楊小佩，王 犖，徐翰晨，丁 君，常亞青，郝振林

( 大連海洋大學，農業(yè)農村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

仿刺參(Apostichopusjaponicus)由于具有豐富的營養(yǎng)和藥用價值，深受消費者青睞，是我國北方主要的海水養(yǎng)殖品種之一[1]。近年來，我國仿刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，池塘養(yǎng)殖已然成為仿刺參增養(yǎng)殖的重要模式[2-3]。養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)是一種復雜的水域生態(tài)系統(tǒng)，微生物群落的結構和功能在養(yǎng)殖環(huán)境中扮演著重要的角色，對維持水域生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定、水質調控、疾病防控等方面均具有重要的作用[4-6]。因此，保持水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)微生態(tài)平衡，對于防治養(yǎng)殖環(huán)境惡化及促進養(yǎng)殖生物健康生長尤為關鍵[7-8]。

水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘微生物群落具有系統(tǒng)特異性，而當前關于養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)微生物群落地域差異性相關方面的研究工作仍然相對匱乏。已有的研究表明，內部因子和外部因子是主導養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)微生物群落結構和功能的兩大因素[9-10]。內部因子主要是指食物網(wǎng)中各物種之間的相互作用；外部因子主要是指養(yǎng)殖環(huán)境的理化因子，如營養(yǎng)鹽、溫度、鹽度等[11]。其中，外部理化因子是影響水域生態(tài)系統(tǒng)菌群結構的重要因素，季節(jié)的變動、營養(yǎng)物質的輸入等變化均可造成養(yǎng)殖環(huán)境菌群種類和豐度的改變，進而影響?zhàn)B殖生物的生長及健康[12-13]。

為解析仿刺參養(yǎng)殖池塘水體微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，筆者以中國北方典型岸基半開放仿刺參養(yǎng)殖池塘為研究對象，利用高通量測序技術，揭示不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群地域性差異和共性，并初步探討水體菌群與其生境環(huán)境因子間的相互關系，進一步查明影響水體菌群結構的主導環(huán)境因子，以期為仿刺參養(yǎng)殖池塘的精準化管理和綠色健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取長海、營口、樂亭和乳山作為北方典型岸基半開放仿刺參養(yǎng)殖池塘(圖1)，池塘水深2～3 m，水域面積約0.1 km2，底質均為泥質，水源來自于近海海域，利用潮汐帶來的潮差進水和排水。選取的仿刺參養(yǎng)殖池塘僅養(yǎng)殖仿刺參單一品種，全年不投喂飼料及益生菌，保證仿刺參自然生長。

每個仿刺參養(yǎng)殖池塘均設置4個采樣點，利用有機玻璃采水器，于2018年8月采集上層(離水面30 cm處)和下層(離池底30 cm處)水樣各5 L，混勻。一部分水樣經(jīng)0.45 μm濾膜抽濾，用于水質指標檢測；另一部分經(jīng)0.22 μm醋酸纖維素濾膜抽濾后放置于無菌離心管中液氮保存，用于細菌總DNA的提取。不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體各項水質指標和細菌群落高通量測序樣品，均設置3個平行。

圖1 采樣點示意Fig.1 Sampling locations

1.2 環(huán)境因子測定

采用HACH(HQd)水質分析儀器(美國HACH公司)，現(xiàn)場測定溫度、鹽度、溶解氧、氧化還原電位(ORP)和pH。其他理化水質參數(shù)測定方法按照GB 17378—2007《海洋監(jiān)測規(guī)范》進行。

1.3 DNA提取

選用OMEGA Soil DNA試劑盒提取仿刺參養(yǎng)殖池塘水體樣品總DNA，為確保DNA無降解、無污染，DNA樣品質量濃度要求≥50 ng/μL，純度要求260 nm吸光度/280 nm吸光度(D260/D280)=1.8～2.0。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，條帶清晰完整無拖尾，質量合格。

1.4 PCR擴增與測序

細菌16S rRNA基因V3～V4片段的擴增引物為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)，應用Illumina MiSeq測序平臺完成序列測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

測序數(shù)據(jù)進行預處理生成優(yōu)質序列后，在97%相似水平下，采用Vsearch軟件進行運算分類單元(OTU)聚類得到運算分類單元。使用QIIME軟件包挑選出各運算分類單元的代表序列，并將所有代表序列與SILVA數(shù)據(jù)庫比對進行物種注釋，保留置信區(qū)間大于0.7的注釋結果。使用R軟件進行細菌多樣性及聚類分析。基于Bray-Crutis算法構建樣品菌群結構圖。選用SPSS 19.0軟件中單因素方差分析進行多樣本顯著性差異分析(α=0.05)。

2 結 果

2.1 高通量測序結果

4個地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘12個水體樣品共測得原始序列558 090條，過濾掉低質量和短長度序列，去除嵌合體序列后，共獲得有效序列444 373條，聚類于14 544個運算分類單元。長海、營口、樂亭和乳山地區(qū)水體樣品中運算分類單元數(shù)目分別為1045±78、1351±453、1239±400和1213±132。組間平均測序覆蓋率均為97.83%～98.45%，能夠真實反映樣本菌群組成情況。

2.2 菌群α多樣性分析

不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群α多樣性指數(shù)表明，營口和乳山地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群豐富度(以ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)衡量)顯著(P<0.05)高于樂亭和長海，長海仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群豐富度最低；營口地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群多樣性(以Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)衡量)顯著高于其他3個地區(qū)(P<0.05)(表1)。

表1 水體菌群α多樣性指數(shù)Tab.1 Alpha diversity index of bacterial community in the water of sea cucumber culture ponds

2.3 優(yōu)勢菌群結構特征分析

不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群結構特征見圖2。根據(jù)物種注釋結果，4個地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體的細菌群落共有33門、50綱、75目、159科、532屬。在門水平上，不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體優(yōu)勢菌群主要隸屬于變形菌門和擬桿菌門，二者相對豐度占比68.64%～89.34%。其中，變形菌門作為水體第一優(yōu)勢菌門，相對豐度占比51.10%～71.98%。不同地區(qū)水體次優(yōu)勢菌門存在顯著性差異，長海、乳山和樂亭次優(yōu)勢菌門均為擬桿菌門，相對豐度占比分別為26.46%、23.01%和17.35%；營口次優(yōu)勢菌門為放線菌門，相對豐度為18.54%。長海、乳山和樂亭第三優(yōu)勢菌門均為放線菌門，相對豐度占比分別為11.15%、8.98%和8.04%，營口的第三優(yōu)勢菌門為擬桿菌門，相對豐度為17.57%。

在屬水平上，玫瑰變色菌屬(Roseovarius)、Kiloniella、遠洋桿菌屬(CandidatusPelagibacter)、棕囊藻桿菌屬(Phaeocystidibacter)為不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體的優(yōu)勢菌屬，其次為假單胞菌屬(Pseudomonas)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)和Pseudohongiella。其中，長海、乳山和樂亭地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體第一優(yōu)勢菌群均隸屬于玫瑰變色菌屬，相對豐度占比分別為18.68%、

圖2 不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群結構特征Fig.2 Characteristics of bacterial community in the water of sea cucumber culture ponds in different areas

24.46%和24.65%。然而，營口地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體第一優(yōu)勢菌群則隸屬于Kiloniella，相對豐度占比為23.07%。樂亭和乳山地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體次優(yōu)勢菌群均隸屬于遠洋桿菌屬，相對豐度占比分別為11.57%和13.80%；長海和營口地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體次優(yōu)勢菌屬分別為Planktomarina和玫瑰變色菌屬，相對豐度占比分別為12.88%和6.36%。

2.4 差異菌群結構特征分析

利用Weighted Unifrac距離矩陣，對不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群結構相似性進行聚類分析(圖3)。其中，樂亭與乳山水體菌群結構相似度最高首先聚為一類，其次與長海聚為一類，營口地區(qū)則單獨聚為一類。研究表明，夏季不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群結構具有地域性差異，營口水體菌群結構顯著有別于其他3個地區(qū)。

圖3 不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群聚類分析Fig.3 Cluster analysis of bacterial community in the water of sea cucumber culture ponds in different areas

為進一步探究營口地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群結構的地域性差異，在空間維度上對不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群進行線性判別LEfSe分析，以查明不同地區(qū)所對應的顯著性特異菌群(P<0.05)。基于LDA判別值大于3.5的判定標準，共有不同分類水平的68個細菌類群在4個地區(qū)之間存在顯著性差異(圖4)。長海、樂亭和乳山3個地區(qū)顯著性優(yōu)勢菌群相對集中于變形菌門和擬桿菌門。營口地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體差異菌群則主要隸屬于放線菌門和浮霉菌門。其中，放線菌門以酸微菌(Ilumatobacter)、尤澤比氏菌(Euzebya)和腈基降解菌(Nitriliruptor)為代表。浮霉菌門以浮霉菌科為代表。

圖4 不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群LEfSe分析Fig.4 LEfSe analysis of bacterial community in the water of sea cucumber culture ponds in different areas

2.5 環(huán)境因子監(jiān)測

根據(jù)GB 3097—1997《中華人民共和國海水水質標準》，所監(jiān)測的長海、營口、樂亭和乳山4個地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘夏季水體環(huán)境因子各項水質指標，均達國家海水二類水質標準。不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體pH 7.96～8.23，呈弱堿性；水溫23.88～26.23 ℃；鹽度27.30～28.60；溶解氧為7.19～8.22 mg/L。同時，水體理化指標呈現(xiàn)出顯著地域性差異。其中，營口地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體總磷、化學需氧量和有機碳含量顯著高于其他地區(qū)。

表2 水體環(huán)境因子監(jiān)測Tab.2 Environmental factors in water samples

2.6 細菌群落影響因素

冗余分析(RDA)常用于解析細菌群落與其生境環(huán)境因子間的相互關系。門水平下，不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群相對豐度與環(huán)境因子冗余分析結果見圖5。蒙特卡羅排序檢驗顯示，總有機碳、化學需氧量、磷酸鹽、總磷、溫度與水體菌群間存在顯著的相關性(P<0.05)，影響水體菌群的主導環(huán)境因子為總有機碳和化學需氧量，其次為磷酸鹽、總磷和溫度。其中，總有機碳、化學需氧量和磷酸鹽與營口仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群相對豐度呈現(xiàn)出正相關性，與長海、樂亭和乳山水體菌群相對豐度呈現(xiàn)出負相關。氨氮和硝態(tài)氮與長海、樂亭和乳山水體菌群之間的影響作用呈正相關，與營口呈負相關。

圖5 菌群與環(huán)境因子RDA分析Fig.5 RDA analysis between bacterial communities and environmental factors

水體優(yōu)勢菌群與主導環(huán)境因子間的相關性分析結果見表3。根據(jù)相關性系數(shù)的大小，確定各種菌群與環(huán)境因子的相關性水平。本試驗中，水體放線菌門與總磷含量呈極顯著正相關(P<0.01)，表明放線菌門受水中總磷影響較為顯著。浮霉菌門和Kiloniella與有機物含量呈極顯著正相關(P<0.01)，相關系數(shù)高于0.910，表明浮霉菌門和Kiloniella受有機物含量影響極顯著。玫瑰變色菌屬(Roseovarius)與總有機碳含量和化學需氧量呈極顯著負相關(P<0.01)，相關系數(shù)分別為-0.818、-0.801，表明玫瑰變色菌屬與總有機碳含量和化學需氧量具有極強的相關性。此外，變形菌門和擬桿菌門與主導環(huán)境因子間無顯著相關性。

表3 水體優(yōu)勢菌群與主導環(huán)境因子相關性分析Tab.3 Correlation analysis between dominant bacterial communities and environmental factors in water

3 討 論

3.1 不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群多樣性

微生物是池塘養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其數(shù)量眾多且種類豐富，在物質循環(huán)和轉化過程中發(fā)揮著重要作用，對于維持養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)微生態(tài)平衡及促進養(yǎng)殖生物健康生長具有重要的作用[14]。水體菌群物種豐度和多樣性受環(huán)境因子的共同調控[15-17]。其中，溫度是影響菌群多樣性和豐富度的重要因素[18-19]。已有研究表明，高溫通過加速細菌體內酶活性，控制其增殖代謝速率，使微生物迅速繁殖，多樣性增加[20]。此外，有機物含量與菌群多樣性具有顯著的相關性[21]，水體添加有機物質后，菌群多樣性明顯增加[22]。同時，有機物質的分解過程也加速了營養(yǎng)鹽的流動，為細菌生長創(chuàng)造適宜的條件，使菌群結構更加穩(wěn)定[23]。營口地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群多樣性顯著高于其他3個地區(qū)(P<0.05)，這主要是因為夏季營口地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體溫度和有機質含量相對較高，為微生物的繁殖棲息提供有利的條件，因此導致該地區(qū)水體菌群多樣性高于其他地區(qū)。

3.2 不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群特征

本試驗中，不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體夏季優(yōu)勢菌群均隸屬于變形菌門和擬桿菌門，二者相對豐度占比超過68.64%，與已報道的仿刺參養(yǎng)殖池塘水體優(yōu)勢菌群相似[24-26]。其中，變形菌門作為第一優(yōu)勢菌門(相對豐度占比高達51.10%以上)，主要是因為其在原核生物分子生物學分類或表型分類中占據(jù)了絕對的優(yōu)勢[27]。而擬桿菌門作為次優(yōu)勢菌門，是海洋浮游細菌的重要組成部分，其門下的黃桿菌綱和鞘脂桿菌綱與水中蛋白質代謝、氨基酸代謝及脂肪代謝等生物學過程有關，仿刺參養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的殘餌及糞便等有機質的分解，造成擬桿菌門含量增多，使其成為仿刺參養(yǎng)殖池塘水體次優(yōu)勢菌門[28]。在屬水平上，不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體夏季優(yōu)勢菌屬主要為玫瑰變色菌屬、遠洋桿菌屬、Kiloniella和棕囊藻桿菌屬。

種群遺傳學和群落生態(tài)學研究者發(fā)現(xiàn)，由于隨機分布或環(huán)境選擇，不同地區(qū)環(huán)境中均包含有一些獨特的細菌種群，環(huán)境微生物的分布存在顯著地域性差異[29]。本試驗結果顯示，不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群結構存在顯著地域性差異(P<0.05)。其中，長海、樂亭和乳山仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群相對豐度聚為一類，營口仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群聚為一類。LEfSe分析表明，營口地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體差異菌門主要為放線菌門和浮霉菌門。微生物群落組成對環(huán)境差異有著較強的敏感性，菌群結構與其環(huán)境因素密切相關，不同形態(tài)營養(yǎng)元素含量、水體理化指標等因子的改變均會導致水體細菌群落結構及功能發(fā)生變化[30-34]。放線菌門與磷含量密切相關，水體中總磷含量的增加會促進放線菌的生長繁殖[35-36]。浮霉菌門主要為氨氧化細菌、厭氧氨氧化細菌和異養(yǎng)細菌，部分浮霉菌門微生物不僅能耐受高質量濃度有機碳，其代謝過程也高度依賴環(huán)境中有機物含量，相對豐度隨總有機碳質量濃度和化學需氧量升高而增加[37-43]。營口地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體差異菌門特征與其水中較高的磷和有機質含量呈現(xiàn)出一致性。

屬水平上，營口地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群豐富度代表性菌屬為Kiloniella，其相對豐度與有機物(總有機碳和化學需氧量)呈極顯著正相關(P<0.01)。Kiloniella包含多種酶，如色氨酸脫氨酶、堿性磷酸酶、亮氨酸芳酰胺酶及胰蛋白酶等[29]，可以水解DNA，同時具有利用有機物中碳源的特性[44-45]。營口地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體中豐富的總有機碳和較高的化學需氧量，為Kiloniella的生長提供了有利條件，是其成為營口地區(qū)水體第一優(yōu)勢菌屬的主要原因。此外，Kiloniella具有生物修復潛力，利用硝態(tài)氮或亞硝態(tài)氮作為末端電子受體進行反硝化作用，可以有效去除水中亞硝態(tài)氮污染物含量[46]。Kiloniella作為仿刺參養(yǎng)殖池塘水體中的優(yōu)勢菌屬，可以在一定程度上為仿刺參健康生長提供優(yōu)良的生態(tài)環(huán)境。此外，長海、樂亭和乳山地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體第一優(yōu)勢菌屬為玫瑰變色菌屬，其相對豐度與有機物含量呈極顯著負相關(P<0.01)。玫瑰變色菌屬作為有氧產(chǎn)氧的光合細菌，在暗光、少碳限制條件下，其競爭能力超過化學趨化菌，成為最具代謝活性的細菌[47-49]。水體中有機物(總有機碳和化學需氧量)含量越低，玫瑰變色菌屬新陳代謝活性越強、競爭能力越大，相對豐度占比越高[50-51]。長海、樂亭和乳山地區(qū)水體中有機質含量較低，為玫瑰變色菌屬細菌的繁殖提供了有利的條件。由此可見，不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘差異菌群相對豐度特征與其主導環(huán)境因子地域性差異相吻合。

3.3 不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體差異菌群及其影響因素

微生物菌群特征是其生境環(huán)境因子的反映，與環(huán)境理化性質密切相關且相互限制影響[52]。蒙特卡羅排序檢驗和冗余分析結果顯示，不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群與其生境環(huán)境因子之間存在顯著性相關，影響水體菌群的主導環(huán)境因子為總有機碳和化學需氧量，其次為磷酸鹽、總磷和溫度，且所有主導環(huán)境因子均呈現(xiàn)出顯著地域性差異。值得重視的是，主導環(huán)境因子總有機碳和化學需氧量均是反映水體環(huán)境有機物含量的評價指標。有機物不僅能為微生物提供碳源和能量，還能提供其生長繁殖所需的氮、磷、硫、鐵等營養(yǎng)元素，水中有機質含量能夠直接影響細菌的生物量和組成，進而對細菌群落結構的塑造起重要作用，是影響菌群結構變化的重要因素[53-54]。如擬桿菌門的某些細菌能夠利用N-乙酰基-D-葡萄糖胺、浮游植物產(chǎn)生的高分子質量的溶解態(tài)有機碳[55]；交替單胞菌目細菌能夠利用N-乙?；?D-葡萄糖胺，降解芳香族化合物，進行甲基營養(yǎng)代謝[56]；玫瑰桿菌(Roseobacter)類群可以利用二甲基巰丙酸內鹽、有機酸及浮游植物來源的碳水化合物[57]。另外，磷和溫度也可以通過促進或抑制菌群生長繁殖而對仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群產(chǎn)生一定的影響[58]。

4 結 論

本試驗結果表明，不同地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池塘水體菌群呈現(xiàn)出顯著的地域性差異，化學需氧量和總有機碳是影響水體菌群結構的主導環(huán)境因子。因本試驗僅局限于夏季特定時間點，未能揭示仿刺參池塘養(yǎng)殖水體環(huán)境微生物群落的季節(jié)演替特征。后續(xù)需進一步針對不同季節(jié)不同地域開展大尺度的仿刺參養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)微生物群落動態(tài)變化，以期為仿刺參養(yǎng)殖池塘管理提供精準的科學指導。