楊超霞, 閆 藝, 張方梅, 朱 勛, 張?jiān)苹?*, 李祥瑞,*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193; 2. 信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院, 河南信陽(yáng) 464000)

微小RNA(microRNA, miRNA)是真核細(xì)胞中的一類長(zhǎng)度約18～24 nt的非編碼單鏈小RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后水平上通過(guò)抑制靶基因的翻譯或降解靶基因發(fā)揮重要的調(diào)控作用(Florisetal., 2016; Kraussetal., 2018)。研究表明，miRNA在昆蟲(chóng)中廣泛存在，且高度保守，參與昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育、變態(tài)、生殖以及細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等幾乎所有的生物學(xué)過(guò)程(Rahimpouretal., 2019; Yeetal., 2019; Song and Zhou, 2020)。隨著miRNA的深入研究，對(duì)特定條件下miRNA表達(dá)量的分析已成為闡述miRNA功能的一個(gè)重要手段(Wangetal., 2017)。

實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)是目前研究miRNA基因表達(dá)的一種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Lüetal., 2018; Youetal., 2018; Shuklaetal., 2019; Yanetal., 2019)。但是在實(shí)際應(yīng)用中，RNA質(zhì)量、cDNA的濃度、轉(zhuǎn)錄、聚合酶擴(kuò)增效率等的變異會(huì)產(chǎn)生系統(tǒng)性的誤差，導(dǎo)致得出錯(cuò)誤甚至相反的結(jié)論(Bustin, 2010)。為了減少樣品間的誤差，通常需要適宜的內(nèi)參基因?qū)iRNA的定量表達(dá)結(jié)果進(jìn)行校正，以便獲得可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Zhangetal., 2015; Wangetal., 2017)。

在qRT-PCR中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因在不同物種或同一物種的不同組織、不同發(fā)育階段和不同環(huán)境脅迫條件下也可能存在表達(dá)水平的變化(Shakeeletal., 2017; Tanetal., 2017; Lüetal., 2018)，即同一個(gè)內(nèi)參基因可以適用于多個(gè)實(shí)驗(yàn)條件，但沒(méi)有一個(gè)內(nèi)參基因可以適用于所有的實(shí)驗(yàn)條件。核內(nèi)小RNA U6 [snRNA(U6)]和核糖體RNA 5S rRNA常被選作昆蟲(chóng)miRNA表達(dá)分析內(nèi)參基因，這兩個(gè)基因在昆蟲(chóng)各組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，且在多種昆蟲(chóng)miRNA的表達(dá)水平研究中已有諸多報(bào)道，如麥長(zhǎng)管蚜Sitobionavenae(Lietal., 2016)、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(Shakeeletal., 2018)、斜紋夜蛾P(guān)rodenialitura(岑永杰等, 2019)和白背飛虱Sogatellafurcifera(Changetal., 2018)等。但是大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，U6或5S rRNA在用作內(nèi)參基因時(shí)，由于實(shí)驗(yàn)條件不同，在一些特定的條件下的表達(dá)并不穩(wěn)定(Wangetal., 2017; Yangetal., 2017; Zhangetal., 2019)。因此，許多特定條件下穩(wěn)定表達(dá)的miRNA被篩選出來(lái)作為內(nèi)參基因，但相關(guān)研究多集中在植物、線蟲(chóng)和人類疾病中(Luoetal., 2018; Ragnietal., 2019; Verstraetenetal., 2019)。迄今為止，只有幾種關(guān)于昆蟲(chóng)miRNA表達(dá)分析內(nèi)參基因篩選的報(bào)道，如梨小食心蟲(chóng)Grapholitamolesta(Wangetal., 2017)、棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera(Yangetal., 2017)、小菜蛾(封冰等, 2014; Zhangetal., 2019)、大黃蜂Bombuslantschouensis(Dongetal., 2019)等。因此，篩選和評(píng)價(jià)不同實(shí)驗(yàn)材料及不同實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定表達(dá)的miRNA表達(dá)分析內(nèi)參基因，對(duì)獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果尤為重要。

麥長(zhǎng)管蚜隸屬同翅目(Homoptera)蚜總科(Aphidoidea)，是小麥生產(chǎn)上重要的世界性害蟲(chóng)(Daietal., 2014; Huangetal., 2015)。隨著研究的不斷深入，在基因水平上研究麥長(zhǎng)管蚜的寄主選擇(Huangetal., 2015)、抗藥性(Weietal., 2019)和翅型分化(Lietal., 2016)等重要生物學(xué)特征時(shí)，首先需要對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，但目前尚無(wú)關(guān)于麥長(zhǎng)管蚜miRNA表達(dá)分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性表達(dá)篩選的報(bào)道，因此亟需篩選穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因或miRNA作為參照。本研究基于Illumina轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定出的麥長(zhǎng)管蚜的9個(gè)miRNA (miR-10-3p, miR-993, miR-276, miR-275, miR-252a, miR-1, miR-375, pc-15和pc-73)和1個(gè)常用內(nèi)參基因U6作為候選內(nèi)參基因，以麥長(zhǎng)管蚜有翅蚜和無(wú)翅蚜不同發(fā)育階段、不同組織以及不同藥劑處理無(wú)翅蚜的樣本為材料，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)這些候選內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)量分析，結(jié)合GeNorm, BestKeeper, ΔCt法, NormFinder和RefFinder 5種方法對(duì)各候選內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)估，為不同實(shí)驗(yàn)條件下選擇合適的麥長(zhǎng)管蚜miRNA表達(dá)分析內(nèi)參基因提供參考依據(jù)，也為其他昆蟲(chóng)篩選miRNA表達(dá)分析內(nèi)參基因提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)飼養(yǎng)及樣本收集

麥長(zhǎng)管蚜成蟲(chóng)于2012年4月采自農(nóng)業(yè)部廊坊作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站的小麥田中(39°30′42″N, 116°36′7″E)，帶回實(shí)驗(yàn)室在養(yǎng)蟲(chóng)籠中連續(xù)擴(kuò)繁多代。從養(yǎng)蟲(chóng)籠內(nèi)挑出無(wú)翅成蚜(實(shí)驗(yàn)中的有翅蚜和無(wú)翅蚜都來(lái)自于最初的無(wú)翅蚜母本)，單頭飼養(yǎng)，連續(xù)飼養(yǎng)3代，將第3代成蚜的初產(chǎn)若蚜作為實(shí)驗(yàn)用蟲(chóng)(在室內(nèi)以中麥175飼喂麥長(zhǎng)管蚜)。飼養(yǎng)條件：溫度20±1℃、相對(duì)濕度50%～70%、光周期16L∶8D。

發(fā)育階段樣本：根據(jù)蛻皮次數(shù)分別收集麥長(zhǎng)管蚜有翅蚜和無(wú)翅蚜1-4齡若蚜和成蟲(chóng)樣本，每齡期3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)根據(jù)齡期蟲(chóng)體大小收集樣本約30 mg。

組織樣本：利用微解剖剪分別切下麥長(zhǎng)管蚜有翅蚜和無(wú)翅蚜的頭(45個(gè)/重復(fù))、胸(30個(gè)/重復(fù))和腹(20個(gè)/重復(fù))3種組織部位，每組織3個(gè)重復(fù)。

藥劑處理樣本：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，獲得了95.1%吡蟲(chóng)啉原藥、97.8%噻蟲(chóng)啉原藥、95%阿維菌素原藥和40%氧樂(lè)果乳油4種藥劑對(duì)麥長(zhǎng)管蚜無(wú)翅成蚜的LC50值(Gongetal., 2020)，將上述各藥劑用吐溫水稀釋至LC50，采用浸葉法處理麥長(zhǎng)管蚜無(wú)翅蚜，24 h后收集存活的無(wú)翅蚜。每處理重復(fù)3次，每重復(fù)收集10頭試蟲(chóng)。

將以上所有收集的樣品均置于液氮浮浴的1.5 mL離心管中速凍，-80℃下保存提取RNA備用。

1.2 供試藥劑及試劑

供試藥劑：吡蟲(chóng)啉原藥(95.1%)、噻蟲(chóng)啉原藥(97.8%)、阿維菌素原藥(95%)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室提供；氧樂(lè)果乳油(40%)由河北新興化工有限公司生產(chǎn)。

供試試劑：總RNA提取試劑TRIzol Reagent(Ambion, 美國(guó))、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒miScriptII RT Kit(Qiagen, 德國(guó))、miRNA熒光定量試劑盒TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa, 日本)。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

按照TRIzol法提取1.1節(jié)中各個(gè)樣本總RNA，結(jié)合ND-2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific, 美國(guó))和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度。按照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒miScript II RT Kit說(shuō)明書(shū)構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄體系，合成cDNA第1鏈。

1.4 候選內(nèi)參基因的篩選和引物設(shè)計(jì)

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)前期麥長(zhǎng)管蚜miRNA Illumina測(cè)序結(jié)果，篩選出在麥長(zhǎng)管蚜兩翅型不同發(fā)育階段表達(dá)量較高且表達(dá)穩(wěn)定的9個(gè)miRNA(miR-10-3p, miR-993, miR-276, miR-275, miR-252a, miR-1, miR-375, pc-15和pc-73)和1個(gè)常用的內(nèi)參基因U6作為候選內(nèi)參基因(表1)，并利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 候選內(nèi)參基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

利用qRT-PCR測(cè)定10個(gè)候選內(nèi)參基因在1.1節(jié)中收集的麥長(zhǎng)管蚜有翅蚜不同發(fā)育時(shí)期、無(wú)翅蚜不同發(fā)育時(shí)期、有翅蚜和無(wú)翅蚜不同組織和4種化學(xué)藥劑處理無(wú)翅蚜樣本中的相對(duì)表達(dá)量。參考miRNA熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)，構(gòu)建熒光定量反應(yīng)體系(25 μL): 2×TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)12.5 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板2 μL, 雙蒸水8.5 μL。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性30 s; 95℃變性5 s, 60℃退火30 s， 70℃延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。最后在60～95℃之間探測(cè)產(chǎn)物的溶解曲線以檢測(cè)引物的質(zhì)量。每樣本重復(fù)測(cè)定3次。利用BIO-RAD CFX-connectTMReal-Time System軟件(Bio-Rad, 美國(guó))對(duì)設(shè)置反應(yīng)條件和結(jié)果輸出。

1.6 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

利用GeNorm(Vandesompeleetal., 2002), ΔCt法(Silveretal., 2006), NormFinder(Andersenetal., 2004)和BestKeeper(Pfaffietal., 2004)對(duì)10個(gè)候選內(nèi)參基因在1.1節(jié)中收集的麥長(zhǎng)管蚜有翅蚜不同發(fā)育時(shí)期、無(wú)翅蚜不同發(fā)育時(shí)期、有翅蚜和無(wú)翅蚜不同組織和4種化學(xué)藥劑處理無(wú)翅蚜樣本中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，具體方式參照其使用說(shuō)明。最后，通過(guò)RefFinder在線網(wǎng)站(https:∥www.heartcure.com.au/reffinder/)對(duì)所有候選內(nèi)參基因進(jìn)行綜合比較與穩(wěn)定性評(píng)估(Xieetal., 2012)。

GeNorm計(jì)算不同處理中各內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性(M值)，M值越小代表選擇的內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好。同時(shí)，可利用GeNorm計(jì)算得到配對(duì)變異值V，當(dāng)Vn/(n+1)<0.15時(shí)，則表示該條件下最佳內(nèi)參基因的數(shù)目為n個(gè)；NormFinder計(jì)算不同樣本組內(nèi)和組間的變化來(lái)評(píng)估內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值(SV)，該值越小表示內(nèi)參基因越穩(wěn)定；ΔCt法是對(duì)各內(nèi)參基因的ΔCt值的標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行兩兩比較，對(duì)基因表達(dá)的穩(wěn)定性進(jìn)行排序；BestKeeper是以每個(gè)基因之間產(chǎn)生配對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)、變異系數(shù)(CV)及相關(guān)系數(shù)(R)等來(lái)評(píng)估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 引物擴(kuò)增效率和特異性評(píng)價(jià)

qRT-PCR結(jié)果顯示，各候選內(nèi)參基因的溶解曲線均為單峰，表明引物具有特異性，且各內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率均在90%～102%之間，相關(guān)系數(shù)R2值均高于0.986，表明各候選內(nèi)參基因引物設(shè)計(jì)合理，具有良好的擴(kuò)增效率和特異性，符合熒光定量分析的要求，適用于相應(yīng)的定量測(cè)定(表1)。

2.2 候選內(nèi)參基因表達(dá)水平

基因的表達(dá)豐度是內(nèi)參基因的首要篩選條件。在麥長(zhǎng)管蚜兩翅型不同發(fā)育階段、不同組織及不同藥劑處理的樣品中，10個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值均在15～30個(gè)循環(huán)之間(圖1)，表明10個(gè)內(nèi)參基因在不同實(shí)驗(yàn)條件下均具有較高的表達(dá)量，符合內(nèi)參基因篩選的條件。

基于Ct值的變化，表明各候選內(nèi)參基因表達(dá)量在不同的條件下都有一定的變化。在有翅蚜不同發(fā)育階段和無(wú)翅蚜不同發(fā)育階段miR-276和miR-1的表達(dá)水平均相對(duì)較高，其次是miR-10-3p和U6。Ct值變化大小也是內(nèi)參基因重要篩選條件，變化越小，表明內(nèi)參基因越穩(wěn)定(李曉等, 2018)。pc-15和pc-73表達(dá)量變化較大，其他基因變化相對(duì)較小(圖1: A, B)。在有翅蚜和無(wú)翅蚜不同組織中，miR-10-3p, miR-276和miR-1的表達(dá)水平相對(duì)較高，其次是U6和pc-15，Ct值變異均不大(圖1: C)。在不同藥劑處理無(wú)翅蚜中，miR-10-3p和miR-276的表達(dá)水平相對(duì)較高，其次是miR-1和U6，Ct值變異均不大(圖1: D)。

2.3 候選內(nèi)參基因在不同發(fā)育階段有翅蚜中的表達(dá)穩(wěn)定性

GeNorm分析結(jié)果(表2)表明，miR-993, miR-252a, miR-375和miR-276表達(dá)較穩(wěn)定；NormFinder和ΔCt分析表明，miR-276, miR-993和miR-252a表達(dá)較穩(wěn)定；BestKeeper分析結(jié)果表明，U6, miR-276和miR-1表達(dá)較穩(wěn)定。RefFinder綜合分析表達(dá)穩(wěn)定性排序?yàn)閙iR-252a, miR-276, miR-993,U6, miR-375, miR-1, miR-10-3p, miR-275, pc-15和pc-73。5種分析方法均表明pc-15和pc-73為最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

GeNorm分析顯示在不同發(fā)育階段有翅蚜中，V2/3的配對(duì)變異值為0.06，低于0.15(圖2)，表明需要2個(gè)內(nèi)參基因。綜合分析，在不同發(fā)育階段有翅蚜中，2個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因優(yōu)化組合是miR-252a和miR-276。

2.4 候選內(nèi)參基因在不同發(fā)育階段無(wú)翅蚜中的表達(dá)穩(wěn)定性

GeNorm和ΔCt分析結(jié)果(表3)表明，miR-993, miR-276和miR-252a為較穩(wěn)定的內(nèi)參基因；NormFinder分析結(jié)果表明，miR-252a, miR-375和miR-993為較穩(wěn)定的內(nèi)參基因；BestKeeper分析結(jié)果表明，U6, miR-276和miR-252a為較穩(wěn)定的內(nèi)參基因。RefFinder分析結(jié)果表明，表達(dá)穩(wěn)定性排序?yàn)閙iR-993, miR-276, miR-252a, miR-10-3p,U6, miR-375, miR-1, miR-275, pc-15和pc-73。5種分析方法均表明pc-15和pc-73為最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

表3 麥長(zhǎng)管蚜不同發(fā)育階段無(wú)翅蚜中miRNA表達(dá)分析內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析Table 3 Analysis of expression stability of candidate reference genes for expression analysisof miRNAs in wingless aphids of Sitobion avenae at different developmental stages

GeNorm分析結(jié)果顯示在不同發(fā)育階段無(wú)翅蚜中，V2/3的配對(duì)變異值為0.04，低于0.15(圖2)，表明需要2個(gè)內(nèi)參基因。綜合分析，在不同發(fā)育階段無(wú)翅蚜中，2個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因優(yōu)化組合是miR-993和miR-276。

2.5 候選內(nèi)參基因在有翅蚜和無(wú)翅蚜不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性

GeNorm分析結(jié)果表明，miR-993和miR-252a為較穩(wěn)定的內(nèi)參基因；NormFinder和ΔCt分析結(jié)果表明，miR-275和miR-10-3p為較穩(wěn)定的內(nèi)參基因；BestKeeper分析結(jié)果表明，U6和pc-15為較穩(wěn)定的內(nèi)參基因。RefFinder分析結(jié)果表明，表達(dá)穩(wěn)定性排序?yàn)閙iR-275, miR-10-3p, miR-252a, miR-375, miR-993, pc-73, miR-276, pc-15, miR-1和U6。除了BestKeeper以外，其他表達(dá)穩(wěn)定性分析均表明U6為最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因(表4)。

表4 麥長(zhǎng)管蚜有翅蚜和無(wú)翅蚜不同組織中miRNA表達(dá)分析內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析Table 4 Analysis of expression stability of candidate reference genes for expression analysisof miRNAs in different tissues of winged and wingless aphids of Sitobion avenae

GeNorm分析結(jié)果表明，V2/3的配對(duì)變異值為0.06，低于0.15(圖2)，表明需要2個(gè)內(nèi)參基因。綜合分析，在不同組織中2個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因優(yōu)化組合是miR-275和miR-10-3p。

2.6 候選內(nèi)參基因在4種藥劑處理無(wú)翅蚜中的表達(dá)穩(wěn)定性

GeNorm, NormFinder和ΔCt分析結(jié)果表明，miR-10-3p和miR-993為較穩(wěn)定的內(nèi)參基因，且最不穩(wěn)定的為pc-15；BestKeeper分析結(jié)果表明，miR-1和pc-73為較穩(wěn)定的內(nèi)參基因，最不穩(wěn)定的為U6。RefFinder分析結(jié)果表明，表達(dá)穩(wěn)定性排序?yàn)閙iR-993, miR-10-3p, miR-1, miR-275, miR-375, pc-73, miR-276, miR-252a, pc-15和U6(表5)。

GeNorm分析顯示，V2/3的配對(duì)變異值為0.06，低于0.15(圖2)，表明需要2個(gè)內(nèi)參基因。綜合分析，在不同藥劑處理無(wú)翅蚜中，2個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因優(yōu)化組合是miR-993和miR-10-3p。

圖2 麥長(zhǎng)管蚜不同條件下最適miRNA表達(dá)分析內(nèi)參基因數(shù)目Fig. 2 Optimal number of reference genes for expression analysis of miRNAs in Sitobion avenaeanalyzed under different conditions

3 討論

候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)常采用多個(gè)方法依據(jù)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行綜合分析，并根據(jù)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性高低進(jìn)行排序。本研究首先使用4個(gè)方法(GeNorm, NormFinder, ΔCt和BestKeeper)進(jìn)行獨(dú)立排序，在不同的實(shí)驗(yàn)條件下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是miR-252a, miR-275和miR-993，但這3個(gè)基因的穩(wěn)定性排序并不完全一致，在其他昆蟲(chóng)內(nèi)參基因篩選中也存在類似情況(Wangetal., 2017; Yangetal., 2017; Dongetal., 2019; Zhangetal., 2019)，這可能與4種方法的計(jì)算方法及評(píng)價(jià)指標(biāo)不同有關(guān)(Vandesompeleetal., 2002; Andersenetal., 2004; Pfaffietal., 2004; Silveretal., 2006)。BestKeeper是根據(jù)每個(gè)基因之間產(chǎn)生配對(duì)的相關(guān)系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)共同判斷，從而對(duì)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行排名，而其他方法計(jì)算原理類似，是對(duì)每一個(gè)獨(dú)立的內(nèi)參基因進(jìn)行分析，所以BestKeeper的分析結(jié)果與其他方法的研究結(jié)果排序差異較大(Pfaffletal., 2004; Tengetal., 2012)，與本研究結(jié)果也相符。如在麥長(zhǎng)管蚜不同藥劑處理下，GeNorm, NormFinder, ΔCt和RefFinder分析均顯示miR-10-3p和miR-993為最穩(wěn)定的基因，而B(niǎo)estKeeper分析顯示miR-1和pc-73為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因(表5)。在棉鈴蟲(chóng)miRNA表達(dá)分析內(nèi)參基因篩選中也發(fā)現(xiàn)BestKeeper與其他方法分析的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序差異較大(Yangetal., 2017)。

一直以來(lái)，U6和5S rRNA作為miRNA表達(dá)分析傳統(tǒng)的內(nèi)參基因，常被用來(lái)評(píng)估m(xù)iRNA目的基因的表達(dá)(Lin and Lai, 2013; Hanetal., 2014; Gharbietal., 2015)，但已有越來(lái)越多的研究證實(shí)篩選出的新的miRNA表達(dá)分析內(nèi)參基因比傳統(tǒng)的內(nèi)參基因更穩(wěn)定(Turneretal., 2013; 封冰等, 2014; Dongetal., 2019; Zhangetal., 2019)。本研究也發(fā)現(xiàn)，麥長(zhǎng)管蚜不同實(shí)驗(yàn)條件下，除BestKeeper以外，其他幾種分析方法均顯示傳統(tǒng)U6的穩(wěn)定性比較差。以上結(jié)果表明，傳統(tǒng)的內(nèi)參基因并不適合作為miRNA定量表達(dá)的通用內(nèi)參基因，不同實(shí)驗(yàn)材料在不同條件下選用的內(nèi)參基因均不相同。我們應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)材料和處理?xiàng)l件篩選合適的內(nèi)參基因，才能獲得更準(zhǔn)確的定量結(jié)果。

很多研究證實(shí)，使用2個(gè)或2個(gè)以上的內(nèi)參基因利用其幾何平均值校正目的基因的表達(dá)結(jié)果，有利于降低實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的誤差(Shakeeletal., 2017; 楊苓等, 2017; 賈冰等, 2019)。利用GeNorm軟件計(jì)算配對(duì)變異值V，確定最優(yōu)內(nèi)參基因數(shù)目。 當(dāng)Vn/n+1值小于0.15時(shí)，說(shuō)明內(nèi)參基因的最佳數(shù)目為n。通過(guò)GeNorm分析顯示，麥長(zhǎng)管蚜在4種不同條件下V2/3的值均小于0.15，說(shuō)明在4種不同條件下最佳內(nèi)參基因的數(shù)目均為2(圖2)。因此，在做麥長(zhǎng)管蚜miRNA基因定量表達(dá)的研究中，最好使用2個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行校正。再進(jìn)一步通過(guò)在線程序RefFinder對(duì)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行綜合排名，最終確定內(nèi)參基因的最優(yōu)選擇，從而避免單個(gè)軟件分析的片面性(Xieetal., 2012)。通過(guò)綜合分析顯示，麥長(zhǎng)管蚜在不同條件下使用的內(nèi)參基因組合不同，如不同發(fā)育階段有翅蚜中最優(yōu)內(nèi)參基因組合是miR-252a和miR-276(表2; 圖2)，不同發(fā)育階段無(wú)翅蚜中最優(yōu)內(nèi)參基因組合是miR-993和miR-276(表3; 圖2)，有翅蚜和無(wú)翅蚜不同組織中最優(yōu)內(nèi)參基因組合是miR-275和miR-10-3p(表4; 圖2)，不同藥劑處理下的最優(yōu)內(nèi)參組合是miR-993和miR-10-3p(表5; 圖2)。此外，不同昆蟲(chóng)在不同條件下選用的內(nèi)參基因組合及數(shù)目均不盡相同，即使在相同實(shí)驗(yàn)條件下需要的內(nèi)參基因也存在較大差異(Wangetal., 2017; Yangetal., 2017; Dongetal., 2019)。因此，在做miRNA定量表達(dá)分析中，需要在不同昆蟲(chóng)特定條件下篩選特有的內(nèi)參基因，才能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

總之，絕對(duì)穩(wěn)定的miRNA表達(dá)分析內(nèi)參基因并不存在。miRNA的表達(dá)穩(wěn)定性隨物種而異，同時(shí)也會(huì)受實(shí)驗(yàn)處理方法和條件的影響。本研究篩選出了適合麥長(zhǎng)管蚜不同發(fā)育階段、不同組織和不同藥劑處理下穩(wěn)定表達(dá)的miRNA表達(dá)分析內(nèi)參基因及最優(yōu)組合，為后期應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)開(kāi)展其miRNA基因的表達(dá)及功能分析中內(nèi)參基因的選擇提供了依據(jù)，也可為其他昆蟲(chóng)內(nèi)參基因篩選提供一定參考。