朱佶軒，戴 琴，段健誠，高 娜，高 威，閻斌倫,2，高 煥,2,3

( 1.江蘇海洋大學(xué)，江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室， 江蘇 連云港 222005； 2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005； 3.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014 )

單核苷酸多態(tài)性(SNP)指不同個體間基因組上同一位點上的單核苷酸序列存在差異，這種多態(tài)性位點具有密度高、遺傳穩(wěn)定、代表性強、易實現(xiàn)自動化分析等優(yōu)點[1]，因此成為第三代分子標記的典型代表，在親緣鑒定、分子標記、遺傳育種和疾病防控等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[2-3]。線粒體基因組具有母性遺傳的特點，因此其上的分子標記，尤其是SNP標記，已經(jīng)成為親緣鑒定[4]、遺傳多樣性分析[5]的重要工具。目前該技術(shù)在經(jīng)濟甲殼動物的研究中應(yīng)用廣泛，如對斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)的PmCatL、PmTry以及PmAmy基因進行檢測后發(fā)現(xiàn)了56個能夠控制生長性狀的SNP位點[6]；Zhang等[7]在合浦絨螯蟹(Eriocheirhepuensis)和中華絨螯蟹(E.sinensis)中找到的能夠穩(wěn)定遺傳的SNP位點，開發(fā)出了DNA條形碼。

SNP的檢測技術(shù)經(jīng)歷過許多的探索和改進，從限制性片段長度多態(tài)性法(PCR-RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性法(PCR-SSCP)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)等以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)方法到近年來發(fā)展運用的DNA測序法、DNA芯片檢測、變性高效液相色譜法(DHPLC)、高分辨率熔解曲線(HRM)等技術(shù)，對SNP的檢測越發(fā)注重于自動化和高通量[8]。高分辨率熔解曲線技術(shù)可以通過實時監(jiān)測不同個體熔解曲線的形狀和位置上的差異檢測出序列變化，與其他技術(shù)相比，具有低成本、易操作、高通量、高靈敏度等優(yōu)勢，適合用于對未知SNP位點的篩查和分析。

脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)是我國特有的養(yǎng)殖蝦類，具有繁殖能力強、生長速度快、環(huán)境適應(yīng)性強等特點，是開展甲殼動物生物學(xué)研究的良好生物材料，加之脊尾白蝦具有重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟價值[9]，很多甲殼類研究者都傾向于將其當作海水甲殼類物種研究的模式生物使用[10]，近年來不僅在養(yǎng)殖技術(shù)[11]、養(yǎng)殖模式[12]等方面受到諸多關(guān)注，在遺傳學(xué)研究方面也受到了廣泛的關(guān)注，如利用微衛(wèi)星對脊尾白蝦野生群體和近交群體的遺傳多樣性進行分析[13-14]。作為一個潛在的甲殼類研究模式物種，它在很多方面的遺傳信息還有待進一步挖掘，如其線粒體基因組中的SNP位點還不清楚，這一定程度上限制了該蝦在家系識別、遺傳多樣性分析，甚至進化生物學(xué)方面的研究。筆者希望通過利用高分辨率熔解曲線技術(shù)對脊尾白蝦線粒體全基因組(mtDNA)中的SNP位點進行篩查，為進一步開展該蝦的遺傳育種、家系鑒定等工作提供理論基礎(chǔ)[15-16]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的脊尾白蝦為實驗室分3個時間段在連云港沿海地區(qū)(柘汪鎮(zhèn)、海頭鎮(zhèn)和青口鎮(zhèn))的養(yǎng)殖池塘和南通呂四港附近(1次)采集獲得的樣本，每次采集樣本30～100尾，并在每個批次中選取6～10尾組成本試驗的樣本群體，以實現(xiàn)樣本遺傳背景來源的多樣化。試驗前將采集樣本置于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)期間連續(xù)充氣，每日早晚各投餌1次，投餌0.5 h后清污[17]。

1.2 樣品DNA的提取

從30～50尾備選群體中選取健康活躍、大小合適的成年脊尾白蝦30尾(編號為1～30)，體長(5.23±0.33) cm、體質(zhì)量(0.91±0.19) g。取其新鮮肌肉組織，液氮研磨后用生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)的動物基因組DNA快速抽提試劑盒來提取脊尾白蝦總基因組DNA，經(jīng)GeneQuant Pro測定基因組DNA樣品質(zhì)量濃度后，均一化為20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計及篩選優(yōu)化

1.3.1 引物的設(shè)計與驗證

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中得到的脊尾白蝦線粒體全基因組序列(EF560650.1)，利用Primer Premier 5.0(Premier biosoft international, USA)通過步移法設(shè)計出覆蓋mtDNA全長的引物，其產(chǎn)物擴增長度為100～150 bp[18]。本次試驗共設(shè)計出109對引物，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，按說明書要求稀釋后進行PCR擴增，反應(yīng)體系總體積為10 μL：ddH2O 7.0 μL，10×PCR Buffer 1.0 μL，MgCl2(25 mmol/L) 0.6 μL，dNTP(10 μmol/L) 0.2 μL，Taq DNA聚合酶 0.2 μL，上下游引物各0.4 μL，DNA(20 ng/μL)0.2 μL。用Touch-down PCR程序進行驗證：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，其中退火溫度每循環(huán)降低1 ℃，共15個循環(huán)；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增產(chǎn)物，排除未得到目的條帶的引物。

1.3.2 引物優(yōu)化

為防止引物二聚體對后續(xù)高分辨率熔解曲線檢測產(chǎn)生影響，對初篩引物進行溫度梯度優(yōu)化，確定其最佳退火溫度。PCR反應(yīng)體系總體積為10 μL(成分比例同1.3.1)，用溫度梯度PCR程序進行優(yōu)化：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，梯度退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行驗證并對比，確定引物的最佳退火溫度。

1.4 高分辨率熔解曲線檢測

對提取的30尾脊尾白蝦DNA樣品進行分組混樣，以10尾為1組，共分為3組混合DNA樣品，編號分別為H1(1～10)、H2(11～20)、H3(21～30)[19]。本試驗首先在混合DNA中進行第1次高分辨率熔解曲線檢測，將存在差異峰的引物在對應(yīng)混合DNA的單個體樣品DNA中進行第2次高分辨率熔解曲線檢測，從而確定存在突變的單個體DNA樣品。

1.4.1 PCR擴增

PCR反應(yīng)體系總體積為35 μL：ddH2O 24.5 μL，10×PCR Buffer 3.5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 2.1 μL，dNTP(10 μmol/L) 0.7 μL，Taq DNA聚合酶 0.7 μL，上下游引物各1.4 μL，混合DNA模板(20 ng/μL)0.7 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，相應(yīng)溫度退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.4.2 高低溫內(nèi)標合成

高低溫內(nèi)標分別為：5′-GCGGTCAGTCGGC CTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGAC GCTCAG-3′、5′-ATCGTGATTTCTATAGTTAT CTAAGTAGTTGGCATTAATTTCATTTT-3′及各自的反向互補序列，且3′端進行磷酸化封閉，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成[18]。反應(yīng)體系為：飽和NaCl 1.0 μL，正反引物各1.0 μL，ddH2O 7.0 μL，共10 μL的體系。放入PCR儀，95 ℃反應(yīng)3 min，4 ℃保存。程序結(jié)束后，將高低溫內(nèi)標等比混合彈勻備用。

1.4.3 高分辨率熔解曲線檢測

在每管PCR擴增產(chǎn)物中加入7 μL高低溫內(nèi)標混合溶液，混合均勻后放入PCR儀，95 ℃變性3 min，25 ℃復(fù)性2 min，4 ℃保存。吸取10 μL PCR擴增產(chǎn)物加到96孔板中，每組3個平行。再加入1 μL LC Green染料及25 μL礦物油，放入微孔板離心機中短暫離心，利用LightScanner 96系統(tǒng)進行檢測，分析所得溶解曲線，判斷同一引物在不同個體間是否發(fā)生差異，記錄存在差異峰的引物及其對應(yīng)的個體數(shù)。

1.4.4 序列測序分析

將高分辨率熔解曲線檢測出的每個差異峰所對應(yīng)的擴增樣品(3～5個)送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，經(jīng)過對比分析后統(tǒng)計脊尾白蝦線粒體基因組中SNP位點的數(shù)目、類型及位置。

2 結(jié) 果

2.1 引物篩選及優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)脊尾白蝦mtDNA序列設(shè)計出的109對引物中，有29對未出現(xiàn)擴增產(chǎn)物，對剩下的80對引物進行溫度梯度PCR優(yōu)化，確定其最佳退火溫度。

根據(jù)最佳退火溫度，將80對篩選后的引物分別在H1、H2、H3 3組混合DNA樣品中進行高分辨率熔解曲線檢測。檢測分析發(fā)現(xiàn)，共有13對引物在3組混合DNA樣品中出現(xiàn)了不同的熔解曲線和熔解峰。進一步將存在差異峰的引物在其對應(yīng)的混合DNA組中分別進行單個體DNA樣本的擴增及高分辨率熔解曲線檢測，分析出現(xiàn)差異的單個DNA樣品。同一引物擴增片段在不同DNA個體間出現(xiàn)了顯著的差異峰(圖1)，由此可以判斷這一段序列在不同個體之間存在差異性，可能發(fā)生了堿基突變現(xiàn)象。

2.2 SNP分析

經(jīng)序列比較表明，在上述13對引物擴增序列中有9對引物的擴增序列中含有SNP突變位點(表1)。

圖1 同一引物在不同單個體(a)和(b)中的熔解曲線Fig.1 The melting curves of the same primer in different individuals (a) and (b) 4和H1為同一引物在混合DNA H1中的4號單個體和其他單個體中檢測出的熔解曲線，曲線的差異說明它們之間存在SNP突變位點. 4 and H1 are the melting curves of the same primers detected in the single DNA No. 4 and other single bodies in the mixed DNA H1; the difference in the curves indicates that there are SNP mutation sites between them.

表1 脊尾白蝦線粒體基因組SNP引物

在這9對引物的擴增序列中，共篩查到16個SNP突變位點，在脊尾白蝦線粒體全基因組上的分布頻率為0.10/100 bp。其中包括14個轉(zhuǎn)換突變(C/T和G/A)，2個顛換突變(A/T)，轉(zhuǎn)換和顛換突變形式的比率為87.5%和12.5%。進一步將檢測得到的16個SNP位點與公布的脊尾白蝦mtDNA序列進行定位分析，發(fā)現(xiàn)所得SNP位點主要分布在脊尾白蝦mtDNA的COX1、COX2、tRNAAsp、nad1、nad4、nad5、cob 7個區(qū)域，其中COX1基因區(qū)域的SNP位點數(shù)量最多，共有5個，占總SNP位點的26.7%，其次為cob的突變位點數(shù)目為3個，占所得總突變量的20%，在COX2、tRNAAsp及nad1、nad4、nad5等區(qū)域各發(fā)現(xiàn)1～2個SNP位點(表2)。進一步比對所得SNP位點突變前后對應(yīng)密碼子所編碼的氨基酸種類變化，統(tǒng)計SNP位點的突變類型和比例。結(jié)果顯示，16個SNP位點均位于蛋白基因編碼區(qū)，其中不改變氨基酸種類的同義SNP位點有7個，占已獲所有SNP位點的43.7%，能夠?qū)е掳被岱N類改變的非同義SNP位點有9個，占已獲所有SNP位點的56.3%。

表2 脊尾白蝦線粒體基因組SNP位點信息Tab.2 SNP site information of the mitochondrial genome in ridgetail white prawn E. carinicauda

3 討 論

高分辨率熔解曲線技術(shù)是一種簡單、高效的SNP檢測方法，無需使用序列特異性探針，便可高通量檢測SNP、SSR多態(tài)性等多種遺傳變異以及相同序列的甲基化差異[20-21]。本研究基于公布的脊尾白蝦mtDNA序列，利用小片段擴增高分辨率熔解曲線檢測技術(shù)對脊尾白蝦基因組片段進行檢測。在設(shè)計的109對引物中，篩選出了9對擴增產(chǎn)物中存在堿基突變的引物，進一步篩選出了16個SNP位點，證明了高分辨率熔解曲線技術(shù)是篩選SNP突變位點的有效手段[22-23]。

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫得到的脊尾白蝦線粒體基因組全序列長度為15 730 bp，本研究在引物擴增區(qū)域?qū)嶋H檢測出了16個SNP位點，因此SNP分布頻率為0.10/100 bp。據(jù)已有的報道，不同物種中的SNP位點分布頻率存在差異，如人類基因組中SNP位點的分布頻率為0.10/100 bp，在江豚(Neophocaenaphocaenoides)中為0.18/100 bp[24]，在甲殼類的三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)中為0.15/100 bp[4]，雖然本研究中脊尾白蝦的SNP位點分布頻率和以上物種的有所差異，但可以視為同一個水平上的SNP位點分布頻率。本研究中，除了在COX1、COX2、cob、tRNAAsp、nad1、nad4、nad5 7個區(qū)域中發(fā)現(xiàn)SNP位點以外，在其他區(qū)域均未篩查出SNP位點。其原因可能在于：一是試驗所用脊尾白蝦材料僅來自于連云港和南通兩地，雖然在取樣時盡量保證了樣本來源的多樣性，但是遺傳背景仍然較為單一；二是脊尾白蝦本身由于繁殖能力強，在同一個地區(qū)的遺傳多樣性不夠豐富[25]；三是在進化上，關(guān)鍵基因位點容錯率低，也會導(dǎo)致很多基因序列區(qū)檢測不到SNP位點。因此，進一步擴大篩選的樣本量，有望獲得更多在本研究中未被發(fā)現(xiàn)的SNP突變位點。同時，研究發(fā)現(xiàn)，不同基因區(qū)域的SNP位點數(shù)目存在較大差別，如在COX1區(qū)域共檢測出5個SNP位點，其次在cob區(qū)域中檢測出3個SNP位點，而在COX2和nad1區(qū)域分別只檢測出1個SNP位點。其原因可能與基因組不同部位的保守性與特異性有關(guān)，如三疣梭子蟹線粒體基因組的16S rRNA區(qū)域具有很高的保守性及特異性，與之相比，其cyt b基因的進化速率約快4倍，因此在cyt b區(qū)域發(fā)現(xiàn)的SNP位點數(shù)目顯著高于16S rRNA區(qū)域[26]。與同源染色體相比，線粒體基因組中的基因和SNP位點均屬單倍型，尤其是線粒體基因組為母系遺傳，一旦母體中出現(xiàn)新的SNP基因型，則子代個體均可遺傳這些SNP基因型，因此試驗發(fā)現(xiàn)的線粒體基因組SNP位點對于系譜鑒定具有重要意義。

此外，所得脊尾白蝦線粒體基因組SNP位點中，轉(zhuǎn)換所占的比例為87.5%，顛換的比例為12.5%，未出現(xiàn)插入、缺失等突變形式。由此可見，轉(zhuǎn)換類型的SNP位點所占比例遠遠大于顛換類型，符合“transition bias”原理[27]，與劉九美等[28]在脊尾白蝦特定生長相關(guān)基因中得到的SNP位點分型規(guī)律相似。進一步對SNP位點進行定位分析和對應(yīng)的氨基酸比對，發(fā)現(xiàn)所得SNP位點中非同義SNP位點較多，占總個數(shù)的56.3%，而同義SNP位點占43.7%，說明脊尾白蝦的線粒體基因受到正向選擇，進化速度較快。據(jù)已有研究報道，約20%～30%的非同義SNP位點能夠?qū)е戮幋a蛋白質(zhì)的變化，最終影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)，因此非同義SNP在功能研究中更具意義[29]。另外，篩選出的9個非同義SNP位點分布于COX1、tRNAAsp、nad1、nad4、nad5、cob這6個區(qū)域中，其對于脊尾白蝦相關(guān)性狀的改變值得進一步研究，為后續(xù)脊尾白蝦遺傳育種、家系鑒定等工作的展開奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究通過高分辨率熔解曲線技術(shù)對脊尾白蝦mtDNA上的SNP位點進行篩查和分析，得出以下結(jié)論：

(1)本研究共篩選出16個SNP位點，分布頻率為0.10/100 bp，在脊尾白蝦mtDNA的COX1、cob、COX2、tRNAAsp、nad1、nad4、nad5 7個區(qū)域均有分布，其中COX1基因區(qū)域的SNP位點最多，其原因可能與mtDNA上不同區(qū)域的發(fā)育速度存在差異有關(guān)。

(2)所得SNP位點中只出現(xiàn)轉(zhuǎn)換和顛換兩種類型，其中87.5%為轉(zhuǎn)換類型，所占比例遠遠大于顛換類型；且非同義SNP位點較多，占總個數(shù)的56.3%，最終可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的性質(zhì)發(fā)生改變。

(3)所得線粒體基因組中的SNP位點均屬于單倍型，且具有母系遺傳特征，因此在系譜鑒定中具有重要意義。