李葵秀，羅崇玉，傅琪景，李立池，李有春，羅 浩， 姚寶林，劉長寧，張紅驥，于德才*，杜云龍

(1.云南農業(yè)大學植物保護學院，云南 昆明 650201；2.云南省農業(yè)科學院國際農業(yè)研究所，云南 昆明 650205；3.中國科學院西雙版納熱帶植物園熱帶植物資源可持續(xù)利用重點實驗室，云南 景洪 666303；4.云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201；5.農業(yè)生物多樣性應用技術國家工程研究中心，云南 昆明 650201)

【研究意義】植物的根是植物從土壤中吸收水分和養(yǎng)分、固著、繁殖、貯存、合成有機物質的重要營養(yǎng)器官[1]。IGT基因家族與植物的分蘗分支角度密切相關，DRO1屬于其中的一員，其它還包括LAZY1、TILLERANGLECONTROL1(TAC1)等基因[2]?！厩叭搜芯窟M展】LAZY1基因在水稻[3]、擬南芥[4]、玉米[5]、沙柳[6]中都有報道。在水稻中，因為LAZY1基因的突變導致生長素極性運輸增強，從而改變了內源IAA在地上部分中的分布，進而引起對重力的不敏感性，導致分蘗期與成熟期分蘗角度增大[7]；擬南芥中有6個LAZY基因，分別為AtLAZY1-AtLAZY6，并定位于擬南芥的不同組織器官中，發(fā)揮的功能也不盡相同，其中atlazy2,3,4三突變體影響側根的正常生長發(fā)育[8-9]。Dong等研究發(fā)現(xiàn)，玉米lazy1突變體增加了生長素的極性運輸[5]。在擬南芥中TAC1與LAZY1基因突變體植株的表型相反[11]。Dardick等發(fā)現(xiàn)，雙子葉植物擬南芥attac1突變體的側腋生長角度比野生型更小[12]。在桃樹中發(fā)現(xiàn)PpeTAC1過表達株系樹枝的分支角度較大，PpeTAC1-RNAi株系樹枝分支角度較小，樹形結構呈現(xiàn)緊密型[13]。DRO1基因最初發(fā)現(xiàn)是一個控制根生長角度的數量性狀位點，在根分生組織周圍表達[14]。在Kinandang Patong水稻中，DRO1基因首次被克隆，發(fā)現(xiàn)該基因受生長素的負調控[15]，通過改變水稻根系生長角度而影響根系的形態(tài)建成，并調控水稻的產量[16]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，AtDRO1主要在根維管系統(tǒng)和根尖中以不同的發(fā)育模式表達[2]。與水稻中的DRO1基因相比，具有76 %相似性的小麥的DRO1基因也表現(xiàn)出相似的功能，它可改變根系統(tǒng)的建成以響應干旱脅迫[17]。qSOR1是DRO1同源基因，調控水稻根生長角度(RGA)，使水稻具有較淺根生長角進而可以提高鹽堿地水稻產量，還發(fā)現(xiàn)qSOR1也受到生長素的負調控[18]。梁文君等已開展了馬鈴薯中StDRO1對脅迫響應的研究[19]，但其同源基因和功能尚不清楚?！颈狙芯壳腥朦c】隨著中國馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的不斷深入，馬鈴薯已逐漸成為中國的又一主要糧食作物，在全球各地均有廣泛栽培[20-22]。馬鈴薯是一種主要收獲塊莖的農作物，但其根系較淺，根系結構狹窄，具有較弱的土壤穿透能力，因此對干旱脅迫較為敏感[23-25]。和谷物相比較，對于馬鈴薯根系生長發(fā)育的研究較少。然而改良根系構型，也是提高作物抗旱能力的一種途徑[26]。馬鈴薯DRO2基因同屬于IGT基因家族，其成員DRO1、LAZY1及TAC1都參與了水稻、擬南芥及玉米的植物形態(tài)發(fā)育，尤其是對構型的影響，而馬鈴薯DRO2的研究還未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究對馬鈴薯中的StDRO2基因進行生物信息學分析，為進一步開展該基因在馬鈴薯根系發(fā)育及抗旱中的功能研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗供試馬鈴薯品種為麗薯6號。在MS培養(yǎng)基(MS 4.74 g·L-1，蔗糖 30 g·L-1，瓊脂 7.2 g·L-1，pH 5.8)上生長20 d的苗，按2 cm左右剪下莖段(至少帶1個腋芽)，正向插入擴繁培養(yǎng)基上，在組培室(2000 lx、12 h光照/12 h黑暗、24 ℃條件下)培養(yǎng)，3 ～ 4 d即可生根長芽，于第4天將長勢一致的幼苗轉至含有0.01 μmol·L-1NAA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對照組為含有等量二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)的MS培養(yǎng)基，5 d后，觀察根系發(fā)育情況。

1.2 StDRO2基因篩選及生物信息學分析

基于蛋白質序列的相似性，通過已公布的水稻DRO1、擬南芥AtDRO1、AtDRO2、AtDRO3以及小麥、番茄，馬鈴薯中DRO1的氨基酸序列作為參照進行了BLASTp，得到馬鈴薯StDRO1的同源基因，涉及的馬鈴薯、番茄基因組數據下載自茄科物種基因組測序數據庫(https://solgenomics.net/)。水稻、擬南芥、小麥相關基因組數據下載自NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

利用Expasy(http://www.expasy.ch/tools)在線生物信息學工具對其進行理化性質分析。采用CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)進行亞細胞定位預測分析。通過DNAMAN軟件進行同源比對。利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)進行motif預測。運用Mega5.1軟件的ClusX功能進行同源序列比對，采用最大似然法構建進化樹。分別通過ChloroP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)、TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMH MM/,http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)進行葉綠體轉運肽、跨膜區(qū)、信號肽預測。通過SOMPA(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sop ma.html) 在線軟件進行蛋白質二級結構預測。

1.3 馬鈴薯RNA提取及逆轉錄反應

對9 d馬鈴薯幼苗的根、莖、葉材料提取RNA，方法依據植物RNA提取試劑盒(北京全式金生物技術有限公司生產)。對提取的馬鈴薯總RNA進行逆轉錄合成cDNA，反應液的配制：5 μl Total RNA，4 μl 5×TransScript?All-in-One SuperMix for qPCR(北京全式金生物技術有限公司生產)，1 μl gDNA Remover，10 μl RNase-free Water。反應液配制完成后，置于42 ℃金屬浴上孵育15 min；85 ℃保溫15 s，合成的cDNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.4 StDRO2實時熒光定量分析

利用實時熒光定量PCR技術，分析馬鈴薯中StDRO2基因的表達量，具體反應體系如下：以0.5 μl的cDNA為模板，加入5 μl的PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(Thermo Fisger Scientific公司生產)，0.4 μl的正向引物(StDRO2-FP:5′-GAAGACATTGTTC TGCAG CG-3′)和0.4 μl的反向引物(StDRO2-RP:5′-CCTTGGACTGCTTGCTTGAG-3′)，并加入3.7 μl的ddH2O配置成10 μl的反應體系。反應程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性45 s；56 ℃退火30 s；40個循環(huán)；72 ℃延伸1 min。以馬鈴薯actin基因為內參基因(Stactin-FP: 5′- GGTATTGTGCTGGATTCTGG-3′，Stactin-RP: 5′-CGTTCAGCACTAGTGGTGAA-3′)。進行3次生物學重復，以2-△△Ct算法計算差異。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯中StDRO2基因的序列比對及其蛋白質理化性質分析

為了研究馬鈴薯中StDRO2基因，基于氨基酸序列的相似性，通過已公布的水稻DRO1、擬南芥AtDRO1、AtDRO2、AtDRO3、小麥的3個DRO1基因編碼的氨基酸序列作為參照進行了BLAST，結果均能比對到同一個馬鈴薯的候選基因(PGSC0003DMG400016036)，該序列與馬鈴薯StDRO1的氨基酸序列相似性27.4 % (表1)。通過序列分析，該基因可能為馬鈴薯的StDRO1的同源基因，將其命名為StDRO2(GeneBank no.MW350102)。

利用在線軟件ProtParam(http://www.expasy.ch/tools)初步分析了馬鈴薯StDRO2蛋白質的理化性質。結果所示，包括馬鈴薯StDRO2蛋白在內的13個DRO1蛋白及其同源物的大小有所差異，相對分子量為19 682.45～33 714.95，理論等電點值為4.97～9.10(表2)。不同物種中的DRO1蛋白及其同源物均屬于親水性蛋白，但穩(wěn)定性有所不同。

2.2 馬鈴薯StDRO2的亞細胞定位分析

利用CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)在線軟件對馬鈴薯StDRO2蛋白序列進行分析，預測馬鈴薯StDRO2蛋白的亞細胞定位。結果顯示馬鈴薯StDRO2蛋白與其它DRO1蛋白質一樣都定位于細胞核(表3)。

2.3 馬鈴薯StDRO2蛋白質同源比對及保守結構域分析

通過DNAMAN軟件對DRO1蛋白質序列進行比對，提取其保守結構域進行分析，結果顯示馬鈴薯的StDRO2蛋白也具有一個非常保守的IGT結構域，并包含幾個相對保守的短蛋白基序。

2.4 馬鈴薯StDRO2蛋白質motif分析

通過MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)在線工具對水稻、擬南芥、小麥、番茄、馬鈴薯中DRO1蛋白及StDRO2的motif進行分析。分析選用5個motifs，所有的蛋白都含有以IGT氨基酸序列為特征的motif 2基序，結果顯示馬鈴薯StDRO2蛋白為IGT家族成員。

表1 DRO1同源基因的分析結果

表2 馬鈴薯StDRO2蛋白質的理化性質

2.5 馬鈴薯StDRO2蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

依據水稻和擬南芥DRO1的氨基酸序列，通過NCBI數據庫比對獲得來自禾本科，茄科和十字花科的玉米、高粱、小米、二穗短柄草、煙草、亞麻薺和蘿卜的DRO1同源序列。利用MEGA5.1軟件對這些物種的蛋白序列進行多序列比對，采用最大似然法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示馬鈴薯和二穗短柄草在同一進化枝上，和小米、玉米、高粱的親緣關系較近(圖3)。

2.6 馬鈴薯StDRO2蛋白葉綠體轉運肽、跨膜結構域、信號肽的分析

通過ChloroP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)、TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)分析，僅有小麥中3個DRO1蛋白有葉綠體轉運肽的切割位點，包括馬鈴薯StDRO2在內的13 個蛋白序列均無信號肽及跨膜結構域。

表3 馬鈴薯StDRO2蛋白亞細胞定位預測

2.7 馬鈴薯StDRO2蛋白二級結構的預測

馬鈴薯StDRO2及其它物種的DRO1蛋白質的二級結構均含有無規(guī)則卷曲、α-螺旋、β-轉角和延伸鏈結構，其中，無規(guī)則卷曲數量占比最高，α-螺旋占比次之，β-折疊占比最低 (表5)，二級結構在所有物種中具有相似的位置(圖4)。

2.8 馬鈴薯StDRO2基因表達譜

為了分析馬鈴薯中StDRO2基因的表達情況，通過實時熒光定量PCR，檢測到幼苗期馬鈴薯葉片中StDRO2的表達量極顯著高于根中的表達量，莖桿中的StDRO2基因表達量最低，且顯著低于根中StDRO2表達量(圖5)。

表4 馬鈴薯StDRO2蛋白葉綠體轉運肽、跨膜結構域、信號肽的分析

為了探究生長素對馬鈴薯StDRO2基因的調控作用，用0.01 μmol·L-1的NAA處理馬鈴薯材料。與對照相比，可以明顯看出低濃度NAA處理后，馬鈴薯幼苗的根毛明顯減少。進一步分析發(fā)現(xiàn)，經NAA處理后的馬鈴薯根中StDRO2基因的表達量顯著低于對照(圖6)，說明生長素負調控馬鈴薯StDRO2基因的表達水平。

表5 馬鈴薯StDRO2蛋白質二級結構預測結果

續(xù)表5 Continued table 5

3 討 論

在農業(yè)生產中，植株具有更深的根系則有利于獲得下層土壤中的水份及營養(yǎng)成分。根系構型決定了根區(qū)的大小，對植物從土壤中獲得水分和養(yǎng)分的面積影響最大。通過蛋白質序列的相似性和結構域的分析，馬鈴薯StDRO2和其它作物中DRO1蛋白均具有IGT基因家族的保守結構域，IGT基因家族有著較低的序列保守性[27-28]。對DRO1基因及StDRO2序列保守性的分析顯示出相對較低的保守性，這些相對保守的結構域可能是StDRO2蛋白完成生理功能的結構基礎。

擬南芥AtDRO1通過自身啟動子驅動表達時，該蛋白定位于根尖，并可以在細胞核中檢測到[29]。有研究表明，DRO1在水稻原生質體中瞬時表達時，其定位在質膜(PM)上[15]。與此結果一致的是，DRO1的C末端保守的14 個氨基酸結構域(CCL)缺失時，DRO1仍定位到質膜上[29]。Dong等對玉米LAZY1蛋白(ZmLA1)進行研究，通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補法(BiFC)，發(fā)現(xiàn)ZmLA1與細胞核內的IAA17和質膜上的PKC相互作用[10]。當預測的跨膜結構域(包含保守的IGT基序)被刪除時，ZmLA1就不能與PKC相互作用[10]，蛋白質之間的相互作用顯示了DRO1或LAZY1在細胞核和質膜上定位的分子機制。在該項研究中，馬鈴薯StDRO2與不同作物中的13個DRO1蛋白質經預測都可定位于細胞核(表3)，說明馬鈴薯的StDRO2可能作為核蛋白調控基因功能。蛋白質結構是蛋白質功能的基礎，馬鈴薯StDRO2蛋白質二級結構預測均含有α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析，馬鈴薯StDRO2蛋白質和二穗短柄草DRO1(BRADI_4g31290)[2,30]在同一進化枝上，和小米DRO1(SETIT_030919mg)、玉米DRO1(GRMZM2G700200)[2,30]、高粱DRO1(SORBI_3002G215300)[2,26]的親緣關系較近，這暗示馬鈴薯的StDRO2與這些作物的DRO1基因具有相同的功能。

生長素是根系發(fā)育的重要調控因子，通過合成、運輸、信號通路等影響著植物對外界環(huán)境的響應機制，從而使得植物正常生長發(fā)育[31-32]。已有研究結果發(fā)現(xiàn)水稻的DRO1處于生長素信號傳導途徑的下游，其轉錄水平受到生長素的負調控[15]。在該項研究中，NAA處理馬鈴薯幼苗后，根中StDRO2的表達水平下調。馬鈴薯StDRO2的表達受生長素的調控，StDRO2是否參與調控根系構型還需要進一步深入的研究。同時，該項研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯StDRO2基因的表達水平在根中相比葉中并不顯著(圖6)，StDRO2在根中的低表達量與馬鈴薯抗旱能力是否存在相關性還需深入分析。本項研究工作為深入分析馬鈴薯StDRO2基因功能及開展深根抗旱馬鈴薯分子育種提供理論依據。

4 結 論

馬鈴薯StDRO2基因屬于IGT基因家族中的一員，編碼親水性不穩(wěn)定蛋白，定位在細胞核，StDRO2蛋白質均具有無規(guī)則卷曲、α-螺旋、β-旋轉角和延伸鏈二級結構，具有與已知作物的DRO1同源基因相似的分子特性，其表達水平受到生長素的負調控。