胡萬超 王 丹 朱俊峰 周子陽 唐建國

（復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院急危重癥醫(yī)學(xué)科，上海200240）

白念珠菌是一種常寄居于人體呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道的條件致病菌，免疫缺陷個體中，白念珠菌可穿過宿主保護(hù)膜定植于內(nèi)臟器官引發(fā)感染，甚至危及生命［1-3］。白念珠菌分為菌絲相和酵母相，其致病狀態(tài)主要是菌絲相，菌絲相形成的生物膜可固定于固體表面，易于其定植與侵襲，且與耐藥性密切相關(guān)［4-7］。法尼醇是白念珠菌生成的群體感應(yīng)分子，可抑制白念珠菌酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)換，從而抑制生物膜形成［8-9］。研究發(fā)現(xiàn)，法尼醇聯(lián)合氟康唑可協(xié)同抑制生物膜形成，在降低白念珠菌耐藥性方面有廣闊應(yīng)用前景［10-12］。法尼醇也可通過促進(jìn)ROS產(chǎn)生和破壞線粒體誘導(dǎo)哺乳動物、真菌和細(xì)菌細(xì)胞凋亡［13］。但其生物學(xué)機(jī)制尚未闡明。

宿主抵抗白念珠菌定植及侵襲過程中，機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫發(fā)揮重要作用［14-15］。巨噬細(xì)胞在固有免疫和適應(yīng)性免疫過程中均起重要作用，不僅可作為效應(yīng)細(xì)胞吞噬和殺滅白念珠菌，還可作為抗原提呈細(xì)胞激活適應(yīng)性免疫，誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子釋放，如TNF-α、IL-6等，從而誘導(dǎo)Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)［16-17］。研究顯示，法尼醇可增加巨噬細(xì)胞趨化，當(dāng)白念珠菌被趨化的巨噬細(xì)胞吞噬3～6 h后，白念珠菌可形成菌絲穿透巨噬細(xì)胞，引發(fā)免疫逃逸［18-19］。研究發(fā)現(xiàn)，法尼醇可影響單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、未成熟的樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)，但其對巨噬細(xì)胞的具體生物學(xué)效應(yīng)尚未明確［19］。本研究在細(xì)胞水平觀察法尼醇對巨噬細(xì)胞RAW264.7和Ana-1增殖、凋亡、遷移的影響，發(fā)現(xiàn)法尼醇可抑制巨噬細(xì)胞增殖，促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡和遷移，其機(jī)制可能為法尼醇趨化巨噬細(xì)胞后，其毒性作用抑制巨噬細(xì)胞增殖的同時激活程序性凋亡通路，對進(jìn)一步研究白念珠菌如何從巨噬細(xì)胞逃逸并破壞巨噬細(xì)胞具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 巨噬細(xì)胞RAW264.7和Ana-1購自中國科學(xué)院干細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑 法尼醇購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITc）凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；0.22μm和0.45μm PVDF膜購自德國Millipore公司；鼠單克隆抗體β-ac?tin、兔單克隆抗體GAPDH購自美國CST公司；AKT兔單克隆抗體、P-AKT兔單克隆抗體購自英國Abcam公司；PARP兔單克隆抗體、Caspase-3兔單克隆抗體、Caspase-9兔單克隆抗體購自美國Proteintech公司；兔二抗和鼠二抗購自美國Jackson ImmunoResearch公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.1.3 主要儀器 流式細(xì)胞儀購自美國BDBiosci?ence公司；WB電泳、轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；酶聯(lián)免疫檢測儀購自瑞士Tecan集團(tuán)；倒置顯微鏡購自美國萊卡公司；超凈工作臺、離心機(jī)、超低溫冰箱、37℃培養(yǎng)箱均購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 RAW264.7巨噬細(xì)胞未用藥物處理前采用DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清培養(yǎng)，Ana-1采用1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃，生長至80%～85%融合時，采用細(xì)胞刮刮下RAW264.7細(xì)胞，移液槍吹下Ana-1細(xì)胞，傳代2～3 d。藥物處理時采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)以防止血清與法尼醇反應(yīng)而影響藥物效果［20-21］。實(shí)驗(yàn)分為對照組及不同濃度法尼醇處理巨噬細(xì)胞組。對照組給予1‰DMSO，實(shí)驗(yàn)組給予RAW264.7和Ana-1各自半數(shù)抑制濃度（IC50）及其以下濃度法尼醇，CCK-8法檢測并計(jì)算IC50，因此處理RAW264.7巨噬細(xì)胞分為對照組、法尼醇5、15、25μmol/L組；法尼醇處理Ana-1巨噬細(xì)胞分為對照組、法尼醇5、15μmol/L。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞生長抑制率 取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞和Ana-1細(xì)胞，分別用細(xì)胞刮和吹打方式消化細(xì)胞，PBS洗滌，離心，取細(xì)胞沉淀，制備1×105個/ml單細(xì)胞懸液，100μl/孔接種至96孔板培養(yǎng)24 h，吸凈培養(yǎng)基，PBS洗滌，加入無血清培養(yǎng)基配制的相應(yīng)濃度法尼醇，各濃度設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，10μl/孔加入CCK-8溶液孵育3 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處各孔吸光度并計(jì)算均值。法尼醇IC50測定：不同濃度法尼醇處理巨噬細(xì)胞RAW264.7和Ana-1，觀察1 h、4 h細(xì)胞存活情況，計(jì)算細(xì)胞活性，細(xì)胞活性=（存活率實(shí)驗(yàn)組-存活率空白組）/（存活率對照組-存活率空白組）×100%，GraphPad Prism8.0.2軟件計(jì)算并進(jìn)行線性擬合得到IC50及相關(guān)曲線。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞和Ana-1細(xì)胞，制備5×105個/ml單細(xì)胞懸液并接種至小皿，1 ml/孔加入4 ml培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，按預(yù)先設(shè)置的分組給予相應(yīng)濃度法尼醇繼續(xù)培養(yǎng)4 h，胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS洗2次，棄上清，100μl/管加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入Annexin V試劑5μl和PI試劑10μl，混勻，避光孵育15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.2.4 Western blot檢測 接種至小皿的各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，采用不同濃度法尼醇處理4 h，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，30μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗3次，15 min/次，加入二抗，室溫孵育2 h，洗滌3次，ECL化學(xué)試劑發(fā)光，曝光，Image J軟件進(jìn)行半定量檢測。

1.2.5 Transwell檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，RAW 264.7細(xì)胞制備5×105個/ml細(xì)胞懸液，Ana-1細(xì)胞制備2×105個/ml細(xì)胞懸液，各組上室加入100μl細(xì)胞懸液，按實(shí)驗(yàn)分組，下室加入由培養(yǎng)基（不含血清）配制的相應(yīng)濃度法尼醇溶液600 ml，5%CO2、37℃培養(yǎng)，RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)24 h，Ana-1細(xì)胞培養(yǎng)72 h，4%多聚甲醛溶液固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，ddH2O沖洗上室內(nèi)未遷移的細(xì)胞并用棉簽擦掉，自然干燥，顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用Student′st檢驗(yàn)，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素分析（Oneway-ANOVA），組間兩兩比較采用Dun?nett′st檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 法尼醇對RAW264.7和Ana-1巨噬細(xì)胞的IC50檢測 隨處理時間延長和濃度增加，法尼醇對RAW264.7和Ana-1巨噬細(xì)胞增殖的抑制作用越發(fā)顯著（圖1），法尼醇作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞1 h和4 h的IC50分別為（48.95±1.49）μmol/L、（26.1±0.65）μmol/L，不同時間點(diǎn)IC50值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.55，P＜0.05）。法尼醇作用于Ana-1巨噬細(xì)胞1 h和4 h的IC50分 別 為（23.29±0.33）μmol/L、（17.19±0.93）μmol/L，不同時間點(diǎn)IC50值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.182，P＜0.05）。

圖1 法尼醇對巨噬細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of farnesol on macrophages viability

2.2 法尼醇對RAW264.7和Ana-1巨噬細(xì)胞凋亡的影響 與對照組［（8.54±0.43）%］相比，5、15、25μmol/L法尼醇處理組RAW264.7細(xì)胞凋亡率分別 為（32.79±5.34）%、（39.32±2.42）%、（52.31±1.80）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與對照組［（5.71±1.10）%］相比，5、15μmol/L法尼醇處理組Ana-1細(xì) 胞 凋 亡 率 分 別 為（17.81±1.05）%、（32.73±3.31）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。隨法尼醇濃度增加，作用于巨噬細(xì)胞4 h后凋亡率提高，提示法尼醇可促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡（圖2）。

圖2 法尼醇對巨噬細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of farnesol on apoptosis of macrophages

2.3 法尼醇對巨噬細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 不同濃度法尼醇可促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步檢測經(jīng)典的凋亡通路AKT/BCL-2/Caspase-9/Cas?pase-3/PARP，結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度法尼醇作用于RAW264.7和Ana-1巨噬細(xì)胞4 h后，隨法尼醇濃度增加，RAW264.7巨噬細(xì)胞中，僅有采用最高濃度法尼醇處理時，磷酸化AKT（P-AKT）表達(dá)明顯下降（P＜0.01）。Ana-1巨噬細(xì)胞中，隨法尼醇濃度增加，P-AKT表達(dá)下降，呈濃度依賴性，與對照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001）。AKT可激活Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步檢測不同濃度法尼醇處理巨噬細(xì)胞后Bcl-2蛋白表達(dá)，2種巨噬細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)降低，除采用5μmol/L法尼醇處理Ana-1細(xì)胞時，Bcl-2表達(dá)與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001，圖3）。進(jìn)一步檢測促進(jìn)細(xì)胞凋亡的另一經(jīng)典家族Caspase家族蛋白表達(dá)，同時由于PARP蛋白作為底物既可被Bcl-2抑制，又可被Caspase蛋白剪切，故檢測PARP蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖4所示，PARP和PARP剪切帶（Cleaved PARP）表達(dá)在2種巨噬細(xì)胞中呈相反趨勢，PARP表達(dá)逐漸減少，Cleaved PARP表達(dá)逐漸增加，與對照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。Caspase-9剪切帶（Cleaved Caspase-9）在RAW264.7巨噬細(xì)胞中僅有采用最大濃度（25μmol/L）法尼醇處理時表達(dá)明顯增加（P＜0.001），在Ana-1巨噬細(xì)胞中，與對照組相比，法尼醇處理組Cleaved Caspase-9表達(dá)增加（P＜0.05，P＜0.001）。Caspase-3主帶在2種巨噬細(xì)胞中的表達(dá)與法尼醇處理無關(guān)，而Cleaved Caspase-3隨法尼醇濃度增加，表達(dá)逐漸增加（P＜0.01，P＜0.001），呈劑量依賴性（圖5）。各凋亡蛋白在2種巨噬細(xì)胞中表達(dá)趨勢基本一致。

圖3 法尼醇對巨噬細(xì)胞AKT、P-AKT、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of farnesol on expressions of AKT，P-AKT，Bcl-2 proteins in macrophages

圖4 法尼醇對巨噬細(xì)胞PARP、Cleaved PARP、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of farnesol on expressions of PARP，Cleaved PARP，Cleaved Caspase-9 proteins in macrophages

2.4 法尼醇對巨噬細(xì)胞遷移的影響 為研究白念珠菌分泌法尼醇后，法尼醇能否趨化巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步采用不同濃度法尼醇處理巨噬細(xì)胞以驗(yàn)證其遷移能力，結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度法尼醇可促進(jìn)RAW264.7和Ana-1巨噬細(xì)胞遷移，且呈劑量依賴性，各組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001，圖6）。

圖5 法尼醇對巨噬細(xì)胞Caspase-3及Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of farnesol on expressions of Caspase-3 and Cleaved Caspase-3 proteins in macrophages

圖6 法尼醇對巨噬細(xì)胞遷移的影響Fig.6 Effect of farnesol on migration of macrophages

3 討論

念珠菌是引起院內(nèi)血流感染的第4大原因，隨抗生素、腫瘤患者及器官移植患者免疫抑制劑應(yīng)用增多，白念珠菌感染增多，真菌耐藥性日趨嚴(yán)重［22］。目前臨床應(yīng)用最多的抗白念珠菌藥物主要為棘白菌素類、唑類、多烯類及核苷酸類似物，但并不能完全抑制白念珠菌生物膜形成，導(dǎo)致白念珠菌對傳統(tǒng)抗真菌藥物耐藥性增加［23-26］。法尼醇作為白念珠菌分泌的群體感應(yīng)分子，可抑制白念珠菌生物膜形成，與傳統(tǒng)抗真菌藥物聯(lián)用可減少耐藥性發(fā)生，但其對白念珠菌侵襲和感染的作用機(jī)制尚未明確。

機(jī)體抵御白念珠菌感染時，巨噬細(xì)胞在固有免疫和激活適應(yīng)性免疫中起重要作用，當(dāng)白念珠菌進(jìn)入機(jī)體時，巨噬細(xì)胞可識別、吞噬病原體和招募其他免疫效應(yīng)細(xì)胞，但白念珠菌分泌的法尼醇如何影響巨噬細(xì)胞尚未明確，本研究采用2種巨噬細(xì)胞RAW264.7和Ana-1探究法尼醇對巨噬細(xì)胞的影響。

研究顯示，白念珠菌生物膜形成可破壞巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞也可影響生物膜形成［27-28］。法尼醇可抑制生物膜形成，同時作為白念珠菌的毒力因子導(dǎo)致小鼠巨噬細(xì)胞活性下降，引發(fā)白念珠菌傳播［19］。本研究采用CCK-8法確定不同濃度法尼醇在不同時間處理RAW264.7和Ana-1巨噬細(xì)胞的IC50，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨時間延長，IC50逐漸降低，法尼醇處理巨噬細(xì)胞RAW264.7 4 h的IC50為25μmol/L，處理Ana-1 4 h的IC50為15μmol/L，均在白念珠菌分泌法尼醇的生理濃度范圍內(nèi)（2～60μmol/L）［15，19-20］。提示白念珠菌分泌的法尼醇濃度足以抑制巨噬細(xì)胞增殖活性，因此本研究采用生理濃度的法尼醇更能反映白念珠菌和機(jī)體免疫細(xì)胞的相互作用。

巨噬細(xì)胞遷移對發(fā)揮吞噬作用具有重要作用，研究顯示，法尼醇可促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞遷移［21］。本研究采用Transwell法分析RAW264.7和Ana-1巨噬細(xì)胞遷移，發(fā)現(xiàn)隨生理劑量法尼醇濃度增加，巨噬細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。當(dāng)白念珠菌分泌法尼醇后，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞進(jìn)一步遷移接近白念珠菌，但同時法尼醇可降低巨噬細(xì)胞活性，因此課題組進(jìn)一步研究法尼醇是否可通過凋亡途徑抑制巨噬細(xì)胞增殖。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞受基因調(diào)控的程序性死亡過程，其途徑主要包括死亡受體途徑和線粒體途徑，Bcl-2蛋白家族主要參與后者調(diào)控，作為Caspase的抑制因子抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2/Caspase-9/Caspase-3/PARP通路是細(xì)胞凋亡的經(jīng)典途徑之一，本研究對Bcl-2蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨法尼醇濃度增加，Bcl-2表達(dá)逐漸減少，而促凋亡蛋白Cas?pase-3、Caspase-9和PARP剪切帶表達(dá)均隨法尼醇濃度增加而增加，由于AKT既可通過促進(jìn)Bcl-2也可以通過抑制Caspase-9抑制細(xì)胞凋亡，故檢測AKT及P-ATK蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨法尼醇濃度增加，PAKT表達(dá)減少，因此，法尼醇可能通過影響和激活A(yù)KT、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Cleaved PARP和PARP表達(dá)促進(jìn)RAW26.7和Ana-1巨噬細(xì)胞凋亡。同時流式實(shí)驗(yàn)也展現(xiàn)了法尼醇對巨噬細(xì)胞的凋亡作用。

巨噬細(xì)胞與白念珠菌的相互關(guān)系目前尚未闡明，正常免疫情況下，巨噬細(xì)胞可吞噬清除白念珠菌，免疫低下時，白念珠菌可借助巨噬細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)散，白念珠菌的群體感應(yīng)分子法尼醇可抑制其生物膜形成，課題組研究法尼醇對巨噬細(xì)胞生物活性的影響結(jié)果顯示，法尼醇也可能通過抑制巨噬細(xì)胞生長促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡和遷移影響白念珠菌增殖。當(dāng)白念珠菌入侵機(jī)體時，其分泌的法尼醇可趨化巨噬細(xì)胞，從而導(dǎo)致白念珠菌被巨噬細(xì)胞吞噬，降低巨噬細(xì)胞活性，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，同時白念珠菌菌絲穿透巨噬細(xì)胞質(zhì)膜引發(fā)免疫逃逸。因此研究法尼醇與巨噬細(xì)胞的關(guān)系可能對治療白念珠菌感染具有重要意義，其作用機(jī)制和有待進(jìn)一步研究。