杜 娟，劉昌紅，梁 輝，呂曉紅

神經(jīng)干細胞(NSCs)作為干細胞的一種，具有自我更新及多向分化潛能，因此在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的移植治療過程中，NSCs成為移植細胞的潛在來源。而NSCs的存活、增殖、分化以及遷徙過程均受到局部復(fù)雜微環(huán)境等因素的影響，氧濃度是NSCs所處微環(huán)境中重要的因素之一，且體內(nèi)多種組織特別是含有干細胞的組織中氧濃度遠遠低于大氣氧濃度[1,2]。

低氧可以影響NSCs的增殖及分化[3]，且主要向多巴胺能神經(jīng)元分化，但影響NSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化的最適低氧濃度尚無定論。本實驗利用特定的誘導(dǎo)因子在低氧條件下對NSCs進行誘導(dǎo)分化，從而明確NSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化的最適低氧濃度并獲得目的細胞，為神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的治療提供了新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級孕14～16 d Wistar大鼠由吉林大學(xué)動物中心提供(SCXK-(Ji)2003-0001)。

1.2 試劑 培養(yǎng)基DMEM/F12,B27(Gibco),堿性成纖維細胞生長因子(bFGF),表皮細胞生長因子(EGF)和膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)(Peprotech),FBS(杭州四季青公司),dbcAMP(Santa),兔抗鼠神經(jīng)元特異性中間絲(Nestin)(武漢博士德公司)，兔抗鼠5-溴脫氧尿苷(Brdu)(武漢博士德公司)，兔抗鼠絡(luò)氨酸羥化酶(TH)多克隆抗體(武漢博士德公司)，山羊抗兔免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)，F(xiàn)ITC標記山羊抗兔IgG(武漢博士德公司)。

1.3 神經(jīng)干細胞的體外分離及原代培養(yǎng) 神經(jīng)干細胞的體外分離與培養(yǎng) 取妊娠14～16 d的Wistar大鼠,給予乙醚吸入麻醉,無菌操作取出胚胎,置于冰浴的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)內(nèi),分離胚胎中的腦組織,小心剝離腦膜及血管,將取出的腦組織剪成小組織塊,加入0.125%胰蛋白酶消化30 min左右,用含10%胎牛血清終止消化， 0.01%DNaseI繼續(xù)對腦組織消化30 min左右，離心,將離心后的細胞懸浮于干細胞培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基包含bFGF 20 ng/ml和EGF 20 ng/ml及DMEM/F12培養(yǎng)基(另含2% B27,HEPES10 mmol/L,谷氨酰胺2 mmol/L,青霉素100 U/ml,鏈霉素100 U/ml),調(diào)整細胞密度至5×105/ml,接種至25 ml培養(yǎng)瓶。在37 ℃飽和濕度、5% CO2/95%空氣的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d半量換液一次,7 d傳代一次。

1.4 神經(jīng)干細胞的鑒定 待培養(yǎng)至1 w左右時取細胞懸液1瓶，細胞離心(1000 rmp,5 min)后棄上清，重懸，吸管吹打分離細胞克隆，注意力度要適當均勻，重新細胞計數(shù)后以5×104/ml接種于裝有細胞爬片的24孔板內(nèi)，進行Nestin及Brdu鑒定。

1.5 不同低氧濃度下GDNF體外誘導(dǎo)NSCs 各實驗組均應(yīng)用凍存的第3代細胞，保證細胞的同源性。細胞復(fù)蘇步驟如下：凍存管置于39 ℃～40 ℃水浴搖晃，1 min內(nèi)融化；吸入離心管，加培養(yǎng)液至10 ml，輕輕混勻，離心(1000 rmp,5 min)后棄上清，重懸，重新細胞計數(shù)后以5×105/ml接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。實驗分組：實驗組A常氧環(huán)境下(20%氧氣)GDNF誘導(dǎo)組；實驗組B 10%氧氣環(huán)境下GDNF誘導(dǎo)組；實驗組C 5%氧氣環(huán)境下GDNF誘導(dǎo)組；實驗組D 3%氧氣環(huán)境下GDNF誘導(dǎo)組；實驗組E 1%氧氣環(huán)境下GDNF誘導(dǎo)組實驗組A取出第3代凍存細胞復(fù)蘇后培養(yǎng)1 w左右培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞懸液，細胞離心(1000 rmp,5 min)后棄上清，重懸，吸管吹打分離細胞克隆，注意力度要適當均勻，重新細胞計數(shù)后以5×104/ml密度接種于裝有細胞爬片的24孔板內(nèi)，每孔1.5 ml，以GDNF20 μg/L(每孔需分別添加GDNF儲存液15 μ)進行誘導(dǎo)，共8孔，另外8孔添加等量PBS，24 h后加5-FU(每孔需分別添加5氟尿嘧啶儲存液1.5 μl)，每2～3 d半量換液，7 d后終止誘導(dǎo),進行TH細胞鑒定。實驗組B、實驗組C、實驗組D、實驗組E均在不同氧濃度的缺氧培養(yǎng)箱中進行，余處理相同。

2 實驗結(jié)果

2.1 孕14 d～16 d wistar大鼠無血清培養(yǎng) 應(yīng)用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，24 h可見大部分細胞分裂成3～4個的細胞球，且懸浮生長，隨著時間推移，細胞球體積逐漸增大，數(shù)量增多，折光性較好，球體形狀規(guī)則，5～6 d時少量神經(jīng)球貼壁生長，并向外伸出突起。

2.2 Nestin鑒定 收集傳代至第3代的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)至1 w左右時制作細胞爬片，進行免疫細胞化學(xué)染色鑒定，結(jié)果示神經(jīng)球呈現(xiàn)棕黃色，而對照組基本無著色，差異明顯，表明細胞具備干細胞特性。

2.3 Brdu鑒定 收集細胞前24 h給予Brdu，后制作細胞爬片，行免疫細胞化學(xué)染色，結(jié)果示神經(jīng)球呈現(xiàn)棕黃色，而對照組基本無著色，差異明顯，表明細胞具備干細胞增殖分化的能力。

2.4 不同氧濃度下GDNF誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞分化 在常氧、1%O2、3%O2、5%O2、10%O2環(huán)境下加入GDNF20 μg/L，分化1 w時平均陽性率分別為9.78%、14.56%、25.54%、14.17%、11.10%。1%O2、3%O2、5%O2組與常氧對照組相比較具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；10%O2組與常氧對照組相比較無統(tǒng)計學(xué)差異；3%O2組與1%O2組、5%O2組相比較具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，而1%O2組與5%O2組相比較無統(tǒng)計學(xué)差異，即在3%O2濃度下神經(jīng)干細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化比率最高(見表1、圖1)。

表1 不同氧濃度下GDNF誘導(dǎo)分化后多巴胺能神經(jīng)元比率

不同氧濃度組與對照組相比*P<0.01

3 討 論

傳統(tǒng)觀點認為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細胞是一種終末細胞。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，大部分病理過程如創(chuàng)傷、中毒及缺血缺氧等引起的神經(jīng)元丟失都是不可逆的。因此，神經(jīng)干細胞移植成為頗具前景的治療手段，而充足、安全、可靠的NSCs是細胞移植的前提。有研究顯示，運用細胞移植治療相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病時，向疾病模型移植入向特定神經(jīng)元方向分化的NSCs比移植入未分化的NSCs癥狀改善明顯[4]。

目前，大部分NSCs培養(yǎng)均在常氧環(huán)境下進行，即與大氣中氧濃度(21%，160 mmHg)相同，但NSCs在生物體內(nèi)所處氧環(huán)境并非如此。如骨髓間充質(zhì)干細胞所處的微環(huán)境中氧濃度約為1%～7%。已有大量研究顯示，低氧可以促進神經(jīng)干細胞增殖[5,6]，對抗其凋亡[7]，對其分化方向也有一定誘導(dǎo)作用，且主要向多巴胺能神經(jīng)元分化[8]。低氧環(huán)境下獲得足夠的多巴胺能神經(jīng)元也一度成為研究的熱點，但既往的研究大部分在3%氧濃度環(huán)境下進行，但對于NSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化的最佳低氧濃度尚無系統(tǒng)研究。本實驗著重研究NSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化的最佳低氧濃度。本實驗中設(shè)立21%、10%、5%、3%、1%5個氧濃度梯度，結(jié)果顯示在10%氧濃度時NSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化率與常氧組相比無明顯提高；5%及更低氧濃度時NSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化率明顯提高，與常氧組相比實驗結(jié)果具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，但各低氧組之間比較分化率與氧濃度梯度無線性相關(guān)性；3%O2組與1%O2組、5%O2組相比具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，而1%O2組與5%O2組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，即在3%O2濃度下神經(jīng)干細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化比率最高。分析原因，可能是因為3%的氧濃度更易于啟動神經(jīng)干細胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的各項調(diào)控機制。而Studer L的研究中，低氧組NSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化率高達56%，后期研究很少能達到該比例，最主要的原因可能為取材部位不同，NSCs在胚胎腦組織中很多區(qū)域均有分布，而不同區(qū)域的NSCs分化時也有不同趨向，特別是胚胎后期，NSCs的多向分化潛能下降，更易向特定類型的神經(jīng)元分化，例如中腦來源的NSCs更易分化為TH陽性神經(jīng)元[9]。另外，低氧可以促進NSCs增殖，故增殖期低氧可增加NSCs基數(shù)，也有研究顯示，低氧狀態(tài)下延長增殖時間可以增加人類胚胎中腦前體細胞向TH陽性神經(jīng)元的分化[10]，故低氧處理時間及處理階段、統(tǒng)計學(xué)處理不同也可以導(dǎo)致結(jié)果的差異較大。

低氧促進NSCs分化為多巴胺能神經(jīng)元的機制非常復(fù)雜，目前研究所得結(jié)論主要集中于以下幾方面。首先，低氧可以促進NSCs中某些細胞因子的合成。在此過程中，HIF-1在細胞表型及功能特征方面起決定性作用。HIF-1是氧濃度對神經(jīng)干細胞增殖及分化調(diào)節(jié)過程中重要的細胞因子，有α和β兩個亞基。HIF-1α是調(diào)節(jié)細胞缺氧適應(yīng)過程中重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，在多數(shù)細胞和組織中，其含量很低，在胞質(zhì)內(nèi)處于失活狀態(tài)；但是在缺氧條件下其含量則升高，可被激活并轉(zhuǎn)移到細胞核并與HIF-1β形成HIF-1 分子，識別并結(jié)合包含有低氧反應(yīng)元件的DNA序列[11]。其次，低氧引起基因水平的改變。低氧狀態(tài)下，Wnt通路在NSCs分化為多巴胺能神經(jīng)元過程中起重要作用[12]，同源異形盒轉(zhuǎn)錄因子Eng railed(En)家族成員En1和En2在后期維持中腦DA能神經(jīng)元方面起重要作用，而Wnt1 能促進二者在大腦黑質(zhì)和腹側(cè)被蓋區(qū)表達。在多巴胺能神經(jīng)元的成熟方面，低氧促進mRNA表達更多的EPO和P27，而這些也影響神經(jīng)細胞的分化，同時，Nurr1和Pitx3以及DA相關(guān)轉(zhuǎn)運RNA的表達也上調(diào)，而這些與多巴胺能神經(jīng)元的成熟有關(guān)。有研究顯示，在3%～5%條件下培養(yǎng)出的多巴胺能神經(jīng)元具有更多的突起，且突起較正常氧條件下更長，表型更成熟[13]。另外，在低氧條件下，D3和D4型突觸后多巴胺受體的轉(zhuǎn)錄也會受影響。此過程中，可能涉及慢反應(yīng)缺氧敏感的轉(zhuǎn)錄因子參與[14]。細胞因子和基因水平的調(diào)控密不可分，HIF-1α缺失會使Wnt/β-catenin信號通路受抑制，從而使干細胞的增殖、分化及成熟受累[15]。HIF-1還可以結(jié)合酪氨酸羥化酶mRNA啟動子，進一步調(diào)控酪氨酸羥化酶基因的表達，從而使酪氨酸羥化酶的合成增加。第三，低氧本身減輕了氧化應(yīng)激效應(yīng)[16]，對NSCs起到保護作用，減少其凋亡的同時促進其增殖，從而增加了NSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化的基數(shù)。當然，分化出的多巴胺能神經(jīng)元是否成熟，功能如何，能否分泌多巴胺，這些需進一步研究，本研究旨在低氧對NSCs分化方向的影響。另外，GDNF是1993年Lin等發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，是轉(zhuǎn)化生長因子家族中的一員。主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中腦多巴胺區(qū)域，GDNF不僅在神經(jīng)干細胞分化為多巴胺能神經(jīng)元中起著重要作用，而且對多巴胺能神經(jīng)元也具有營養(yǎng)、支持、保護和修復(fù)作用[17]。曾有研究顯示GDNF誘導(dǎo)人類神經(jīng)元祖細胞分化后，TH陽性細胞比例達50%，對照組分化比例僅為2.9%(P<0.05)[18]。本實驗中低氧聯(lián)合GDNF誘導(dǎo)NSCs分化為多巴胺能神經(jīng)元的比例最高僅達30%，分析可能與取材部位、GDNF來源及劑量、誘導(dǎo)分化時間不同有關(guān)。

氧濃度對NSCs增殖和分化的研究使得干細胞學(xué)科更加完善和深入，并且必將推動神經(jīng)干細胞移植治療的進一步發(fā)展，尤其是在缺血缺氧性腦卒中中的應(yīng)用與研究。雖然低氧條件下的NSCs培養(yǎng)實驗已取得一定進展，但仍存在很多的未知，這需要我們進一步的研究。