研究中,前列腺癌組織中miR-299-5p表達(dá)較癌旁組織低,與其他惡性腫瘤中表達(dá)趨勢(shì)一致,提示miR-299-5p表達(dá)與前列腺癌的發(fā)生有關(guān),miR-299-5p可能在前列腺癌中也發(fā)揮抑癌基因作用。本研究還發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、臨床分期高、預(yù)后不良患者中miR-299-5p低表達(dá)者比例高于miR-299-5p高表達(dá)者,提示miR-299-5p表達(dá)與前列腺癌患者病理嚴(yán)重程度有關(guān),miR-299-5p低表達(dá)可能促進(jìn)前列腺癌惡性轉(zhuǎn)化過程。

        腫瘤細(xì)胞通常具有增殖、凋亡能力異常,侵襲遷移能力增強(qiáng)等特征[14]。腫瘤的發(fā)生與癌基因及抑癌基因的失調(diào)密切相關(guān)[15]。為進(jìn)一步檢測(cè)miR-299-5p對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,本研究將miR-299-5p mimics轉(zhuǎn)染至人前列腺癌PC-3細(xì)胞進(jìn)行探討,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-299-5p mimics組細(xì)胞增殖、侵襲遷移能力顯著低于空白組及陰性轉(zhuǎn)染組,而細(xì)胞凋亡比例顯著高于空白組及陰性轉(zhuǎn)染組。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-299-5p過表達(dá)可抑制PC-3細(xì)胞增殖,促進(jìn)PC-3細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步提示miR-299-5p在前列腺癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用。Ki67是增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原,其功能與有絲分裂密切相關(guān),表達(dá)量越高,腫瘤生長(zhǎng)速度越快,組織分化越差,是腫瘤細(xì)胞異常增殖的重要指標(biāo)[16]。Bax、Bcl-2具有同源性,均屬于Bcl-2基因家族,Bax主要發(fā)揮促凋亡作用,Bcl-2發(fā)揮抑制凋亡作用[17]。腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的早期階段,EMT發(fā)生過程中,上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào),而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)顯著上調(diào),這些基因表達(dá)受多種遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)因素調(diào)控[18-19]。王瑾等[20]研究顯示,miR-299-5p過表達(dá)可抑制舌鱗狀細(xì)胞癌EMT進(jìn)展,抑制細(xì)胞侵襲遷移能力。本研究中miR-299-5p mimics組Ki67、Bcl-2、N-cadherin蛋白表達(dá)較空白組與陰性對(duì)照組降低,Bax、E-cad?herin蛋白表達(dá)則相反,進(jìn)一步提示miR-299-5p過表達(dá)可抑制PC-3細(xì)胞增殖、侵襲、遷移相關(guān)蛋白表達(dá),促進(jìn)PC-3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制本研究未做探討。

        綜上所述,miR-299-5p在前列腺癌組織中低表達(dá),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、臨床分期等臨床病理特征密切相關(guān),miR-299-5p過表達(dá)可抑制PC-3增殖、侵襲與遷移,促進(jìn)凋亡,可能成為治療前列腺癌潛在靶點(diǎn)。但本研究也存在一定不足,有關(guān)miR-299-5p在前列腺癌中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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