姜 威，任 晴，賴關(guān)淑媛，張 歡，張 纓，于 澎，董 銘

驅(qū)動蛋白(kinesin)是目前已知最小的分子馬達(dá),它能夠通過催化作用將三磷酸腺苷(ATP)分子攜帶的化學(xué)能高效地轉(zhuǎn)化為機(jī)械能,產(chǎn)生沿微管的連續(xù)前進(jìn)動作,從而完成其攜帶的細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸[1]。驅(qū)動蛋白包括一個巨大的馬達(dá)蛋白超家族(KIF superfamily)。KIF1A 屬于kinesin-3家族,在機(jī)體內(nèi)常態(tài)以單體形式存在,是一種沿微管正向運(yùn)動的驅(qū)動蛋白馬達(dá)。與常見的雙頭驅(qū)動蛋白馬達(dá)相比KIF1A有高度的前進(jìn)性,實(shí)驗(yàn)研究表明:它能以約1.5 μm/s的速度在不脫離微管表面的前提下連續(xù)前進(jìn)約700步,這是普通驅(qū)動蛋白在微管表面運(yùn)動步數(shù)的5～6倍。KIF1A最早發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)軸突膜泡運(yùn)輸?shù)难芯恐?基于軸突免疫細(xì)胞化學(xué)方法的研究表明,快速運(yùn)動的KIF1A主要負(fù)責(zé)神經(jīng)系統(tǒng)里軸突上突觸囊泡前體的快速運(yùn)輸,并且它介導(dǎo)的軸突運(yùn)輸對神經(jīng)的成長、存活和功能發(fā)揮有重要的作用[2]。機(jī)體內(nèi)KIF1A 的變異將引起學(xué)習(xí)記憶功能減弱、癌癥、常染色體遺傳性痙攣性截癱、感覺神經(jīng)元病變等多種神經(jīng)功能有關(guān)的疾病[3],而研究這些病理和開發(fā)相關(guān)藥物與KIF1A 的運(yùn)動機(jī)制有密切的關(guān)系。因此,關(guān)于KIF1A 的研究已成為生命科學(xué)、物理學(xué)、生物化學(xué)等諸多學(xué)科關(guān)注的焦點(diǎn)問題之一。本研究旨在構(gòu)建KIF1A啟動子基因全長序列熒光素酶報告基因載體,為下一步研究KIF1A基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 大腸桿菌DH5α由本?；A(chǔ)部保存。pGL3 系列熒光素酶基因的表達(dá)載體,購自美國promega公司。pGEM-T easy 載體、T4 DNA 連接酶、TaKaRa Prime STARTM HS DNA Polymerase、各種限制性內(nèi)切酶、電泳所用DL 2000 marker均購自TaKaRa公司。質(zhì)粒提取、純化試劑盒E.Z.N.A.TM Plasmid Miniprep Kit I (50 preps)-Q Spin Column Format、以及PCR 片斷回收及純化試劑盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit (50 preps)-Q Spin Column Format和E.Z.N.A.TM Cycle Pure Kit (50 preps)-Q Spin Column Format試劑盒購自美國Omega公司。Dotap 轉(zhuǎn)染試劑購自瑞士Roche 公司。凝膠成像分析系統(tǒng)Gel Doc2000購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank報道的kif1a基因的啟動子區(qū)1853 bp DNA 序列(GenBank:NC_000002.12 (240713767.240821403,complement)設(shè)計引物。用Gene tool軟件設(shè)計一對特異性引物，5’端和3’端分別引入SacI和XhoI酶切位點(diǎn)。上游引物為F1:5’GCCGACATCTTCTG CCAGTTCA 3’；下游引物為R2:5’GAAGGACTTGGTCACCTCCACT 3’。由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.2.2 SCG細(xì)胞的培養(yǎng) 仔鼠出生前日，鋪膠。用0.2%PEI覆蓋培養(yǎng)皿底物，4 ℃冰箱過夜。Matrigel放冰上置于4 ℃冰箱內(nèi)，使均勻受冷解凍，避免生成沉淀。仔鼠出生當(dāng)天，將仔鼠頭部倒置固定于解剖臺上，鏡下沿頸總動脈向頭部方向仔細(xì)分離，直至發(fā)現(xiàn)紡錘樣SCG，小心取出SCG，放入置于冰盒上的35 mm dish中(內(nèi)含L-15液)，將SCG用吸管吸入15 ml試管，加1XTrypsin及Collagenase IV各約1 ml，37 ℃振蕩3～4 h，吸走培養(yǎng)皿中0.2% PEI，DDW洗3遍，加入Matrigel，室溫放置半小時方可使用。打碎SCG，鏡檢至成單細(xì)胞狀態(tài)。加等量中和液，900轉(zhuǎn)離心1 min，棄上清，加培養(yǎng)液，懸浮細(xì)胞并計數(shù)，調(diào)整濃度至104個/ml，吸走M(jìn)atrigel，加入100 μl SCG細(xì)胞/培養(yǎng)皿，37 ℃ 1 h等待細(xì)胞附壁，補(bǔ)充培養(yǎng)液至1 ml左右，37 ℃ CO2孵箱培養(yǎng)。

1.2.3 kif1a基因啟動子模板的制備 本實(shí)驗(yàn)室前期已從人神經(jīng)細(xì)胞基因組DNA中,應(yīng)用PCR技術(shù),克隆出包含kif1a啟動子基因全長序列的基因片段(2565 bp) (GenBank:NC_000002.12,240821403-240818837),DNA 測序證實(shí)序列正確,并成功構(gòu)建重組pGEM-T easy載體。用無菌接種環(huán)蘸取凍存kif1a重組pGEM-T easy載體質(zhì)粒菌株,氨芐青霉素LB瓊脂培養(yǎng)平板(濃度為50 g/ml) 劃線,在37 ℃孵箱中培養(yǎng)過夜，直到菌落長出。用無菌牙簽或吸頭挑取單個菌落于5 ml含氨芐青霉素抗生素LB 培養(yǎng)基(濃度為50 μg/ml),200～220 r/min,37 ℃過夜。質(zhì)粒抽提(參照EZNA質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進(jìn)行)。以重組pGEM-T easy載體質(zhì)粒為模板,進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。

1.2.4 目的基因的擴(kuò)增 以含有kif1a啟動子基因全長序列的重組pGEM-T easy載體模板,以F1、R2為引物,反應(yīng)體系為50 μl,進(jìn)行PCR擴(kuò)增kif1a基因啟動子的DNA片斷。反應(yīng)條件為:98 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s;66 ℃ 15 s;72 ℃ 1 min 30 s,反應(yīng)共30個循環(huán),72 ℃ 延伸8 min,取5 μl PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠(10 g/L)中進(jìn)行電泳,在紫外燈下觀察結(jié)果并用凝膠成像分析系統(tǒng)成像。將PCR 產(chǎn)物用低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠(10 g/L)電泳分離后,用EZNA TM Gel Extraction Kit(50 preps)-Q Spin Column 試劑盒回收并純化。

1.2.5 熒光素酶報告基因載體的構(gòu)建 感受態(tài)大腸桿菌DH5α的制備及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化,均按常規(guī)方法進(jìn)行。將純化的PCR產(chǎn)物及pGL3-basic熒光素酶基因表達(dá)載體,分別用SacI和XhoI進(jìn)行雙酶切(6 h),并經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(10 g/L)電泳分離雙酶切產(chǎn)物后,用EZNA TM Cycle Pure Kit (50 preps)-Q Spin Column Format試劑盒回收并純化。將經(jīng)雙酶切并回收的PCR產(chǎn)物和pGL3-basic 熒光素酶基因表達(dá)載體,用T4 DNA連接酶于16 ℃下連接12 h,將kif1a基因的啟動子定向插入pGL3-basic熒光素酶基因表達(dá)載體中,即構(gòu)建成pGL3- kif1a表達(dá)載體。以連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌DH5，然后涂布于含有IPTG(200 g/L)、X-gal(20 g/L)、氨芐青霉素(100 mg/L)的LB瓊脂平板上,于37 ℃培養(yǎng)14 h。

1.2.6 熒光素酶報告基因載體的酶切、測序鑒定 隨機(jī)挑取白色菌落,提取質(zhì)粒后用SacⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切、以重組質(zhì)粒pGL3-kif1a為模板,應(yīng)用上游引物F1和下游引物R2,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,并進(jìn)行DNA序列分析(吉林省庫美生物科技有限公司完成)。

1.2.7 熒光素酶報告基因載體轉(zhuǎn)染 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染SCG細(xì)胞，將SCG細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁面積占瓶底面積60%～80%時,以每孔2×105個細(xì)胞移入6孔板內(nèi),在37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱內(nèi),以無血清培養(yǎng)基孵育24 h。接種3個孔,分別轉(zhuǎn)染3種質(zhì)粒,即pGL3-basic(陰性對照)、pGL3- kif1a(重組質(zhì)粒)及pGL3-promoter(陽性對照,含SV40啟動子)。每種質(zhì)粒的用量均為2.5 μg/孔,PRL為0.05 μg/孔(作為內(nèi)對照),分別與15 μl脂質(zhì)體混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染,詳細(xì)操作見試劑盒說明書。在相同條件下重復(fù)3次轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 熒光素酶報告基因活性的檢測 冰浴條件下,足夠的冷PBS輕輕漂洗,至少洗4次,傾斜6孔板放置20 min,徹底祛除培養(yǎng)基,加1×PLB 裂解液500 μl,搖床冰浴搖15 min,將裂解液轉(zhuǎn)移到EP管,離心后取上清,立刻檢測;100 μl LARII 于96孔板;加入20 μl細(xì)胞裂解液,與LARII混勻放入儀器中讀數(shù);記錄Firefly luc.數(shù)值,時間15 s;取出檢測管,加100 μl Stop/Glo試劑,渦旋混勻后放入儀器,讀數(shù),并記錄Renilla luc.數(shù)值,時間15 s。

2 結(jié) 果

2.1 kif1a基因的啟動子全長序列的PCR 擴(kuò)增 用Gene tool軟件設(shè)計一對特異性引物，5’端和3’端分別引入SacI和XhoI 酶切位點(diǎn)，顯示了酶切位點(diǎn)在載體上的連接位置與方向(見圖1)。從本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的包含kif1a啟動子基因全長序列的基因片段重組T載體質(zhì)粒中選擇性擴(kuò)增kif1a啟動子,取PCR 產(chǎn)物P進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示,在1853 bp左右處見一特異性條帶(見圖2),證明擴(kuò)增成功。

2.2 熒光素酶報告基因載體酶切及PCR 鑒定 重組質(zhì)粒pGL3-kif1a經(jīng)SacI和XhoI雙酶切后,進(jìn)行電泳分離,出現(xiàn)大小約為1853 bp的條帶(見圖3)。以重組質(zhì)粒pGL3-kif1a為模板,用F1、R2作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離,出現(xiàn)大小約為1853 bp的條帶。證明pGL3-kif1a啟動子報告基因載體構(gòu)建成功。

2.3 熒光素酶報告基因載體序列分析 對插入pGL3-basic載體的pGL3- kif1a的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析表明，kif1a基因啟動子的序列與GenBank中kif1a基因的啟動子的序列相一致。

2.4 熒光素酶報告基因載體的活性檢測 重組質(zhì)粒pGL3-kif1a轉(zhuǎn)染SCG細(xì)胞后,產(chǎn)生的熒光素酶活性同陰性對照pGL3-basic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的熒光素酶活性相比較,有顯著的啟動子活性;但同陽性對照(pGL3-promoter)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的熒光素酶活性相比較,pGL3-kif1a啟動子活性明顯低于pGL3-promoter(見圖4)。

圖1 pGL3-Promoter熒光素酶報告載體限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)

圖2 pGL3-kif1a啟動子序列 雙酶切1853 bp和5 kb片段。M:DNA Marker DL2000

圖3 重組質(zhì)粒pGL3-kif1a為模板PCR擴(kuò)增結(jié)果。P:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M:DNA Marker DL2000

圖4 pGL3-kif1a啟動子在SCG細(xì)胞中啟動活性

3 討 論

KIF1A主要參與軸突上分泌囊泡前體沿微管的正向運(yùn)輸,它的變異可能導(dǎo)致多種神經(jīng)病變和發(fā)育的缺陷,例如阿爾茨海默病、帕金森病、遺傳性感覺和自主神經(jīng)病變Ⅱ型(hereditary sensory and autonomic neuropathy typeⅡ,HSANII)、常染色體隱性遺傳性痙攣性截癱(SPG30)亞型以及和感覺神經(jīng)功能相關(guān)等[3～5]，近年來,人們已對kif1a及其配體的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了深入的研究,但對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)機(jī)制的研究甚少。關(guān)于它在成年動物體內(nèi)的功能至今仍不完全清楚。為了能對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)機(jī)制進(jìn)行深入研究,我們構(gòu)建了kif1a啟動子基因全長序列熒光素酶報告基因載體?；驁蟾嫦到y(tǒng)已廣泛應(yīng)用于研究真核細(xì)胞基因的表達(dá)和調(diào)控,利用報告系統(tǒng)研究kif1a啟動子的調(diào)控作用可以最大限度地避免下游基因表達(dá)產(chǎn)物對啟動子的反饋干擾,能真實(shí)地反映外周因素對調(diào)控序列的影響。pGL3-basic是一個能表達(dá)熒光素酶蛋白的質(zhì)粒,是研究啟動子調(diào)控的常用載體[6],其敏感性高且易于表達(dá),與CAT報告基因相比更加適合對基因瞬時表達(dá)的研究,從而使其成為研究可誘導(dǎo)系統(tǒng)一種理想的報道分子。KIF1A 的突變可能抑制腦神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,并且阻斷腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)介導(dǎo)的神經(jīng)元遷移。同時,研究表明KIF1A與學(xué)習(xí)、記憶等高級腦功能的調(diào)節(jié)有關(guān),基于KIF1A的軸突運(yùn)輸能夠調(diào)節(jié)腦的高級功能并反映大腦活動的變化。研究人員在處于富集環(huán)境的活體小鼠的海馬體和體外海馬神經(jīng)元里,觀測到了BDNF增量調(diào)節(jié)KIF1A和KIF1A物質(zhì)輸運(yùn)的現(xiàn)象,通過分析發(fā)現(xiàn)缺少KIF1A的增量調(diào)節(jié)將損害富集作用促使的海馬體突觸發(fā)生和學(xué)習(xí)增強(qiáng),另外發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的KIF1A通過形成突觸前終扣促進(jìn)突觸發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)表明KIF1A對于在富集環(huán)境誘導(dǎo)下BDNF介導(dǎo)的海馬體突觸發(fā)生和學(xué)習(xí)增強(qiáng)是必不可少的。由于富集環(huán)境對大腦的結(jié)構(gòu)和功能有多種影響,所以KIF1A作為一個潛在的改善腦疾病的治療目標(biāo)將有重要的研究價值[7]。

此外,KIF1A是老化相關(guān)的神經(jīng)回路功能障礙和胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)記憶的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)KIF1A功能表達(dá)降低時,機(jī)體神經(jīng)回路功能障礙將隨年齡增加而加速惡化,相反在KIF1A功能表達(dá)上調(diào)時,機(jī)體的神經(jīng)回路功能得到了極大的改善并且壽命也有所延長。同時,針對與記憶和學(xué)習(xí)相關(guān)的測試,KIF1A功能表達(dá)上調(diào)的實(shí)驗(yàn)動物的表現(xiàn)要好于未上調(diào)動物的表現(xiàn)。另外,研究還發(fā)現(xiàn)在KIF1A對胰島素信號通路下調(diào)起到必要的保護(hù)作用。這些發(fā)現(xiàn)使得當(dāng)以維持機(jī)體健康為目的時,與KIF1A有關(guān)的軸突運(yùn)輸已成為藥物干預(yù)的一個潛在目標(biāo)[8]。令人驚異的是 KIF1A還與一些癌癥有關(guān)。與它在神經(jīng)傳輸中的功能一致,KIF1A可能是檢測神經(jīng)母細(xì)胞瘤的一項(xiàng)指標(biāo),而且它也是鼻咽癌的一個潛在腫瘤抑制物,此外其啟動子區(qū)域的甲基化是肺癌的一項(xiàng)指標(biāo)[9,10]?？紤]到KIF1A在生命過程和一些疾病中的重要作用,研發(fā)基于KIF1A的藥物和治療方案也是科研工作者的一個重要選項(xiàng),而這一切必須以闡明KIF1A的運(yùn)動機(jī)制為出發(fā)點(diǎn),這也是目前研究的熱點(diǎn)問題之一。

因此我們應(yīng)用PCR技術(shù)從人基因組DNA克隆出包含kif1a啟動子序列的基因片段,構(gòu)建過度T 載體,再以T載體為模板構(gòu)建kif1a基因全長序列報告基因載體pGL3-kif1a,并轉(zhuǎn)染人SCG細(xì)胞,結(jié)果表明,pGL3-kif1a啟動子在人SCG細(xì)胞中具有明顯的轉(zhuǎn)錄活性?？傊?kif1a熒光素酶報告基因載體pGL3-kif1a的成功構(gòu)建,為體外研究kif1a啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)提供了新的手段。為下一步我們將研究該基因核心啟動子區(qū)、啟動子區(qū)重要的順式調(diào)控元件和相關(guān)的反式作用因子以及該基因?qū)τ谡T導(dǎo)信號的應(yīng)答機(jī)制奠定基礎(chǔ)。