朱佶軒，戴 琴，段健誠，高 娜，高 威，閻斌倫,2，高 煥,2,3

( 1.江蘇海洋大學(xué)，江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 連云港 222005； 2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005； 3.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京 210014 )

單核苷酸多態(tài)性(SNP)指不同個(gè)體間基因組上同一位點(diǎn)上的單核苷酸序列存在差異，這種多態(tài)性位點(diǎn)具有密度高、遺傳穩(wěn)定、代表性強(qiáng)、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析等優(yōu)點(diǎn)[1]，因此成為第三代分子標(biāo)記的典型代表，在親緣鑒定、分子標(biāo)記、遺傳育種和疾病防控等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[2-3]。線粒體基因組具有母性遺傳的特點(diǎn)，因此其上的分子標(biāo)記，尤其是SNP標(biāo)記，已經(jīng)成為親緣鑒定[4]、遺傳多樣性分析[5]的重要工具。目前該技術(shù)在經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物的研究中應(yīng)用廣泛，如對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)的PmCatL、PmTry以及PmAmy基因進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)了56個(gè)能夠控制生長性狀的SNP位點(diǎn)[6]；Zhang等[7]在合浦絨螯蟹(Eriocheirhepuensis)和中華絨螯蟹(E.sinensis)中找到的能夠穩(wěn)定遺傳的SNP位點(diǎn)，開發(fā)出了DNA條形碼。

SNP的檢測技術(shù)經(jīng)歷過許多的探索和改進(jìn)，從限制性片段長度多態(tài)性法(PCR-RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性法(PCR-SSCP)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)等以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)方法到近年來發(fā)展運(yùn)用的DNA測序法、DNA芯片檢測、變性高效液相色譜法(DHPLC)、高分辨率熔解曲線(HRM)等技術(shù)，對(duì)SNP的檢測越發(fā)注重于自動(dòng)化和高通量[8]。高分辨率熔解曲線技術(shù)可以通過實(shí)時(shí)監(jiān)測不同個(gè)體熔解曲線的形狀和位置上的差異檢測出序列變化，與其他技術(shù)相比，具有低成本、易操作、高通量、高靈敏度等優(yōu)勢，適合用于對(duì)未知SNP位點(diǎn)的篩查和分析。

脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)是我國特有的養(yǎng)殖蝦類，具有繁殖能力強(qiáng)、生長速度快、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，是開展甲殼動(dòng)物生物學(xué)研究的良好生物材料，加之脊尾白蝦具有重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)價(jià)值[9]，很多甲殼類研究者都傾向于將其當(dāng)作海水甲殼類物種研究的模式生物使用[10]，近年來不僅在養(yǎng)殖技術(shù)[11]、養(yǎng)殖模式[12]等方面受到諸多關(guān)注，在遺傳學(xué)研究方面也受到了廣泛的關(guān)注，如利用微衛(wèi)星對(duì)脊尾白蝦野生群體和近交群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析[13-14]。作為一個(gè)潛在的甲殼類研究模式物種，它在很多方面的遺傳信息還有待進(jìn)一步挖掘，如其線粒體基因組中的SNP位點(diǎn)還不清楚，這一定程度上限制了該蝦在家系識(shí)別、遺傳多樣性分析，甚至進(jìn)化生物學(xué)方面的研究。筆者希望通過利用高分辨率熔解曲線技術(shù)對(duì)脊尾白蝦線粒體全基因組(mtDNA)中的SNP位點(diǎn)進(jìn)行篩查，為進(jìn)一步開展該蝦的遺傳育種、家系鑒定等工作提供理論基礎(chǔ)[15-16]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的脊尾白蝦為實(shí)驗(yàn)室分3個(gè)時(shí)間段在連云港沿海地區(qū)(柘汪鎮(zhèn)、海頭鎮(zhèn)和青口鎮(zhèn))的養(yǎng)殖池塘和南通呂四港附近(1次)采集獲得的樣本，每次采集樣本30～100尾，并在每個(gè)批次中選取6～10尾組成本試驗(yàn)的樣本群體，以實(shí)現(xiàn)樣本遺傳背景來源的多樣化。試驗(yàn)前將采集樣本置于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)期間連續(xù)充氣，每日早晚各投餌1次，投餌0.5 h后清污[17]。

1.2 樣品DNA的提取

從30～50尾備選群體中選取健康活躍、大小合適的成年脊尾白蝦30尾(編號(hào)為1～30)，體長(5.23±0.33) cm、體質(zhì)量(0.91±0.19) g。取其新鮮肌肉組織，液氮研磨后用生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)的動(dòng)物基因組DNA快速抽提試劑盒來提取脊尾白蝦總基因組DNA，經(jīng)GeneQuant Pro測定基因組DNA樣品質(zhì)量濃度后，均一化為20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)及篩選優(yōu)化

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中得到的脊尾白蝦線粒體全基因組序列(EF560650.1)，利用Primer Premier 5.0(Premier biosoft international, USA)通過步移法設(shè)計(jì)出覆蓋mtDNA全長的引物，其產(chǎn)物擴(kuò)增長度為100～150 bp[18]。本次試驗(yàn)共設(shè)計(jì)出109對(duì)引物，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，按說明書要求稀釋后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為10 μL：ddH2O 7.0 μL，10×PCR Buffer 1.0 μL，MgCl2(25 mmol/L) 0.6 μL，dNTP(10 μmol/L) 0.2 μL，Taq DNA聚合酶 0.2 μL，上下游引物各0.4 μL，DNA(20 ng/μL)0.2 μL。用Touch-down PCR程序進(jìn)行驗(yàn)證：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，其中退火溫度每循環(huán)降低1 ℃，共15個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物，排除未得到目的條帶的引物。

1.3.2 引物優(yōu)化

為防止引物二聚體對(duì)后續(xù)高分辨率熔解曲線檢測產(chǎn)生影響，對(duì)初篩引物進(jìn)行溫度梯度優(yōu)化，確定其最佳退火溫度。PCR反應(yīng)體系總體積為10 μL(成分比例同1.3.1)，用溫度梯度PCR程序進(jìn)行優(yōu)化：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，梯度退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證并對(duì)比，確定引物的最佳退火溫度。

1.4 高分辨率熔解曲線檢測

對(duì)提取的30尾脊尾白蝦DNA樣品進(jìn)行分組混樣，以10尾為1組，共分為3組混合DNA樣品，編號(hào)分別為H1(1～10)、H2(11～20)、H3(21～30)[19]。本試驗(yàn)首先在混合DNA中進(jìn)行第1次高分辨率熔解曲線檢測，將存在差異峰的引物在對(duì)應(yīng)混合DNA的單個(gè)體樣品DNA中進(jìn)行第2次高分辨率熔解曲線檢測，從而確定存在突變的單個(gè)體DNA樣品。

1.4.1 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系總體積為35 μL：ddH2O 24.5 μL，10×PCR Buffer 3.5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 2.1 μL，dNTP(10 μmol/L) 0.7 μL，Taq DNA聚合酶 0.7 μL，上下游引物各1.4 μL，混合DNA模板(20 ng/μL)0.7 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，相應(yīng)溫度退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.4.2 高低溫內(nèi)標(biāo)合成

高低溫內(nèi)標(biāo)分別為：5′-GCGGTCAGTCGGC CTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGAC GCTCAG-3′、5′-ATCGTGATTTCTATAGTTAT CTAAGTAGTTGGCATTAATTTCATTTT-3′及各自的反向互補(bǔ)序列，且3′端進(jìn)行磷酸化封閉，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成[18]。反應(yīng)體系為：飽和NaCl 1.0 μL，正反引物各1.0 μL，ddH2O 7.0 μL，共10 μL的體系。放入PCR儀，95 ℃反應(yīng)3 min，4 ℃保存。程序結(jié)束后，將高低溫內(nèi)標(biāo)等比混合彈勻備用。

1.4.3 高分辨率熔解曲線檢測

在每管PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入7 μL高低溫內(nèi)標(biāo)混合溶液，混合均勻后放入PCR儀，95 ℃變性3 min，25 ℃復(fù)性2 min，4 ℃保存。吸取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加到96孔板中，每組3個(gè)平行。再加入1 μL LC Green染料及25 μL礦物油，放入微孔板離心機(jī)中短暫離心，利用LightScanner 96系統(tǒng)進(jìn)行檢測，分析所得溶解曲線，判斷同一引物在不同個(gè)體間是否發(fā)生差異，記錄存在差異峰的引物及其對(duì)應(yīng)的個(gè)體數(shù)。

1.4.4 序列測序分析

將高分辨率熔解曲線檢測出的每個(gè)差異峰所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增樣品(3～5個(gè))送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，經(jīng)過對(duì)比分析后統(tǒng)計(jì)脊尾白蝦線粒體基因組中SNP位點(diǎn)的數(shù)目、類型及位置。

2 結(jié) 果

2.1 引物篩選及優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)脊尾白蝦mtDNA序列設(shè)計(jì)出的109對(duì)引物中，有29對(duì)未出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)剩下的80對(duì)引物進(jìn)行溫度梯度PCR優(yōu)化，確定其最佳退火溫度。

根據(jù)最佳退火溫度，將80對(duì)篩選后的引物分別在H1、H2、H3 3組混合DNA樣品中進(jìn)行高分辨率熔解曲線檢測。檢測分析發(fā)現(xiàn)，共有13對(duì)引物在3組混合DNA樣品中出現(xiàn)了不同的熔解曲線和熔解峰。進(jìn)一步將存在差異峰的引物在其對(duì)應(yīng)的混合DNA組中分別進(jìn)行單個(gè)體DNA樣本的擴(kuò)增及高分辨率熔解曲線檢測，分析出現(xiàn)差異的單個(gè)DNA樣品。同一引物擴(kuò)增片段在不同DNA個(gè)體間出現(xiàn)了顯著的差異峰(圖1)，由此可以判斷這一段序列在不同個(gè)體之間存在差異性，可能發(fā)生了堿基突變現(xiàn)象。

2.2 SNP分析

經(jīng)序列比較表明，在上述13對(duì)引物擴(kuò)增序列中有9對(duì)引物的擴(kuò)增序列中含有SNP突變位點(diǎn)(表1)。

圖1 同一引物在不同單個(gè)體(a)和(b)中的熔解曲線Fig.1 The melting curves of the same primer in different individuals (a) and (b) 4和H1為同一引物在混合DNA H1中的4號(hào)單個(gè)體和其他單個(gè)體中檢測出的熔解曲線，曲線的差異說明它們之間存在SNP突變位點(diǎn). 4 and H1 are the melting curves of the same primers detected in the single DNA No. 4 and other single bodies in the mixed DNA H1; the difference in the curves indicates that there are SNP mutation sites between them.

表1 脊尾白蝦線粒體基因組SNP引物

在這9對(duì)引物的擴(kuò)增序列中，共篩查到16個(gè)SNP突變位點(diǎn)，在脊尾白蝦線粒體全基因組上的分布頻率為0.10/100 bp。其中包括14個(gè)轉(zhuǎn)換突變(C/T和G/A)，2個(gè)顛換突變(A/T)，轉(zhuǎn)換和顛換突變形式的比率為87.5%和12.5%。進(jìn)一步將檢測得到的16個(gè)SNP位點(diǎn)與公布的脊尾白蝦mtDNA序列進(jìn)行定位分析，發(fā)現(xiàn)所得SNP位點(diǎn)主要分布在脊尾白蝦mtDNA的COX1、COX2、tRNAAsp、nad1、nad4、nad5、cob 7個(gè)區(qū)域，其中COX1基因區(qū)域的SNP位點(diǎn)數(shù)量最多，共有5個(gè)，占總SNP位點(diǎn)的26.7%，其次為cob的突變位點(diǎn)數(shù)目為3個(gè)，占所得總突變量的20%，在COX2、tRNAAsp及nad1、nad4、nad5等區(qū)域各發(fā)現(xiàn)1～2個(gè)SNP位點(diǎn)(表2)。進(jìn)一步比對(duì)所得SNP位點(diǎn)突變前后對(duì)應(yīng)密碼子所編碼的氨基酸種類變化，統(tǒng)計(jì)SNP位點(diǎn)的突變類型和比例。結(jié)果顯示，16個(gè)SNP位點(diǎn)均位于蛋白基因編碼區(qū)，其中不改變氨基酸種類的同義SNP位點(diǎn)有7個(gè)，占已獲所有SNP位點(diǎn)的43.7%，能夠?qū)е掳被岱N類改變的非同義SNP位點(diǎn)有9個(gè)，占已獲所有SNP位點(diǎn)的56.3%。

表2 脊尾白蝦線粒體基因組SNP位點(diǎn)信息Tab.2 SNP site information of the mitochondrial genome in ridgetail white prawn E. carinicauda

3 討 論

高分辨率熔解曲線技術(shù)是一種簡單、高效的SNP檢測方法，無需使用序列特異性探針，便可高通量檢測SNP、SSR多態(tài)性等多種遺傳變異以及相同序列的甲基化差異[20-21]。本研究基于公布的脊尾白蝦mtDNA序列，利用小片段擴(kuò)增高分辨率熔解曲線檢測技術(shù)對(duì)脊尾白蝦基因組片段進(jìn)行檢測。在設(shè)計(jì)的109對(duì)引物中，篩選出了9對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物中存在堿基突變的引物，進(jìn)一步篩選出了16個(gè)SNP位點(diǎn)，證明了高分辨率熔解曲線技術(shù)是篩選SNP突變位點(diǎn)的有效手段[22-23]。

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫得到的脊尾白蝦線粒體基因組全序列長度為15 730 bp，本研究在引物擴(kuò)增區(qū)域?qū)嶋H檢測出了16個(gè)SNP位點(diǎn)，因此SNP分布頻率為0.10/100 bp。據(jù)已有的報(bào)道，不同物種中的SNP位點(diǎn)分布頻率存在差異，如人類基因組中SNP位點(diǎn)的分布頻率為0.10/100 bp，在江豚(Neophocaenaphocaenoides)中為0.18/100 bp[24]，在甲殼類的三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)中為0.15/100 bp[4]，雖然本研究中脊尾白蝦的SNP位點(diǎn)分布頻率和以上物種的有所差異，但可以視為同一個(gè)水平上的SNP位點(diǎn)分布頻率。本研究中，除了在COX1、COX2、cob、tRNAAsp、nad1、nad4、nad5 7個(gè)區(qū)域中發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)以外，在其他區(qū)域均未篩查出SNP位點(diǎn)。其原因可能在于：一是試驗(yàn)所用脊尾白蝦材料僅來自于連云港和南通兩地，雖然在取樣時(shí)盡量保證了樣本來源的多樣性，但是遺傳背景仍然較為單一；二是脊尾白蝦本身由于繁殖能力強(qiáng)，在同一個(gè)地區(qū)的遺傳多樣性不夠豐富[25]；三是在進(jìn)化上，關(guān)鍵基因位點(diǎn)容錯(cuò)率低，也會(huì)導(dǎo)致很多基因序列區(qū)檢測不到SNP位點(diǎn)。因此，進(jìn)一步擴(kuò)大篩選的樣本量，有望獲得更多在本研究中未被發(fā)現(xiàn)的SNP突變位點(diǎn)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，不同基因區(qū)域的SNP位點(diǎn)數(shù)目存在較大差別，如在COX1區(qū)域共檢測出5個(gè)SNP位點(diǎn)，其次在cob區(qū)域中檢測出3個(gè)SNP位點(diǎn)，而在COX2和nad1區(qū)域分別只檢測出1個(gè)SNP位點(diǎn)。其原因可能與基因組不同部位的保守性與特異性有關(guān)，如三疣梭子蟹線粒體基因組的16S rRNA區(qū)域具有很高的保守性及特異性，與之相比，其cyt b基因的進(jìn)化速率約快4倍，因此在cyt b區(qū)域發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)數(shù)目顯著高于16S rRNA區(qū)域[26]。與同源染色體相比，線粒體基因組中的基因和SNP位點(diǎn)均屬單倍型，尤其是線粒體基因組為母系遺傳，一旦母體中出現(xiàn)新的SNP基因型，則子代個(gè)體均可遺傳這些SNP基因型，因此試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的線粒體基因組SNP位點(diǎn)對(duì)于系譜鑒定具有重要意義。

此外，所得脊尾白蝦線粒體基因組SNP位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)換所占的比例為87.5%，顛換的比例為12.5%，未出現(xiàn)插入、缺失等突變形式。由此可見，轉(zhuǎn)換類型的SNP位點(diǎn)所占比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于顛換類型，符合“transition bias”原理[27]，與劉九美等[28]在脊尾白蝦特定生長相關(guān)基因中得到的SNP位點(diǎn)分型規(guī)律相似。進(jìn)一步對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行定位分析和對(duì)應(yīng)的氨基酸比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所得SNP位點(diǎn)中非同義SNP位點(diǎn)較多，占總個(gè)數(shù)的56.3%，而同義SNP位點(diǎn)占43.7%，說明脊尾白蝦的線粒體基因受到正向選擇，進(jìn)化速度較快。據(jù)已有研究報(bào)道，約20%～30%的非同義SNP位點(diǎn)能夠?qū)е戮幋a蛋白質(zhì)的變化，最終影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)，因此非同義SNP在功能研究中更具意義[29]。另外，篩選出的9個(gè)非同義SNP位點(diǎn)分布于COX1、tRNAAsp、nad1、nad4、nad5、cob這6個(gè)區(qū)域中，其對(duì)于脊尾白蝦相關(guān)性狀的改變值得進(jìn)一步研究，為后續(xù)脊尾白蝦遺傳育種、家系鑒定等工作的展開奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究通過高分辨率熔解曲線技術(shù)對(duì)脊尾白蝦mtDNA上的SNP位點(diǎn)進(jìn)行篩查和分析，得出以下結(jié)論：

(1)本研究共篩選出16個(gè)SNP位點(diǎn)，分布頻率為0.10/100 bp，在脊尾白蝦mtDNA的COX1、cob、COX2、tRNAAsp、nad1、nad4、nad5 7個(gè)區(qū)域均有分布，其中COX1基因區(qū)域的SNP位點(diǎn)最多，其原因可能與mtDNA上不同區(qū)域的發(fā)育速度存在差異有關(guān)。

(2)所得SNP位點(diǎn)中只出現(xiàn)轉(zhuǎn)換和顛換兩種類型，其中87.5%為轉(zhuǎn)換類型，所占比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于顛換類型；且非同義SNP位點(diǎn)較多，占總個(gè)數(shù)的56.3%，最終可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的性質(zhì)發(fā)生改變。

(3)所得線粒體基因組中的SNP位點(diǎn)均屬于單倍型，且具有母系遺傳特征，因此在系譜鑒定中具有重要意義。