馬忠梅，寧程程，郭 蘊(yùn)，季春暉，孟慶玲，喬 軍*，張星星，才學(xué)鵬

(1. 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院, 新疆 石河子 832003; 2. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 新疆 石河子 832000; 3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所, 甘肅 蘭州 730046)

【研究意義】鼠傷寒沙門菌(SalmonellaentericasubspeciesentericaserovarTyphimurium，ST)屬于腸桿菌科的革蘭氏陰性[1]、桿狀及兼性厭氧菌[2]，是一種重要的人獸共患病原菌之一[3]。ST廣泛存在于自然界，可在污水、動物排泄物和土壤中長期存活[4]。同時(shí)，ST可以感染在多種家禽和家畜，并且通過動物源性食品引起人類感染，導(dǎo)致食物中毒。此外，該菌在不利的環(huán)境中易形成生物被膜，可增強(qiáng)該菌對化學(xué)物質(zhì)、應(yīng)激(紫外輻射、滲透壓和干燥等)、抗生素和宿主免疫系統(tǒng)具有較強(qiáng)的抵抗力[5]，給該菌引起相關(guān)疾病的防控帶來巨大的挑戰(zhàn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大量的研究表明，ST可在多種毒力因子的參與下感染多種宿主，其完成侵染、胞內(nèi)生存、繁殖和致病等生活過程需要多種調(diào)控因子的協(xié)同作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，LysR型轉(zhuǎn)錄因子家族在細(xì)菌群體感應(yīng)、毒力、細(xì)菌耐藥性、生物被膜形成和細(xì)胞分裂的調(diào)控相關(guān)，但LysR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在鼠傷寒沙門菌調(diào)控功能暫不清楚[7]。【本研究切入點(diǎn)】STM0859基因?qū)儆贚ysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，然而，STM0859具體的生物學(xué)功能尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為探究STM0859基因的功能，本研究對鼠傷寒沙門菌SL1344菌株STM0859基因進(jìn)行克隆、編碼蛋白分子特征和遺傳進(jìn)化分析，為進(jìn)一步探討STM0859對ST生長特性、環(huán)境應(yīng)激、耐藥性和毒力的調(diào)控作用奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基及試劑

ST SL1344強(qiáng)毒株和大腸桿菌(E.coli)DH5α由石河子大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。LB肉湯瓊脂培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；DL-2000 DNA Marker、pMD19-T(simple)載體購自TaKaRa公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自諾維森生物公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank登錄的STM0859基因序列(登錄號：FQ312003.1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增STM0859基因上游引物STM0859F5′-GGAATTCATGCACTTTGATATAAAAG ATTTA-3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，下游引物STM0859R5′-CCTCGAGTCACTCAGTCTGAGCT GTGAG-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，由北京華大基因公司合成。

1.3 ST STM0859基因的擴(kuò)增、克隆及測序

挑取ST-SL1344單菌落于LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃水平搖床培養(yǎng)15 h，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明書提取ST-SL1344分離株基因DNA，以DNA為模板，分別以STM0859F和STM0859R為引物PCR 擴(kuò)增出STM0859基因，PCR的反應(yīng)體系為：H2O 7 μl，PCR Mixture 10 μl，上下游引物各0.5 μl，DNA模板2 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，57 ℃退火50 s，72 ℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠在0.5×TBE電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，與Marker DL-2000相比，將目的片段用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收，并與pMD19-T(simple)載體4 ℃連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR篩選陽性菌克隆，送至華大基因公司測序。

1.4 STM0859基因及其編碼蛋白質(zhì)的分子特征分析

利用ProtParam在線軟件( http://web.expasy.org/protparam/)計(jì)算蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)；通過Protscale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白質(zhì)的親水性與疏水性；利用PrositeScan(https://prosite.expasy.org/prosite.html)分析蛋白的結(jié)構(gòu)域；通過SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行蛋白質(zhì)的信號肽預(yù)測；利用DNAStar軟件預(yù)測STM0859蛋白的二級結(jié)構(gòu)，應(yīng)用SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

1.5 STM0859基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析

將ST-SL1344STM0859基因與GenBank已知的10多株ST不同菌株及其他種屬細(xì)菌的LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因核苷酸序列進(jìn)行對比，應(yīng)用MEGA5.0軟件對STM0859基因核苷酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，并采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 STM0859基因的擴(kuò)增、克隆及測序

用STM0859F與STM0859R引物擴(kuò)增STM0859基因，產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測得到約891 bp的目的條帶(圖1)。PCR產(chǎn)物與pMD19-T(simple)載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α后通過菌液PCR篩選陽性克隆(圖2)，對陽性克隆進(jìn)行測序分析，結(jié)果顯該基因與GenBank中預(yù)期的STSTM0859基因片段大小一致。

2.2 STM0859基因核苷酸及編碼氨基酸序列分析

由圖3測序結(jié)果顯示，ST-SL1344STM0859基因全長891 bp，編碼296個(gè)氨基酸；通過Motif Scan 在線軟件分析發(fā)現(xiàn)含1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(151aa～154aa); 6個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)(61aa～64aa,137aa～140aa,171aa～174aa, 184aa～187aa,>195aa～198aa,257aa～260aa);6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(35aa～37aa, 53aa～55aa,65aa～67aa，164aa～166aa，266aa～268aa，284aa ～286aa); 5個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)(23aa～28aa,56aa～61aa, 146aa～151aa,224aa～229aa);1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)：(22aa～28aa); 1個(gè)LysR家族底物結(jié)合域(90aa～293aa)1個(gè)由螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋構(gòu)成的HTH結(jié)構(gòu)域(5aa～64aa)1個(gè)Orn/Lys/Arg脫羧酶C-末端結(jié)構(gòu)域(21aa～83aa)。

2.3 STM0859蛋白分子特征分析

在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，ST-SL1344株STM0859基因編碼蛋白分子量為33.6 kDa，等電點(diǎn)為7.83，其中Leu (L)含量最豐富(11.1 %)。疏水性平均數(shù)為-0.074，為親水性蛋白。SignalP 4.0 Server分析顯示，STM0859蛋白無信號肽序列；TMHMM 2.0 Server分析顯示，STM0859蛋白不存在跨膜區(qū)。與大腸桿菌和不動桿菌LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相比，三者在其N端均具有1個(gè)H-T-H超二級結(jié)構(gòu)域(圖4)，在C端有1個(gè)PBP2配體結(jié)合域，不動桿菌在N端還具有一個(gè)RbcR結(jié)構(gòu)域，提示不同的細(xì)菌LysR家族蛋白成員在分子特征上存在一定的差異。

2.4 STM0859蛋白的高級結(jié)構(gòu)分析

高級結(jié)構(gòu)分析表明，STM0859含有α-螺旋(54.05 %)、β-折疊(6.76 %)無規(guī)則卷曲(21.28 %)和延伸鏈(17.91 %)組成。SWISS-MODEL預(yù)測該蛋白含有2個(gè)α-螺旋和2個(gè)β-折疊，形成了螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域 (圖5～6)。

2.5 STM0859基因序列的遺傳進(jìn)化分析

與GenBank上18株不同來源的細(xì)菌LysR家族相應(yīng)的同源基因相比，ST SL1344株與ST 14028S親緣性最高，位于同一小分支；與腸道沙門氏菌腸道亞種PNCS009887、PNCS01484、CVM N26626及SC-B671株親緣性相對較近，但與R8-34041和ST1141等株親緣性較遠(yuǎn)；與雞腸炎血清型str.287/911株、大腸桿菌str.K-12亞群MG 1655株、沙雷氏菌 AS13株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，位于不同的分支上(圖7)，提示STM0859基因在ST菌株間具有高度的保守性，在屬間具有相對保守性。

3 討 論

ST是一種重要的食源性人獸共患菌，該菌可通過巨噬細(xì)胞吞噬進(jìn)入宿主細(xì)胞，并在胞漿內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌。該菌在完成吞噬小體逃逸、胞內(nèi)生存、繁殖和細(xì)胞間擴(kuò)散過程中需要多種毒力因子和轉(zhuǎn)錄因子的參與。轉(zhuǎn)錄因子(Transcription，TF)是一類能夠結(jié)合在特定基因上游特異核苷酸序列上的蛋白，并能調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子在分子結(jié)構(gòu)上通常含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)、效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(TAD)與配體結(jié)合域(LBD)等[8]。研究發(fā)現(xiàn)，LysR家族蛋白含有上述結(jié)構(gòu)域，屬于轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控許多病原微生物的基因表達(dá)。然而，LysR家族成員眾多，其特定的生物學(xué)功能需要深入研究[9]。

現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，LysR一般由約300個(gè)氨基酸組成，N端都包含一個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序，構(gòu)成保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[10-11],C端則為相對變異的協(xié)同因子作用區(qū)域，大部分LysR家族成員的該區(qū)域可結(jié)合一個(gè)來自于環(huán)境或代謝產(chǎn)生的小分子誘導(dǎo)劑或阻遏物，從而激活或抑制目標(biāo)基因表達(dá)。本研究顯示，STM0859屬于LysR家族成員。有研究顯示，LysR家族蛋白在不同的培養(yǎng)基和不同培養(yǎng)環(huán)境中表達(dá)量差異顯著，可能與細(xì)菌能量代謝、環(huán)境應(yīng)激、耐藥性和毒力的調(diào)控相關(guān)。在大腸桿菌中，K-12 LTTRs調(diào)節(jié)氮源利用、氨基酸生物合成和分解代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞解毒[12-13]。BenM和CatM LTTRs可影響不動桿菌ADP1菌株芳香族化合物的降解[14-15]。鼠疫耶爾森菌的RovM、銅綠假單胞菌PA14的MvfR和霍亂弧菌的AphB均與毒力有關(guān)[16-19]。 Sheehan 等(2015)研究布魯氏菌LysR家族成員VtlR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子發(fā)現(xiàn)，VtlR控制流產(chǎn)布魯氏菌小RNA編碼基因abcR2的表達(dá)，而流產(chǎn)布魯氏菌的野生型毒力需要兩個(gè)小RNA，AbcR1和AbcR2，表明LysR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在布魯氏菌中與其毒力調(diào)控有關(guān)。Manman 等(2019)研究惡臭假單胞菌菌LysR家族成員GcdR發(fā)現(xiàn)，GcdR通過抑制谷胱甘肽羥基化途徑中2個(gè)關(guān)鍵基因csiD和lhgO的轉(zhuǎn)錄，激活谷胱甘肽coa脫氫途徑中兩個(gè)關(guān)鍵基因gcdH和gcoT的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)谷胱甘肽的分解代謝反應(yīng)。Fu等(2019)利用western blot和基因缺失技術(shù)證實(shí)LysR家族蛋白在抗藥性治療后在嗜水氣單胞菌中表達(dá)下調(diào)，提示LysR家族成員參與了細(xì)菌耐藥性的調(diào)控作用。

目前，鼠傷寒沙門菌STM0859的生物學(xué)功能尚不清楚。本研究首次克隆了ST SL1344強(qiáng)毒株轉(zhuǎn)錄因子STM0859基因，并對其分子結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，證實(shí)STM0859屬于LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。同源性分析顯示，ST SL1344株STM0859基因與ST-14028S、ST-FDAARGOS_317、ST-TW-Stm6等菌株同源性很高，表明該基因在ST菌株間高度保守。與腸炎沙門氏菌亞種、雞腸炎血清型str.287/91與大腸桿菌str.K-12亞群MG1655親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。STM0859蛋白含有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域，推測其可與ST某些基因的順式作用元件DNA序列結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控作用，為深入研究該蛋白在ST能量代謝、環(huán)境應(yīng)激、耐藥性和毒力的調(diào)控作用奠定了前期基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

通過對鼠傷寒沙門菌STM0859基因生物信息學(xué)分析，其屬于LysR家族，該家族蛋白與細(xì)菌能量代謝、環(huán)境應(yīng)激、耐藥性和毒力的調(diào)控相關(guān)，因此STM0859基因可能參與了ST毒力、環(huán)境應(yīng)激等過程，STM0859基因在ST菌株間具有高度的保守性，在屬間具有相對保守性。研究結(jié)果為深入研究該蛋白在ST能量代謝、環(huán)境應(yīng)激、耐藥性和毒力的調(diào)控作用奠定了前期基礎(chǔ)。