陳學(xué)生 張洪欽 陳秋琴 林 立 王永勝，4▲

1.廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院輸血科，福建福州 350007；2.廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院藥劑科，福建福州 350007；3.廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院兒科，福建福州 350007；4.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院藥劑科，福建廈門 361015

骨質(zhì)疏松（OP）是嚴(yán)重威脅絕經(jīng)后女性健康的重要因素。OP 是一種以骨量降低、骨微觀結(jié)構(gòu)損壞及骨脆性增加等為特征的全身性骨骼疾病，且易導(dǎo)致骨折[1]。由于起病隱匿，早期無典型癥狀，后期多引發(fā)疼痛或骨折時(shí)才得以確診[2]。近年來OP 治療方法經(jīng)驗(yàn)不斷豐富，研究者也努力從具有治療作用的中藥中提取有效成分，深入分子作用通路機(jī)制研究[3-4]。目前已證實(shí)骨碎補(bǔ)對(duì)骨損傷、OP 等具有良好的防治作用，由于其成分多樣，主要有黃酮、三萜、酚酸及其苷類等，其有效成分尚不明確，因此深入研究骨碎補(bǔ)防治OP 有效成分的藥理作用具有重要意義。本研究通過制備卵巢摘除誘導(dǎo)OP 模型觀察骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)大鼠OP 的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

強(qiáng)骨膠囊（含骨碎補(bǔ)總黃酮有效成分0.142 g，總黃酮含量≥80%，生產(chǎn)批號(hào)：181101，北京歧黃制藥有限公司）。大鼠血清骨轉(zhuǎn)化標(biāo)志物骨鈣素（BGP）試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20190222）、大鼠血清甲狀腺素（PTH）試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20190318）、大鼠血清骨堿性磷酸酶（BALP）試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20190318）。以上試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。包埋機(jī)（型號(hào)：BMJ-A，常州中威電子儀器），顯微鏡（型號(hào)：BA210T，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司），雙能X 線骨密度儀（DXA）（型號(hào)：LUNAR-Prodigy，美國GE 公司）。

1.2 研究對(duì)象

選取50 只體重70～90 g 的3月齡無特定病原（SPF）級(jí)健康雌性斯普拉格-杜勒（SD）大鼠，購自于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[編號(hào)：SCXK（滬2007-0005）]。飼養(yǎng)環(huán)境保持通風(fēng)換氣，氨濃度控制小于20 ppm，室內(nèi)溫度控制18～29℃，相對(duì)濕度達(dá)40%～70%，空氣換氣次數(shù)10 次/h，氣流速度≤0.18 m/s。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)福州市第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核同意。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及造模 將其中的21 只SD 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為三組：空白組、模型組、治療組（每組各7 只）。依次沿動(dòng)物兩側(cè)軟肋下皮膚剪開，并分離出皮膚的筋膜和腹膜臟層，在暴露腹腔后隨后切除模型組和治療組大鼠雙側(cè)卵巢，分層縫合、消毒?？瞻捉M不做卵巢切除處理。

1.3.2 給藥及取材 術(shù)后普通飼養(yǎng)3 個(gè)月開始給藥。空白組和模型組給予蒸餾水灌胃。根據(jù)大鼠與人的體表面積比例擬定大鼠的骨碎補(bǔ)給藥劑量。治療組予0.054 g/（kg·d）骨碎補(bǔ)總黃酮灌胃。首次干預(yù)前進(jìn)行骨密度（BMD）檢測(cè)，隨后連續(xù)灌胃給藥3 個(gè)月，取材前再次檢測(cè)BMD。取材前絕對(duì)禁食24 h，用10%水合氯醛給予0.3 mL/100 g 體重劑量肌內(nèi)注射深度麻醉，抽取腹主動(dòng)脈血5 mL，3000 r/min 離心5 min，分離血清，-20℃保存待用。抽血完畢依次分離附著股骨干骺端的肌肉和解體組織，暴露其股骨頭，用潔凈咬骨鉗將其鉗碎，用無菌EP 管收集并標(biāo)記。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清中BGP、BALP、PTH 參照ELISA 檢測(cè)試劑盒的操作說明書，在450 nm 波長下使用酶標(biāo)儀測(cè)量相應(yīng)吸光度值，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組BGP、BALP、PTH 水平，計(jì)算樣品實(shí)際濃度。

1.3.4 BMD 檢測(cè) 10%水合氯醛對(duì)大鼠深度麻醉后，大鼠正位放置定位板，四肢伸展。應(yīng)用DXA 系統(tǒng)采用小動(dòng)物模式掃描，測(cè)量各組大鼠左側(cè)股骨BMD。

1.3.5 蘇木精-伊紅（HE）染色 大鼠股骨組織剪碎約3 mm，4℃下在4%多聚甲醛液（pH=7.4）中固定48 h。使用10%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）（pH=7.4）在4℃條件下脫鈣1 個(gè)月，脫鈣液每周更換1 次。脫鈣結(jié)束，石蠟包埋連續(xù)切片。切片的厚度約4 μm，置65℃的恒溫烘箱中烤6 h。將組織切片常規(guī)脫蠟染色制片。光學(xué)顯微鏡下觀察HE 染色情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，任意兩組比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠干預(yù)后BMD 的比較

干預(yù)前，模型組的BMD 低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組的BMD 與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)后，空白組和治療組的BMD 高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組的BMD 低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。三組干預(yù)前后組內(nèi)的BMD 比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1、圖1）。

表1 三組大鼠干預(yù)后BMD 的比較（mg/cm2，±s）

表1 三組大鼠干預(yù)后BMD 的比較（mg/cm2，±s）

與模型組同期比較，*P＜0.05；與空白組同期比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) 干預(yù)前 干預(yù)后 t 值 P 值空白組模型組治療組777 0.477±0.005*0.369±0.013 0.364±0.018#0.481±0.007*0.358±0.011 0.386±0.005*#2.236 2.051 2.698 0.089 0.110 0.054

2.2 三組大鼠骨轉(zhuǎn)化生物標(biāo)志物水平的比較

模型組的BGP 低于空白組，BALP、PTH 高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組的BGP 低于空白組，BALP、PTH 高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組的BGP 高于模型組，BALP、PTH低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 三組大鼠骨轉(zhuǎn)化生物標(biāo)志物水平的比較（±s）

表2 三組大鼠骨轉(zhuǎn)化生物標(biāo)志物水平的比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) BGP（μg/L） BALP（IU/L） PTH（pmol/L）空白組模型組治療組777 1.79±0.14 0.68±0.14*1.45±0.22*#100.79±11.69 192.73±24.23*139.45±11.91*#28.16±1.27 49.78±3.22*39.92±4.64*#

2.3 三組大鼠的股骨組織病理學(xué)情況

空白組大鼠的股骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整，大鼠股骨干骺端骨小梁連接致密，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)完整。與空白組相比，模型組骨小梁數(shù)目減少，骨小梁間連接稀疏間距變大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞嚴(yán)重，骨髓腔融合較嚴(yán)重。相比模型組，治療組骨小梁微結(jié)構(gòu)有一定程度的改善，骨小梁數(shù)量增多，其連接點(diǎn)也見增多（圖2，封三）。

3 討論

絕經(jīng)后OP 為高轉(zhuǎn)換型OP，即骨吸收與骨形成都比較活躍，但以骨吸收為主。絕經(jīng)后OP 主要表現(xiàn)為骨量迅速丟失，骨折多以股骨上端為主[5]。不同部位骨骼的骨質(zhì)成分不同，皮質(zhì)骨或密質(zhì)骨構(gòu)成長骨骨干和所有骨的外層，而小梁骨或松質(zhì)骨構(gòu)成骨骼的內(nèi)層[6]。婦女絕經(jīng)后由于卵巢功能衰退，導(dǎo)致機(jī)體雌激素水平下降，繼發(fā)甲狀旁腺功能亢進(jìn)，甲狀旁腺激素分泌增多，而降鈣素分泌不足，骨重建單位進(jìn)行負(fù)平衡活動(dòng)，骨吸收大于骨形成[7-8]。小梁骨在絕經(jīng)早期迅速丟失致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加，皮質(zhì)骨丟失較緩慢，但較持續(xù)，隨著小梁骨和皮質(zhì)骨的丟失，髖部的骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[9]。

骨碎補(bǔ)的主要生物活性成分為黃酮類化合物，因其潛在的藥用價(jià)值而備受關(guān)注，在基礎(chǔ)及臨床研究中廣泛應(yīng)用[10]。以往實(shí)驗(yàn)已證實(shí)骨碎補(bǔ)對(duì)卵巢切除所致的骨高轉(zhuǎn)換有明顯的抑制效應(yīng)，骨碎補(bǔ)能抑制破骨細(xì)胞的生長，不僅對(duì)破骨母細(xì)胞向成熟破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化有抑制作用，而且對(duì)破骨細(xì)胞性骨吸收有抑制作用[11-13]。DXA 測(cè)量髖部、全身是目前最常用、成熟的測(cè)量方法，具有較好的重復(fù)性、輻射量低等優(yōu)點(diǎn)，DXA 的BMD結(jié)果與骨折風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性已被廣泛認(rèn)可，是多數(shù)臨床藥物研究療效觀察采用的測(cè)量方法[14]。本研究通過對(duì)比骨碎補(bǔ)總黃酮干預(yù)前后各組間BMD 變化，結(jié)果提示，模型組和給藥組干預(yù)前的BMD 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；干預(yù)后，治療組骨量丟失情況較OP 模型組有所改善。HE 染色鏡下可見治療組骨小梁微結(jié)構(gòu)有所改善，骨小梁數(shù)量和連接點(diǎn)相應(yīng)增多。

目前骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物已廣泛應(yīng)用于臨床診療、研究中，骨形成標(biāo)志物有BGP、BALP 等，骨吸收指標(biāo)包括PTH 和性激素等[15-16]。血清中的BGP 在骨吸收或形成能力增強(qiáng)時(shí)會(huì)增加，具有較強(qiáng)的敏感性和特異性。BALP 在骨組織中較為活躍，因此發(fā)生OP 時(shí)，BALP 亦可上升[17]。骨碎補(bǔ)總黃酮具有促進(jìn)骨形成標(biāo)志物BGP、BALP 水平與活性，并抑制骨吸收標(biāo)志物PTH 水平。骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物雖不能完全作為OP診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但結(jié)合BMD，可較早地獲悉骨轉(zhuǎn)換動(dòng)態(tài)，因此在監(jiān)測(cè)抗OP 的治療效果等方面具有重要作用[18-19]。

綜上所述，對(duì)去勢(shì)誘導(dǎo)的OP 給予骨碎補(bǔ)有效成分總黃酮干預(yù)具有良好的改善作用，對(duì)今后在藥品開發(fā)和臨床實(shí)際應(yīng)用中具有重要的指導(dǎo)意義。

圖2 大鼠股骨組織病理圖（HE 染色，400×）（見內(nèi)文第6頁）