王曉國(guó)，李秀玲，董 艷，周主貴*

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，廣西 南寧 530007；3.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】兜蘭屬是蘭科植物中最具特色的一個(gè)類群，廣布于東南亞、南洋群島及太平洋西南大洋洲島嶼國(guó)家[1-3]。我國(guó)西南地區(qū)及華南部分地區(qū)是兜蘭主要分布區(qū)之一[4-5]，近年來(lái)其生境已遭受嚴(yán)重破壞，極大地影響帶葉兜蘭的種群恢復(fù)和擴(kuò)展[6]。土壤真菌可通過(guò)多種方式進(jìn)入蘭科植物根系，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)在一定程度上會(huì)影響蘭科植物根內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)。至今關(guān)于蘭科植物中根區(qū)土壤和根內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性仍不明確[7]。因此，分析帶葉兜蘭根內(nèi)和根區(qū)土壤真菌群落組成及其相關(guān)關(guān)系，對(duì)帶葉兜蘭的保育和種群恢復(fù)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】土壤中的部分真菌可與蘭科植物根形成菌根以維持互利共生關(guān)系，土壤中菌根真菌的豐度越大，與生長(zhǎng)在該地的蘭科植物形成共生關(guān)系的菌根真菌越多，就越有利于蘭科植物生長(zhǎng)[8]。McCormick等[9]發(fā)現(xiàn)，有地生蘭種子萌發(fā)的地方，其特異共生真菌豐度一般較高，且越靠近成熟蘭科植物則真菌的豐度就越高。根系中發(fā)現(xiàn)的部分菌根真菌在土壤中也有廣泛分布[10-11]，對(duì)土壤中菌根真菌進(jìn)行檢測(cè)，可判斷該地點(diǎn)是否適合相應(yīng)蘭科植物生長(zhǎng)[11]。但蘭科植物根內(nèi)的菌根真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤中的菌根真菌群落結(jié)構(gòu)顯著不同，菌根真菌在根內(nèi)的豐度最大，根內(nèi)的菌根真菌中只有少數(shù)在土壤中出現(xiàn)[12-13]，蘭科植物根內(nèi)的真菌群落與土壤的真菌群落在一定程度上相互獨(dú)立[14]，菌根真菌在土壤中的分布與蘭科植物無(wú)明顯關(guān)系[13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，針對(duì)廣西帶葉兜蘭分布區(qū)內(nèi)兜蘭根內(nèi)與根區(qū)土壤真菌群落組成的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)帶葉兜蘭根內(nèi)和根區(qū)土壤的真菌群落組成進(jìn)行初步分析，探究帶葉兜蘭根內(nèi)與根區(qū)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的差異，為深入研究蘭科植物菌根與土壤環(huán)境的關(guān)系及帶葉兜蘭的保育和種群恢復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品2018年12月采自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所蘭科植物資源圃中收集的野生兜蘭材料，共取5盆帶葉兜蘭根樣品和土壤樣品，根樣品標(biāo)記為P01、P02、P03、P04和P05，根區(qū)土壤樣品標(biāo)記為S01、S02、S03、S04和S05。每盆收集5條長(zhǎng)約5.0 cm的根段和盆內(nèi)5.0～15.0 cm土層的土壤，根段和土壤分別混合為一個(gè)處理。樣品收集后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室用液氮速凍并置于-80 ℃冰箱短期保存后用于提取總DNA。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 帶葉兜蘭根系和根區(qū)土壤總DNA提取 參照王曉國(guó)等[20]的方法進(jìn)行根系表面處理。根段表面消毒后，參照植物DNA提取試劑盒說(shuō)明提取根樣品的總DNA，參照土壤DNA提取試劑盒說(shuō)明提取根區(qū)土壤總DNA。所提取DNA的完整性以1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用Nanodrop紫外分光光度計(jì)(USA)對(duì)DNA進(jìn)行定量。

1.2.2 樣品真菌基因組ITS擴(kuò)增及測(cè)序 以50.0～100.0 ng DNA為模板，PCR擴(kuò)增跨越真菌18S rDNA高變區(qū)V3和V4區(qū)域的500堿基，采用包含5′-GGCAAGTCTGGTGCC-3′序列的上游引物和包含5′-ACGGTATCTRATCRTC-3′序列的下游引物擴(kuò)增部分V3區(qū)和全長(zhǎng)V4區(qū)；采用包含5′-CGWTAACGAACGAG-3′序列的上游引物和包含5′-AICCATTCAATCGG-3′序列的下游引物擴(kuò)增全長(zhǎng)V7和V8區(qū)；通過(guò)PCR向18S rDNA的PCR產(chǎn)物末端加上帶有Index的接頭，以便進(jìn)行NGS測(cè)序。擴(kuò)增體系25.0 μl：5.0 μl 5×reaction Buffer，5.0 μl 5×GC Buffer，2.0 μl dNTP(2.5 mmol/L)，1.0 μl上游引物(10.0 μmol/L)，1.0 μl下游引物(10.0 μmol/L)，2.0 μl DNA模板，8.75 μl ddH2O，0.25 μl Q5 DNA Polymerase。擴(kuò)增程序：98 ℃ 2.0 min；98 ℃ 15.0 s，55 ℃ 30.0 s，進(jìn)行25～27個(gè)循環(huán)；72 ℃ 30.0 s，72 ℃ 5.0 min，最后于10 ℃保溫。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)與純化，并采用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。將PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量(熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量?jī)x器為Microplate reader(FLx800、BioTek和Vermont，USA))。根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個(gè)樣品的測(cè)序量需求，對(duì)各樣品按相應(yīng)比例進(jìn)行混合。

DNA文庫(kù)混合后，按Illumina MiSeq(Illumina、San Diego和CA，USA)儀器使用說(shuō)明進(jìn)行2×300/250雙端測(cè)序(PE)，通過(guò)MiSeq工具中的MiSeq control software(MCS)進(jìn)行圖像分析和堿基識(shí)別，最后在Illumina basespace云端計(jì)算平臺(tái)進(jìn)行初始分類分析。

1.2.3 序列分析、OUT分類及系統(tǒng)發(fā)育分析 采用QIIME軟件通過(guò)USEARCH(v5.2.236)檢查并剔除嵌合體序列，得到主要分布在200～300 bp長(zhǎng)度的序列用于OTU分析。將豐度值低于全體樣品測(cè)序總量0.001 %的OTUs去除，使用VSEARCH1.9.6進(jìn)行序列聚類(序列相似性設(shè)為97 %)，比對(duì)的ITS rRNA參考數(shù)據(jù)庫(kù)為UNITE ITS database(https://unite.ut.ee/)。然后用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)OTUs的代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的真菌群落組成?；贠TU分析結(jié)果，采用對(duì)樣品序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法分別計(jì)算Shannon和Chao1等α多樣性指數(shù)，并繪制稀釋曲線。通過(guò)Unweighted unifrac分析比較樣品間的微生物群落是否存在顯著差異，基于Unweighted unifrac樣品間距離矩陣用于PCoA(principal co-ordinates analysis)可視化圖展示β多樣性。通過(guò)層次聚類(Hierarchical cluatering)中的非加權(quán)組平均法構(gòu)建UPGMA(Unweighted pair group method with arithmetic mean)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

表1 各樣品真菌的測(cè)序數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 帶葉兜蘭各樣品真菌的OUT水平分析

對(duì)帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品的真菌進(jìn)行測(cè)序，樣品最短平均長(zhǎng)度為362 bp，最長(zhǎng)平均長(zhǎng)度為413 bp，共測(cè)得原始序列751 282條(其中根樣品492 507條，根區(qū)土壤樣品258 775條)，過(guò)濾去掉低質(zhì)量序列并均一化后，獲得有效序列310 660條，在97 %相似度下將其聚類為用于物種分類的OTUs，統(tǒng)計(jì)得到所有樣品在不同OTUs中的豐度信息284個(gè)(表1)。其中根樣品P05的OTUs數(shù)最多，土壤樣品S05的OTUs數(shù)最少。

從圖1可看出，帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品的稀釋曲線基本趨于平緩，說(shuō)明這些樣品中基本覆蓋了絕大多數(shù)真菌，其真菌群落具有多樣性，所測(cè)得的序列基本可反映真實(shí)環(huán)境中的真菌群落結(jié)構(gòu)。但稀釋曲線未達(dá)到完全飽和，仍有部分真菌種類未被發(fā)現(xiàn)。

2.2 各帶葉兜蘭樣品中真菌群落的關(guān)聯(lián)性分析

從OUTs分布來(lái)看，所有根樣品的OTUs有216個(gè)，特有的OTUs有57個(gè)；所有根區(qū)土壤樣品的OUTs有229個(gè)，特有的OTUs有70個(gè)；根樣品和根區(qū)土壤樣品共有的OTUs有159個(gè)(圖2-A)；在所有樣品中，S04的OTUs數(shù)最多，有19個(gè)，其次是S01，有15個(gè)，P01、P04、S03和S05的OTUs數(shù)最少，均為1個(gè)；所有樣品共有的OUTs有3個(gè)，分別為OTU133、OUT56和OTU225(圖2-B)。說(shuō)明帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品的真菌群落組成在個(gè)體間存在一定差異。從屬的分布來(lái)看，根樣品共有96個(gè)屬，12個(gè)特有屬；根區(qū)土壤樣品共有96個(gè)屬，12個(gè)特有屬；根樣品和根區(qū)土壤樣品共有屬為84個(gè)(圖2-C)；在所有樣品中，P03和S04各有2個(gè)特有屬，而P01、P04、S02和S05沒(méi)有特有屬；所有樣品共有屬為5個(gè)，分別為籃狀菌屬(Talaromyces)、盤菌屬(Leotiomycetes)、鐮刀菌屬(Fusarium)、Boeremia和Heteromita(圖2-D)。綜上所述，帶葉兜蘭的根內(nèi)真菌群落組成與根區(qū)土壤有一定程度的相似性，但群落組成隨著植株個(gè)體不同存在差異。

2.3 各帶葉兜蘭樣品真菌群落的多樣性及結(jié)構(gòu)差異分析

不同樣品間的Shannon指數(shù)存在一定差異，但總體上趨于一致，說(shuō)明帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品的真菌群落分化程度較低(表2)；從群落豐度Chao 1指數(shù)來(lái)看，根區(qū)土壤樣品低于根樣品，說(shuō)明帶葉兜蘭根內(nèi)的真菌群落分化程度較高。

表2 各樣品真菌群落的Alpha多樣性分析結(jié)果

主成分(PCA)分析結(jié)果表明，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)對(duì)樣品真菌群落組成差異性的貢獻(xiàn)率分別為63.33 %和12.11 %，合計(jì)達(dá)75.44 %，是差異的主要來(lái)源(圖3)。根區(qū)土壤樣品較集中分布在一個(gè)區(qū)域，距離較近，表明根區(qū)土壤樣品間的真菌群落組成差異較?。欢鶚悠贩植驾^分散，距離較遠(yuǎn)。說(shuō)明帶葉兜蘭根區(qū)土壤樣品間的真菌群落組成差異較小，根樣品間雖有相似的真菌群落組成，但仍存在較大差異，可能與植株個(gè)體間存在差異有關(guān)。

2.4 各帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品間的真菌群落結(jié)構(gòu)組成

對(duì)各帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品的OTUs依次在門(Phylum)、綱(Class)、目(Order )、科 ( Family )和屬(Genus)水平上的信息進(jìn)行分析，結(jié)果(表3)表明，帶葉兜蘭真菌群落共涉及25門48綱81目96科107屬141種及大量未分類種。其中，根樣品中P05的真菌種類最多，有95種，P01的真菌種類最少，僅59種；根區(qū)土壤樣品中S01的真菌種類最多，有102種，S05的真菌種類最少，僅21種。

在科水平上對(duì)32科[包括叢赤殼科(Nectriaceae)、蟲草科(Cordycipitaceae)、小皰毛殼科(Herpotrichiellaceae)、小雙腔菌科(Didymellaceae)、枝孢霉科(Cladosporiaceae)、發(fā)菌科(Trichocomaceae)、扁孔腔菌科(Ophiostomataceae)、圓盤菌科(Orbiliaceae)、Trichomeriaceae、Mytilinidaceae及一些未知類群]進(jìn)行群落分析，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，根樣品中P03涉及的科最多，有16科，P04涉及的科最少，僅8科；根區(qū)土壤樣品中S01涉及的科最多，有27科，S05涉及的科最少，僅5科(圖4-A)。其中，根樣品中的叢赤殼科、蟲草科、norank_o_Liliopsida和unclassified_c_Embryophyta為優(yōu)勢(shì)菌群，約占根樣品中總科數(shù)的80 %，而根區(qū)土壤樣品中的叢赤殼科、蟲草科、norank_p_Mucoromycota和unclassified_c_Thecofilosea為優(yōu)勢(shì)菌群，約占土壤樣品中總科數(shù)的75 %(圖4-B)；叢赤殼科和蟲草科同為根樣品及根區(qū)土壤樣品的優(yōu)勢(shì)菌群，說(shuō)明根樣品和根區(qū)土壤樣品的部分優(yōu)勢(shì)菌群差異影響了真菌群落的組成。此外，在根樣品和根區(qū)土壤樣品中還存在大量未分類菌群，占比分別達(dá)5 %和10 %左右。

基于種分類水平，5個(gè)根樣品和5個(gè)根區(qū)土壤樣品可分為3大分支，根樣品與根區(qū)土壤品樣無(wú)單獨(dú)聚在一起的分支(圖5)。其中，根區(qū)土壤樣品中的S04單獨(dú)聚為1個(gè)分支，其物種種類和豐度與其他樣品間差異最明顯；根樣品中P03、P04和P05聚為1個(gè)分支，其物種種類和豐度較相似；根樣品中P01和P02在第三大分支上聚為1個(gè)小枝，其物種種類和豐度相似，根區(qū)土壤樣品中S01和S03在第三大分支上聚為1個(gè)小枝，其物種種類和豐度相似，根區(qū)土壤樣品中S02和S05在第三大分支上各聚為1個(gè)小枝，其物種種類和豐度與其他小枝存在一定差異。說(shuō)明根樣品和根區(qū)土壤樣品在種類和豐度方面存在一定差異，但總體上趨于一致。

在屬水平上，共有15屬真菌的相對(duì)豐度存在差異，其中鐮刀菌屬(Fusarium)和蟲草屬(Cordycipitaceae)在根樣品和根區(qū)土壤樣品中的相對(duì)豐度較接近，分布較均衡，肉環(huán)菌屬(Sarcosomataceae)、Embryophyta、Liliopsida、Mucoromycota和Alloteropsis5屬的真菌在根樣品和根區(qū)土壤樣品真菌的相對(duì)豐度存在顯著差異(圖6,P<0.05)。此外，Embryophyta和Liliopsida真菌僅在根樣品中檢測(cè)到，肉環(huán)菌屬、Mucoromycota和Alloteropsis真菌僅在根區(qū)土壤樣品中檢測(cè)到，屬于根樣品或根區(qū)土壤樣品中的特異真菌。說(shuō)明根樣品和根區(qū)土壤樣品中僅有少部分真菌種類和相對(duì)豐度存在差異，多數(shù)真菌的相對(duì)豐度總體上差異較小。

3 討 論

本研究對(duì)帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品的真菌群落進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在帶葉兜蘭根樣品中大部分真菌屬于非菌根真菌，菌根真菌僅占極少部分，可能與帶葉兜蘭是遷地保存材料，其生長(zhǎng)的環(huán)境、氣候發(fā)生改變和人為的管理造成在適應(yīng)環(huán)境過(guò)程中菌根真菌群落發(fā)生了較大變化有關(guān)。前人研究發(fā)現(xiàn)，蘭科菌根(OM)真菌群落結(jié)構(gòu)受多種因素影響，植被、海拔、土壤物理性質(zhì)如濕度、類型、有機(jī)質(zhì)成分和pH等均能影響OM真菌群落組成[15-19]；生境變化也會(huì)影響OM真菌群落結(jié)構(gòu)，以光和自養(yǎng)型地生蘭菌根為例，有些真菌種類存在于干燥環(huán)境而其他真菌僅在非本地種植園內(nèi)存在[20]。此外，鐮刀菌是一種蘭科植物根中常見(jiàn)的非菌根真菌，但能有效促進(jìn)蘭科植物種子萌發(fā)和生長(zhǎng)[15，21-22]；采用傳統(tǒng)方法分離獲得的帶葉兜蘭菌根真菌中，鐮刀菌為優(yōu)勢(shì)菌群，可能是由于生境改變，使得帶葉兜蘭從非菌根真菌中獲取養(yǎng)分的機(jī)率增大，從而減少對(duì)菌根真菌的依賴。

表3 帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品的真菌群落分類學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

本研究從帶葉兜蘭根樣品中測(cè)得600條OTUs，從根區(qū)土壤樣品中測(cè)得587條OTUs，說(shuō)明蘭科植物根的真菌種類和數(shù)量與根區(qū)土壤接近，即根內(nèi)與根區(qū)土壤的真菌組成趨于一致，PCA和UPGMA聚類分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)帶葉兜蘭根樣品的真菌群落與根區(qū)土壤樣品的真菌群落在組成和結(jié)構(gòu)上雖然存在一定差異但差異程度較小，其中Nectriaceae和Cordycipitaceae同為根樣品和根區(qū)土壤樣品的優(yōu)勢(shì)菌群，而根樣品與根區(qū)土壤樣品的優(yōu)勢(shì)真菌組成具有較高相似度，表明蘭科植物根內(nèi)與根區(qū)土壤的真菌群落在組成方面存在明顯的相關(guān)關(guān)系。但也有研究認(rèn)為蘭科植物的真菌群落與土壤的真菌群落在一定程度上相互獨(dú)立[11，16]。這可能與樣品的土壤環(huán)境關(guān)聯(lián)性較大。本研究所用帶葉兜蘭材料為遷地保護(hù)材料，生長(zhǎng)環(huán)境和土壤條件與其原生生境差異較大導(dǎo)致蘭科植物根內(nèi)真菌群落與根區(qū)土壤真菌群落的關(guān)聯(lián)性與前人研究結(jié)果不同。然而，目前對(duì)蘭科植物菌根真菌在土壤中的動(dòng)態(tài)分布僅局限于了解到根中發(fā)現(xiàn)的大部分菌根真菌在土壤中廣泛分布[9-14]。

土壤中潛在的蘭科菌根真菌也存在蘭科植物根中，但二者菌根真菌的相對(duì)豐度不同[23]；與蘭科植物相關(guān)的某些菌根真菌群落在土壤中未被發(fā)現(xiàn)[7，24]。本研究通過(guò)分子手段，對(duì)帶葉兜蘭根樣品和根區(qū)土壤樣品真菌群落進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)根區(qū)土壤中潛在的非蘭科菌根真菌鐮刀菌為優(yōu)勢(shì)菌群，而鑒于目前關(guān)于帶葉兜蘭根區(qū)土壤潛在非蘭科菌根真菌的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究認(rèn)為帶葉兜蘭根區(qū)土壤真菌群落組成可在一定程度上反映其根內(nèi)的真菌群落組成。

4 結(jié) 論

帶葉兜蘭根內(nèi)與根區(qū)土壤的真菌群落具有相似結(jié)構(gòu)，種類間和豐度間差異不明顯，但根內(nèi)與根區(qū)土壤共有多數(shù)種類的優(yōu)勢(shì)菌群。