胡 楊，劉昌燕，廖芳麗，李 莉，陳宏偉，劉良軍，韓雪松，萬正煌*，盧碧林，沙愛華*

(1.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院/主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心/濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025；2. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064； 3. 荊州市種子管理局，湖北 荊州 434020)

【研究意義】蠶豆(ViciafabaL.)屬蝶形花科野生豌豆屬，營(yíng)養(yǎng)豐富并具固氮特性，能增加土壤氮素，緩解地力養(yǎng)分的消耗[1]。隨著環(huán)境條件的不斷變化，干旱等非生物脅迫逐漸成為影響農(nóng)作物生長(zhǎng)的限制因子，干旱造成的經(jīng)濟(jì)損失在眾多非生物脅迫中居首位[2]。種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)的起始階段，土壤水分影響種子萌發(fā)，決定植物是否能夠獲得足夠苗數(shù)，以保證獲得足夠的生物產(chǎn)量。蠶豆種子萌發(fā)需水較多，播種后如果干旱少雨，將導(dǎo)致種子萌發(fā)力下降，出苗少，蠶豆產(chǎn)量最終會(huì)受到影響[3]。自噬(Autophagy，ATG)是真核細(xì)胞面臨營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，在溶腔、液泡或溶酶體中降解大量細(xì)胞成分的系統(tǒng)[4]。在植物中，自噬作用響應(yīng)各種環(huán)境脅迫，如養(yǎng)分缺乏、干旱、鹽堿和高溫，表明其具備用于提高作物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的潛力[5]。因此，從蠶豆中鑒定自噬基因，分析其在種子萌發(fā)過程中對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，將有利于鑒定出特定的自噬基因，用于改良蠶豆種子萌發(fā)耐旱能力，為培育高產(chǎn)耐旱蠶豆品種奠定基礎(chǔ)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】根據(jù)蠶豆轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，鑒定蠶豆中ATG基因，并進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ATG基因廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中。許多ATG基因在動(dòng)植物中功能保守[6]。目前，在酵母中已經(jīng)鑒定出32個(gè)ATG基因[7]，在擬南芥、水稻、馬鈴薯、辣椒、玉米中分別鑒定出了32、40、33、29、42個(gè)ATG基因[8-12]。其中一部分ATG蛋白的功能已得到驗(yàn)證。如過表達(dá)OsATG8c顯著增加自噬活性，株高降低，有效分蘗和產(chǎn)量增加[13]；番茄ATG18的激活提高番茄植株耐旱性，在干旱脅迫下降解泛素化蛋白質(zhì)聚集體促進(jìn)植株存活[14]；過表達(dá)辣椒CaATG6提升了辣椒的耐熱性[15]。自噬在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中表達(dá)水平低，但在干旱等非生物脅迫下通過上調(diào)自噬水平幫助植物存活[16]。ATG基因過量表達(dá)增強(qiáng)自噬，能夠提高植物產(chǎn)量和氮素轉(zhuǎn)運(yùn)效率[17-18]。但缺乏自噬會(huì)導(dǎo)致葉片過早衰老，并降低植物種子產(chǎn)量和質(zhì)量[19]。在甘露醇誘導(dǎo)的滲透脅迫下，擬南芥ATG8家族中9個(gè)基因都有不同程度的上調(diào)表達(dá)，且滲透脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)高于鹽脅迫[20]。此外，滲透脅迫也誘導(dǎo)AtATG18a上調(diào)表達(dá)激活自噬[21]。在蘋果中，自噬相關(guān)基因MdATG18a激活自噬基因ATG31提高了對(duì)病毒和干旱脅迫的抗性[22]?！緮M解決關(guān)鍵問題】利用生物信息學(xué)方法鑒定蠶豆ATG基因家族，并分析其基因結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育、對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，為進(jìn)一步研究蠶豆ATG基因生物學(xué)功能，應(yīng)用ATG基因提高蠶豆品種耐旱性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蠶豆(ViciafabaL.)品種為埃塞俄比亞品種CDAS105和湖北品種鄂蠶1號(hào)，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院雜糧研究工程中心提供。主要試劑：RNA提取試劑盒(廣東健侖生物科技有限公司)、甘露醇(天津市科密歐化學(xué)試劑科技有限公司)。

1.2 樣品采集、RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

試驗(yàn)在長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院耐漬油料種質(zhì)資源湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。于2019年7月選取形態(tài)大小均等的耐旱品種CDAS105和干旱敏感品種鄂蠶1號(hào)種子，分別放入濃度為0.8 %的甘露醇和滅菌蒸餾水的培養(yǎng)皿中，置于28 ℃恒溫箱中萌發(fā)，萌發(fā)后16和64 h切取含胚芽的1/4部分子葉，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于提取RNA。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由武漢古奧科技有限公司完成。

1.3 基因注釋及ATG基因篩選

以蠶豆轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，根據(jù)Swiss-prot數(shù)據(jù)庫中注釋為ATG基因，用TBtools軟件[23]提取相應(yīng)的蛋白序列后，在NCBI進(jìn)行Blast，同時(shí)利用SMART在線軟件(https:/smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)序列的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，去除非ATG編碼序列、重復(fù)序列及冗余轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)[24]描述方法，對(duì)篩選出的蠶豆ATG基因進(jìn)行分類和命名。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載酵母ATG蛋白序列后，并與在EnsemblPlants(http://plants.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫中下載獲得玉米、水稻、擬南芥ATG蛋白序列利用MEGA-X軟件的ClustalW程序?qū)πQ豆及擬南芥、玉米、水稻、酵母ATG蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，采用NJ法(Neighbor Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過Bootstrapmethod (BM)模型算法進(jìn)行估計(jì)，并進(jìn)行Bootstrap分析，重復(fù)值設(shè)置為1000。利用在線程序iTOL(https://itol.embl.de/)美化系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 生物信息學(xué)分析

蠶豆ATG基因結(jié)構(gòu)通過TBtools軟件進(jìn)行可視化分析。亞細(xì)胞定位利用在線軟件ProtComp9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml) 預(yù)測(cè)。蛋白理化性質(zhì)通過在線軟件ExPASy-ProtParam tool分析；保守基序(motif)類型和排列順序軟件為MEME(http://meme-suite.org/)。蛋白結(jié)構(gòu)域通過SMART軟件分析。

1.6 ATG響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)分析

蠶豆干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫中基因片段表達(dá)量采用FPKM (fragments per kilobase million) 計(jì)算。將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，利用TBtools軟件構(gòu)建ATG在2個(gè)品種中不同處理時(shí)間的表達(dá)熱圖。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel2010進(jìn)行整理及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶豆ATG基因家族的鑒定及分類

基于干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，根據(jù)Swiss-prot蛋白數(shù)據(jù)庫中的注釋，初步篩選到117個(gè)ATG相關(guān)基因。進(jìn)一步通過NCBI BlastP比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，最終得到12個(gè)ATG基因。通過與酵母ATG進(jìn)行比對(duì)，將它們分為5個(gè)基因亞族，分別為ATG3基因(VfAG3)，ATG6基因(VfATG6)，ATG8基因(VfATG8a、VfATG8b、VfATG8c、VfATG8d、VfATG8e、VfATG8f)；ATG18基因(VfATG18a、VfATG18b、VfATG18c)和ATG26(VfATG26)基因(圖1)。

2.2 Vf ATG蛋白的進(jìn)化分析

將蠶豆中鑒定的12個(gè)ATG與酵母、擬南芥、玉米、水稻中的ATG蛋白進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)蠶豆的ATG分別與其他物種中對(duì)應(yīng)的亞家族蛋白聚在同一分枝上，如VfATG3與擬南芥AtATG3、酵母ScATG3、玉米ZmATG3、水稻OsATG3位于同一個(gè)分枝上；VfATG8與ScATG8、AtATG8、ZmATG8、OsATG8 (abcdef)位于同一亞枝上；VfATG18、ScATG18、AtATG18、ZmATG18、OsATG18(abc)位于同一亞枝上(圖2)。表明蠶豆中新鑒定這些蛋白與其他物種中同一亞家族蛋白結(jié)構(gòu)和功能域相似。

2.3 蠶豆ATG蛋白的理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

蠶豆中鑒定的12個(gè)ATG蛋白的長(zhǎng)度為118～623 aa，預(yù)測(cè)的蛋白分子量(Mr)大小為13 625.6～68 506.87(表1)。等電點(diǎn)(PI)4.8～9.06，其中VfATG8a、VfATG8b、VfATG8d、VfATG8e、VfATG8f、VfATG18c為堿性蛋白(PI為7.99～9.03)，其他6個(gè)為中性蛋白(PI為4.8～7.0)。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)除VfATG8f和VfATG18b小于40外，其他蛋白均大于40，表明鑒定的大部分蠶豆ATG屬于不穩(wěn)定蛋白。12個(gè)蠶豆ATG平均親水系數(shù)均為負(fù)值，表明其都是親水蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)除VfATG3位于細(xì)胞質(zhì)，其余均位于細(xì)胞核外表明鑒定的蠶豆ATG蛋白可能主要參與細(xì)胞核外一些特定的生物學(xué)過程。

表1 VfATG理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

2.4 蠶豆ATG基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)域和保守基序分析

VfATG基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，VfATG基因家族成員無內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，每個(gè)成員都含有UTR區(qū)與CDS區(qū)，同一亞族成員基因編碼區(qū)長(zhǎng)度大致相同(圖3-A)。蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示，ATG3含有Autophagy_N、Autophagy_act_C和Autophagy_C 3個(gè)結(jié)構(gòu)域，ATG6含有APG6、APG6_N 2個(gè)結(jié)構(gòu)域其他蛋白都只含有1個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖3-B)。不同亞家族擁有不同的結(jié)構(gòu)域，但同一亞家族的結(jié)構(gòu)域基本保守，如ATG18、ATG8(圖3-B)。進(jìn)一步分析ATG蛋白中的保守基序發(fā)現(xiàn)，VfATG蛋白中共鑒定出20個(gè)motif(mortif 1-mortif 20))，其長(zhǎng)度為6～50個(gè)氨基酸(圖3-C，表2)。在預(yù)測(cè)的20個(gè)motif中，motif 1第33～40位氨基酸具有保守性(3-D)，motif 2第33～39位氨基酸也相對(duì)保守，motif 8中除了第5位氨基酸以外，其他位點(diǎn)氨基酸相對(duì)保守。ATG6擁有最多基序(motif 6，9，12，15，16，17，18，19)，其次是ATG26(mortif 10，12，14，16，18，20)和ATG18(mortif 3，4，5，8，9，13，15)(圖3-C)。不同亞家族含有的mortif各不相同，但同一亞家族蛋白之間具有相似的mortif，如ATG8 和ATG18(圖3-C)。

2.5 VfATG響應(yīng)干旱脅迫表達(dá)分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，分別提取鑒定的12個(gè)ATG的表達(dá)繪制熱圖(圖4)。在干旱處理16 h后，ATG18b和ATG18c在抗旱品種CDAS105(T2)中較敏感品種鄂蠶1號(hào)(T1)表達(dá)上調(diào)，而ATG8c表達(dá)下調(diào)。在干旱處理64 h后，ATG8a在抗旱品種中較敏感品種表達(dá)上調(diào)。而在對(duì)照處理中，ATG8b和ATG8c分別在處理16 h的抗旱品種中上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)，ATG8a則在處理后64 h抗旱品種中上調(diào)表達(dá)。表明干旱處理16 h后，ATG18b和ATG18c迅速上調(diào)表達(dá)可能與CDAS105的抗旱性相關(guān)；而ATG8b在對(duì)照處理中上調(diào)表達(dá)，以及ATG8c在干旱和對(duì)照處理中均下調(diào)表達(dá)，可能是由于品種的生理特性差異決定的，與品種抗旱性差異關(guān)系不大。ATG8a在抗旱品種中干旱和對(duì)照處理64 h后均上調(diào)表達(dá)，表明其可能在抗旱品種中本底表達(dá)較高，從而導(dǎo)致抗旱品種的抗旱性更強(qiáng)。同時(shí)通過比較ATG基因在同一品種干旱處理不同時(shí)間表達(dá)發(fā)現(xiàn)，ATG8a在T2中干旱處理64 h較16 h表達(dá)上調(diào)，而ATG8e在干旱處理64 h后，在T2和T1中均較處理16 h表達(dá)上調(diào)。表明隨著干旱處理時(shí)間的增加，ATG8a在T2中表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，從而更有利于增強(qiáng)其抗旱性。而ATG8e在抗旱品種和敏感品種中均隨著干旱處理時(shí)間的增加表達(dá)增強(qiáng)，表明其可能參與干旱脅迫的基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)，與品種的抗旱性差異關(guān)系不大。

表2 VfATG蛋白結(jié)構(gòu)域在肽鏈中的位置

3 討 論

自噬基因響應(yīng)養(yǎng)分缺乏、干旱、鹽堿和高溫等各種環(huán)境脅迫，可用于改良作物的抗逆性。盡管在擬南芥、水稻、玉米等植物中鑒定了一些ATG基因，但在蠶豆中還未見報(bào)道。

本文根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，結(jié)合生物信息學(xué)分析，首次從蠶豆中鑒定了12個(gè)ATG基因。通過分析這些基因?qū)Ω珊得{迫的響應(yīng)，鑒定出ATG8a、ATG18b和ATG18c在蠶豆抗旱品種和敏感品種中存在表達(dá)差異，表明這些基因可能參與蠶豆種子萌發(fā)過程中的干旱脅迫調(diào)控。前人研究也發(fā)現(xiàn)，ATG8、ATG18家族成員在擬南芥[17-19，22，24，26]、番茄[12]、蘋果[19]、水稻[27]中參與滲透或干旱脅迫調(diào)控。表明ATG8和ATG18基因家族成員在不同物種中具備調(diào)控干旱脅迫的功能保守性。因此，本文從蠶豆中鑒定的ATG8a、ATG18b和ATG18c可以作為潛在的基因資源，用于改良蠶豆種子萌發(fā)的耐旱能力，進(jìn)一步應(yīng)用于培育高產(chǎn)耐旱蠶豆品種。

此外，本文鑒定的12個(gè)蠶豆ATG基因分布于ATG3、ATG6、ATG8、ATG18和ATG26這5個(gè)亞基因家族，聚類分析中分別與水稻、玉米中的相應(yīng)亞家族成員位于同一分枝。一般情況下，同一分枝上的亞家族蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)和功能域，因此功能也趨于保守。蘋果中MdATG3a和MdATG3b響應(yīng)葉片衰老、氮饑餓、干旱、鹽和氧化脅迫，在擬南芥中過量表達(dá)MdATG3a和MdATG3b均增強(qiáng)滲透和鹽脅迫耐性，并改善植物生長(zhǎng)[24]。擬南芥中ATG6為花粉萌發(fā)和生長(zhǎng)發(fā)育所必需[29]，水稻中ATG6響應(yīng)熱、冷和干旱脅迫[28]，過表達(dá)辣椒CaATG6提升了辣椒的耐熱性[30]。擬南芥中過量表達(dá)ATG8提高N素重新移動(dòng)效率和促進(jìn)籽粒充實(shí)[31]。擬南芥中過量表達(dá)甜橙CsATG18a和CsATG18b，提高了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)滲透脅迫、鹽、干旱和凍害的耐受性[32]。因此，蠶豆中鑒定的12個(gè)ATG除了ATG8a、ATG18b和ATG18c參與抗旱脅迫響應(yīng)外，包括這3個(gè)基因在內(nèi)的其他ATG可能還參與調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育或其他環(huán)境脅迫反應(yīng)，其生物學(xué)功能還有待于進(jìn)一步鑒定，以期能充分利用這些基因改良蠶豆的相關(guān)性狀，提高蠶豆生產(chǎn)的效益。

4 結(jié) 論

基于蠶豆干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，鑒定了12個(gè)蠶豆ATG基因，明確了其進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、理化性質(zhì)等，并篩選出VfATG8a、VfATG18b和VfATG18c響應(yīng)蠶豆干旱脅迫，能夠用于改良蠶豆種子萌發(fā)的耐旱性。