錢曉慧，陳龍清, 2，李 彪，施 蕊,2*

(1.西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650224；2.云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心，云南 昆明 650224；3.云南林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650224)

蠟梅(ChimonanthuspraecoxL.)為蠟梅科蠟梅屬落葉灌木，是中國特有的冬季觀花優(yōu)良樹種，也是珍貴的香料和藥用植物，其活性成分具有抑制病原菌、抗氧化等功效[1]?！狙芯恳饬x】花香作為蠟梅的典型特征之一，從中篩選出花香優(yōu)良的品種，運(yùn)用在其他產(chǎn)生較少揮發(fā)性化合物的開花植物的花香基因改造中具有潛在價(jià)值[2]。花香不僅作用于植物間的交流、繁殖和自我保護(hù)[3-4]，還能刺激人類的嗅覺細(xì)胞產(chǎn)生愉悅感?；ㄏ悴粌H在植物生長繁殖中起到關(guān)鍵作用，還被廣泛運(yùn)用到香水、香精、化妝品和藥物中[5]，而蠟梅作為中國著名的傳統(tǒng)冬季香花植物被廣泛研究?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Li等[6]研究發(fā)現(xiàn)花香的釋放與蜜腺的分布有關(guān)；陸安霞等[7]結(jié)合感官審評(píng)與GC-MS分析發(fā)現(xiàn)全開狀態(tài)的蠟梅花采摘后離體攤放20 h內(nèi)能較好地保持花香的鮮靈度和濃郁度，且在12 ～ 20 h揮發(fā)性物質(zhì)種類豐富。周繼榮等[8]研究了蠟梅4個(gè)品種不同開花期的香氣成分，認(rèn)為在花茶生產(chǎn)中適宜選擇內(nèi)被片紫色條紋較少的素心和喬種品種，且盛開的蠟梅鮮花。此外，由于利用多元統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)具有可使分析結(jié)果更加客觀等優(yōu)點(diǎn)，被漸漸運(yùn)用到香氣分析中，李衛(wèi)芳等[9]用聚類分析將12個(gè)具代表性的漢中仙毫分為3類，并通過主成分分析建立了香氣質(zhì)量評(píng)價(jià)模型；李瑞等[10]根據(jù)香氣物質(zhì)的組成和質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并運(yùn)用主成分分析將蜜脆蘋果歸于酯香型蘋果的乙醇酯型品種；郝麗寧等[11]利用主成分分析和聚類分析評(píng)價(jià)黃瓜果實(shí)的香氣物質(zhì)組成，發(fā)現(xiàn)不同基因型黃瓜香氣物質(zhì)種類、含量的差異是導(dǎo)致果實(shí)的風(fēng)味差異的原因。史衛(wèi)東等[12]用主成分分析和聚類分析法對(duì)菜心和芥藍(lán)資源的表型多樣性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，這為挖掘和利用優(yōu)異蔬菜種質(zhì)資源提供參考?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前尚未對(duì)云南地區(qū)不同基因型蠟梅花香氣成分進(jìn)行差異研究，并且大部分集中于蠟梅種質(zhì)資源調(diào)查[13-15]、葉片的揮發(fā)油以及提取物的生物活性研究[16-19]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過將花香結(jié)合蠟梅的表型性狀研究，可為云南地區(qū)蠟梅的品種優(yōu)選和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

依據(jù)表型差異選取云南地區(qū)8個(gè)不同基因型蠟梅品種(表1、圖1)，樣品采自位于云南省昆明市的西南林業(yè)大學(xué)(品種編號(hào)開頭為XL)和黑龍?zhí)豆珗@(品種編號(hào)開頭為HLT)。

1.2 試驗(yàn)方法

采摘蠟梅花于25 mL頂空進(jìn)樣瓶中，用手動(dòng)壓接機(jī)(Cat.#23398，20 mm，made in USA)按壓鋁蓋扣住硅膠墊密封。送入自動(dòng)頂空進(jìn)樣儀(美國賽默飛世爾公司)，45 ℃下預(yù)熱并平衡30 min后取樣進(jìn)行GC/MS(美國賽默飛世爾公司TRACE GCULTRA ITQ 900氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀)分析，分流進(jìn)樣，分流比15∶1。

色譜柱為Inert Cap 5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；色譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱溫起始溫度50 ℃，保持5 min，3 ℃·min-1升溫到60 ℃，保持15 min；2 ℃·min-1升溫到80 ℃，保持3 min；4 ℃·min-1升溫到120 ℃。載氣He (99.999%)，柱流量1 mL·min-1。質(zhì)譜條件：電離方式EI，電子能量70e V，離子源溫度200 ℃，接口溫度260 ℃。掃描質(zhì)量50～650 amu。

表1 蠟梅表型性狀

然后經(jīng)計(jì)算機(jī)譜庫(NIST MS Search)檢索，確定各組分，運(yùn)用峰面積歸一法，得出各組分相對(duì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS Statistic 20.0 軟件對(duì)蠟梅花各類花香成分物質(zhì)進(jìn)行主成分分析和聚類分析，比較各類成分對(duì)蠟梅花香的貢獻(xiàn)及各類基因型蠟梅的綜合品質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型蠟梅花表型性狀

試材中花型為喇叭型的有2種，荷花型3種，盤蝶形1種，鐘型1種，磬口型1種；花徑最大為2.37 cm×2.58 cm，最小為1.12 cm×1.27 cm；花被片數(shù)最多的為24片，最少為20片；中被片形狀為橢圓形的有6種，闊卵形1種，長條形1種；中被片邊緣波皺的有3種，內(nèi)扣5種，平展1種；紅心條紋4種、素心3種、暈心條紋1種。

2.2 不同基因型蠟梅花揮發(fā)性成分分析

8個(gè)基因型蠟梅花主要成分明顯不同，經(jīng)計(jì)算機(jī)譜庫檢索以及相關(guān)文獻(xiàn)查閱[20-21]鑒定出各品種間成分不同，如圖2和表2所示。

從離子圖中看出，每個(gè)品種都含有羅勒烯(一種無環(huán)單萜類，有α、cis-β和 trans-β型)，而且相對(duì)含量很高，但是羅勒烯易氧化而形成同分異構(gòu)體物質(zhì)，所以8個(gè)基因型蠟梅的羅勒烯類型不統(tǒng)一；HLT015和HLT016與其他相比，2,4-已二烯對(duì)這2種蠟梅花整體香味的貢獻(xiàn)率比較高，而乙酸芐酯對(duì)HLT016整體香味的貢獻(xiàn)率比較低，對(duì)HLT015無貢獻(xiàn)。羅勒烯是甜香，(E) -β-羅勒烯卻是青草香味，而α-羅勒烯卻是果香、花香[22]；乙酸芐酯具有水果香味并帶有茉莉香氣[23]，這可能是造成8個(gè)基因型蠟梅花香味不一的原因。

表2 蠟梅盛開期香氣成分及相對(duì)含量

續(xù)表2 Continued table 2

8個(gè)基因型蠟梅中共同含有的揮發(fā)物質(zhì)主要為(-)-α-蒎烯、羅勒烯、氧化芳樟醇、桃金娘烯醇、苯甲醇、水楊酸甲酯8種。從XL003中共鑒定出27種香氣成分，主要為α-羅勒烯(43.64 %)、乙酸芐酯(34.63 %)、苯甲醇(7.59 %)和丁香酚(5.56 %)；從XL002中共鑒定出29種香氣成分，主要為羅勒烯(44.41 %)和乙酸芐酯(26.53 %)；從HLT015中共鑒定出36種香氣成分，主要為α-羅勒烯(75.87 %)和苯甲醇(6.03 %)；從HLT016中共鑒定出36種香氣成分，主要為(E)-β-羅勒烯(68.23 %)苯甲醇(11.56 %)和乙酸芐酯(1.63 %)；從HLT017中共鑒定出33種香氣成分，主要為(E)-β-羅勒烯(41.55 %)、乙酸芐酯(33.6 %)、苯甲醇(14.41 %)和丁香酚(1.84 %)；從HLT040中共鑒定出33種香氣成分，主要為α-羅勒烯(35.58 %)、乙酸芐酯(33.68 %)、苯甲醇(17.31 %)和丁香酚(4.51 %)；從HLT012中共鑒定出31種香氣成分，主要為α-羅勒烯(48.55 %)、乙酸芐酯(23.53 %)、苯甲醇(15.49 %)、水楊酸甲酯(3.37 %)和丁香酚(3.16 %)；從XL014中共鑒定出17種香氣成分，主要為(E)-β-羅勒烯(70.79 %)、乙酸芐酯(17.48 %)、水楊酸甲酯(3.95 %)、丁香酚(2.61 %)和苯甲醇(1.99 %)。

2.3 蠟梅花香成分物質(zhì)種類組成及含量分析

花香成分物質(zhì)組成及其含量在不同基因型蠟梅中有差異(圖3)。HLT040萜烯類物質(zhì)占比最少，酯類和醇類物質(zhì)占比最多。HLT015萜烯類物質(zhì)占比最多，為80.58 %；酯類物質(zhì)占比最少，為0.69 %。XL002是烷烴類和酮類占比最多，分別為0.94 %和9.75 %；XL014幾乎不含有烷烴類(0 %)，酮類和醇類物質(zhì)占比最少，分別為2.22 %和2.38 %。所以蠟梅花不同品種間具有獨(dú)特香味，不僅與羅勒烯類型有關(guān)，有可能是萜烯類、酯類、醇類等種類含量、比例變化的共同結(jié)果。

2.4 蠟梅花各類花香成分物質(zhì)主成分分析

由于蠟梅花香物質(zhì)成分較多，為了更簡明地描述各類花香成分物質(zhì)對(duì)蠟梅花香的貢獻(xiàn)，采用主成分分析法降維處理數(shù)據(jù)，對(duì)萜烯類、酯類、醇類、烷烴類、酮類和其他共6類花香物質(zhì)成分做主成分分析。

第一主成分、第二主成分和第三主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率(圖4、表3)達(dá)95.506 %，高于85 %，這3個(gè)成分基本可以反映原始數(shù)據(jù)[24]。

在主成分得分系數(shù)矩陣表中，各香氣成分的絕對(duì)值反映了其對(duì)主成分貢獻(xiàn)率的大小，絕對(duì)值越大，則貢獻(xiàn)率也越大。從表4中可以看出，第一主成分中貢獻(xiàn)率為萜烯類>酯類>其他>醇類>烷烴類；第二主成分中貢獻(xiàn)率結(jié)果為烷烴類>酮類>其他>醇類>萜烯類>酯類；第三主成分中貢獻(xiàn)率為醇類>酮類>烷烴類>其他>酯類>萜烯類。

F1=-0.348X1+0.341X2+0.165X3+0.057X4-0.161X5+0.241X6

表3 因子總方差分析結(jié)果

表4 成分得分系數(shù)矩陣

表5 不同基因型蠟梅品質(zhì)預(yù)測評(píng)價(jià)

F2=-0.030X1-0.007X2-0.235X3+0.438X4+0.3951X5+0.287X6

F3=-0.152X1-0.222X2+0.872X3+0.340X4+0.370X5-0.337X6

F綜=0.47374F1+0.34234F2+0.13898F3

上式中X1～X6是各個(gè)蠟梅花原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)值，以3個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重，將各品種主成分得分和相應(yīng)的權(quán)重進(jìn)行線性加權(quán)求和[25]，參考王建芳等[26]方法計(jì)算蠟梅的綜合評(píng)價(jià)得分，預(yù)測綜合得分較高的紅心品種為XL002和XL003，素心品種為HLT040。

對(duì)8個(gè)基因型蠟梅花萜烯類、酯類、醇類、烷烴類、酮類和其他共6類花香物質(zhì)組分做聚類分析(圖5)發(fā)現(xiàn)在Euclidean值為2.5時(shí)可分為4類，HLT017、HLT040和HLT012這3個(gè)素心品種聚為一類；XL003和XL002這2個(gè)得分較高的紅心品種聚為一類；HLT015和HLT016這2個(gè)萜烯類含量最多的紅心品種聚為一類；XL014暈心品種單獨(dú)為一簇，可較好地區(qū)分這8個(gè)品種。

3 討 論

花香不僅能影響和調(diào)節(jié)人們的心理，還被廣泛運(yùn)用于產(chǎn)品、園藝療法、森林康養(yǎng)[27-28]，蠟梅作為香花樹種被大眾喜愛。余莉[29]從9個(gè)蠟梅單株的揮發(fā)性成分中鑒定了70種化合物，其中以萜類物質(zhì)為主，芳樟醇、β-羅勒烯、乙酸芐酯和水楊酸甲酯等是蠟梅花香的主要成分，發(fā)現(xiàn)其含量與內(nèi)被片顏色無對(duì)應(yīng)關(guān)系。蔡寶國等[30]采用了頂空固相微萃取技術(shù)從鄢陵臘梅鮮花中鑒定出芳樟醇、乙酸芐酯、吲哚、苯甲醇、反乙位羅勒烯、壬醛、丁香酚和桂醇等60種揮發(fā)性物質(zhì)，并提出花香還可能與發(fā)香基團(tuán)和揮發(fā)性成分的碳鏈結(jié)構(gòu)有關(guān)。在本試驗(yàn)云南地區(qū)的供試材料中也含有乙酸芐酯、吲哚、苯甲醇、丁香酚、羅勒烯等共同揮發(fā)性物質(zhì)，萜烯類化合物為盛開期蠟梅花的主要物質(zhì)成分，這與周明芹[31]等研究結(jié)果一致。蠟梅花香物質(zhì)成分組成和花香類型與蠟梅花自身的自身的花型、花徑、花被片數(shù)無顯著規(guī)律，但各自具有的獨(dú)特香味可能與主要成分中羅勒烯類型有關(guān)，還有可能與萜烯類、酯類、醇類、烷烴類等種類含量、比例變化有關(guān)，這與馮楠[20]研究結(jié)果較為相似。目前，蠟梅已被加工成金茶、香楓茶、石梁茶和山蠟梅葉顆粒等[32]飲料和制劑，加上芳香物質(zhì)中芳樟醇具有抗炎、抗癌、抗高脂血癥、抗菌、抗傷害、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗抑郁等作用[33]，羅勒烯則能提高植物的抗蟲能力，在生活中常被用于日用化妝品以及香精香料的制備[34]，苯甲醇作為一種芳香族化合物，可在麻醉過程中減輕神經(jīng)和神經(jīng)節(jié)的疼痛[35]，丁香酚有抑菌、麻醉、解熱、抗氧化、抗腫瘤、促進(jìn)透皮吸收、祛蚊等功效[36]，因此可根據(jù)芳香物質(zhì)比例優(yōu)化，調(diào)制出各種各樣具有不同功能的配方，為香精類產(chǎn)品制備提供參考。

綜合評(píng)價(jià)8個(gè)基因型蠟梅得分排名從高到低依次是：XL002、HLT040、XL003、HLT017、HLT012、HLT016、HLT015、XL014，結(jié)合聚類分析結(jié)果可以看出同一生長地，排名相近且內(nèi)被片斑紋類型一致的聚為一類，因此推測香型可能與品種類型和種植地區(qū)有關(guān)，而造成它們品質(zhì)差異的相關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

采用頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS對(duì)云南地區(qū)8個(gè)基因型蠟梅花香進(jìn)行檢測，并結(jié)合主成分分析和聚類分析，發(fā)現(xiàn)萜烯類化合物是蠟梅花盛開期的主要物質(zhì)成分，且物質(zhì)種類豐富，這類物質(zhì)差異性較大的為基因型蠟梅是HLT015和HLT040；8個(gè)基因型蠟梅花可分為4類，第一類包括紅心條紋HLT015、HLT016；第二類包括紅心條紋XL002、XL003，第三類包括素心HLT012、HLT017、HLT040，第四類包括暈心條紋XL014，預(yù)測綜合品質(zhì)較好的紅心蠟梅為XL002、XL003，素心蠟梅為HLT040，分類結(jié)果與內(nèi)被片斑紋類型結(jié)果一致，這為進(jìn)一步對(duì)蠟梅品種選育和開發(fā)利用以及代謝組學(xué)研究提供了參考依據(jù)。